专利名称：使用双重聚合酶链式反应对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法
技术领域：
本发明涉及结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria)的检测。更具体而言,本发明涉及能够对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特异性核苷酸序列进行检测的引物组、包含所述引物组的用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒、以及使用所述引物组对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌同时进行检测的方法。
背景技术：
非结核分枝杆菌广泛分布于环境中，尤其是分布于湿土、沼泽地和河流中，并且在发现其机会致病特征(opportunistic character)前认为其是非致病菌。在20世纪80年代，发现非结核分枝杆菌为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者中的肺病的机会致病菌。另夕卜，还已知所述细菌导致其他患者中的疾病。随着对非结核分枝杆菌致病机制的报道，已逐渐认识到其临床意义。近年来，在结核病患病率低的美国和许多欧洲国家可见由非结核分枝杆菌引起的感染发病率的增高。韩国在结核病患病率方面已有所降低，但是在非结核分枝杆菌感染数方面相对增高。多亏韩国于2009年对进行结核病菌液体培养给予医疗保险的政策，设计用来进行液体培养的实验室数目增多。比起固体培养，更常用液体培养来对非结核分枝杆菌进行检测。报道显示，当通过液体培养进行测定时，在约12%的痰涂片阳性结核病病例中检测到了非结核分枝杆菌，而分离自痰中的非结核分枝杆菌占日本、香港和韩国的肺病病例的约10 20%，占美国、加拿大和西欧的肺病病例的约40 50%。由非结核分枝杆菌引起的肺病类似于结核病，发展缓慢，容于被误诊。然而，由于有效抑制结核分枝杆菌的药物不同于有效抑制非结核分枝杆菌的药物，因此需要快速且准确地分辨结核杆菌(tubercle bacilli)和非结核分枝杆菌，以便可以选择合适的药物。当前所使用的检测试剂并不仅是非结核分枝杆菌所固有的，而且还利用了结核分枝杆菌的核苷酸序列。传统试剂在检测和诊断的准确度方面有问题。例如，当仅存在一定浓度的结核分枝杆菌时，所述试剂不对用于检测结核分枝杆菌的引物起反应，而是仅对用于非结核分枝杆菌的引物起反应，以致错误地将非结核分枝杆菌鉴定为结核杆菌。另一方面，当非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌同时存在时，只有非结核分枝杆菌可通过传统试剂加以检测。因此，需要能够识别在结核分枝杆菌中缺失、但在非结核分枝杆菌中固有的核苷酸序列的引物组，以及使用所述引物组快速且准确地分别对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供对结核分枝杆菌所独有的IS6110或16S rRNA基因具有特异性的引物组，以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，二者分别适用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行准确检测和诊断。本发明的另一目的是提供用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含对结核分枝杆菌所独有的IS6110或16S rRNA基因具有特异性的引物组以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，二者分别适用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行准确检测和诊断。本发明的另一目的是提供使用双重聚合酶链式反应、基于所述引物组对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行准确检测和诊断的方法。技术方案根据本发明的一个方面，本发明提供了对非结核分枝杆菌的16SrRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ IDNO:3的核苷酸序列的正向引物；选自于由SEQ ID N0:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物；以及具有SEQ IDNO:7的核苷酸序列的反向引物。根据本发明的另一方面，本发明提供了对结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO: 10的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的反向引物。
根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ IDNO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID N0:7的核苷酸序列的反向引物。根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含对结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO: 10的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDNO: 11的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQID N0:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID N0:7的核苷酸序列的反向引物。根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含由测试对象中分离DNA ;通过双重PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组(包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物)和对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组(包含如下引物具有SEQ IDN0:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID N0:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID N0:7的核苷酸序列的反向引物);以及对所述双重PCR的产物进行分析。根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含由测试对象中分离DNA ;通过双重PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增对结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组(包含如下引物具有SEQ ID NO: 10的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的反向引物)和对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组(包含如下引物具有SEQ IDNO:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID N0:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的反向引物);以及对所述双重PCR的产物进行分析。根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID N0:12的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDNO: 13的核苷酸序列的反向引物。根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含由测试对象中分离DNA ;通过双重PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组(包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物)和对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组(包含如下引物具有SEQ IDNO: 12的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 13的核苷酸序列的反向引物)；以及对所述双重PCR的产物进行分析。有益效果如上所述，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的引物组(所述引物组能够检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特异性核苷酸序列)、使用所述引物组对结核分枝杆菌和 非结核分枝杆菌进行检测的检测试剂盒和基于双重PCR的方法。由于所述引物对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌来说是独有的，本发明的方法(能够使用便宜的常规PCR仪)可成为用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌同时进行检测的更高效的临床诊断手段。
图1为显示出使用实施例1的引物组进行双重PCR后的DNA片段的电泳照片。图2为显示出使用实施例2的引物组进行双重PCR后的DNA片段的电泳照片。图3为显示出使用实施例3的引物组进行双重PCR后的DNA片段的电泳照片。
具体实施例方式根据本发明的一个方面，本发明提供了对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID N0:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ IDNO:7的核苷酸序列的反向引物。SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5 和 SEQ ID NO:6 的核苷酸序列(NTM-1)均为 16S rRNA的特异性反向引物。SEQ ID N0:7的核苷酸序列(NTM-2)也是非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性反向引物。非结核分枝杆菌16S rRNA基因的所有所述反向引物均被设计来检测所有的目标非结核分枝杆菌种。SEQ ID NO:7 (5，-catcccacaccgctaccw-3’)的反向引物是指包含 5’-catcccacaccgctacct-3’ (SEQ ID NO:8)和 5’_catcccacaccgctacca_3’(SEQ ID N0:9)的引物组。例如，SEQ ID NO: 7的核苷酸序列可为以约1:1的比例将5’ -catcccacaccgctacct-3 和 5’ _catcccacaccgctacca_3’ 进行混合的引物组。根据本发明的另一方面，本发明提供了对结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO: 10的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的反向引物。结核分枝杆菌16S rRNA基因的所述反向引物被设计来检测各种目标分枝杆菌种(结核分枝杆菌复合群，MTC)。根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ IDNO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID N0:7的核苷酸序列的反向引物。用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒包含对结核分枝杆菌的IS6110具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物分别具有SEQ ID NO:1和SEQID N0:2的核苷酸序列的正向引物和反向引物。IS6110基因的所述特异性引物组被设计来检测各种目标分枝杆菌种(结核分枝杆菌复合群，MTC)。用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒包含对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列(NTM-1)所组成的组中的至少一个反向引物和具有S EQ ID N0:7的核苷酸序列(NTM-2)的反向引物。非结核分枝杆菌16S rRNA基因的所述反向引物被设计来检测各种目标非结核分枝杆菌种。检测试剂盒可进一步包含通过PCR扩增DNA所必需的试剂。这一试剂可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液等。为了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒中，引物能够对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特征基因进行检测，并可被设计使得能够产生在大小(bp)方面差异较大的PCR产物。在一个实施方式中，用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:7的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9。因此，在试剂盒中，SEQ ID N0:4的引物、5，_catcccacaccgctacct_3，(SEQ ID NO:8)和 5，_catcccacaccgctacca_3，(SEQ ID NO:9)可按2:1:1的比例进行混合。在本发明的另一实施方式中，用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9。在本发明的另一实施方式中，用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9。根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含对结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO: 10的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDNO: 11的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQID N0:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID N0:7的核苷酸序列的反向引物。检测试剂盒可进一步包含通过PCR扩增DNA所必需的试剂。这一试剂可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液等。为了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒中，引物能够对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特征基因进行检测，并可被设计使得能够产生在大小(bp)方面差异较大的PCR产物。在一个实施方式中，用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID N0:4和SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含 SEQ ID N0:8 和 SEQ ID N0:9。在本发明的另一实 施方式中，用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9。在本发明的另一实施方式中，用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9。根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含由测试对象中分离DNA ;通过双重PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组(包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物)和对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组(包含如下引物具有SEQ IDN0:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID N0:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的反向引物);以及对所述双重PCR的产物进行分析。根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含由测试对象中分离DNA ;通过双重PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增对结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组(包含如下引物具有SEQ ID NO: 10的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的反向引物)和对非结核分枝杆菌的16S rRNA具有特异性的引物组(包含如下引物具有SEQ ID NO: 3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID N0:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的反向引物);以及对所述双重PCR的产物进行分析。根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID N0:12的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDNO: 13的核苷酸序列的反向引物。用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒包含对结核分枝杆菌IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID N0:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID N0:2的核苷酸序列的反向引物。结核分枝杆菌IS6110基因的所述引物组被设计来检测各种目标分枝杆菌种(结核分枝杆菌复合群，MTC)。用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒包含对非结核分枝杆菌16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID N0:12的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 13的核苷酸序列的反向引物。非结核分枝杆菌16SrRNA基因的所述正向引物被设计来检测各种目标非结核分枝杆菌种。检测试剂盒可进一步包含通过PCR扩增DNA所必需的试剂。这一试剂可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液等。为了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒中，引物能够对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特征基因进行检测，并可被设计使得能够产生在大小(bp)方面差异较大的PCR产物。在根据本发明实施方式所述的用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒中，具有SEQ ID N0:12的核苷酸序列的正向引物为比例为约1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1 的如下引物的组5’ -catgtcttgtgggggaaagctt-3’(SEQ ID N0:14)、5，_catg1111gtgggggaaagc11-3，(SEQ ID NO :1 5)>5， _catgtcttctgggggaaagctt_3， (SEQ ID NO:16)、5， _catgtcttgtggtggaaagctt_3，(SEQ ID N0:17)、5，- catgtc11gtggggcaaagc11-3，(SEQ ID NO :1 8)> -catgttttctgggggaaagctt-3> (SEQ ID NO:19)>5> -catgtcttctggtggaaagctt-3>(SEQ ID N0:20)、5，_catgtc11gtggtgcaaagc11-3，(SEQ ID NO :2 I )>-catgttttgtggggcaaagctt-3J (SEQ ID NO: 22)、5’ -catgtcttctggggcaaagcm’(SEQ ID N0:23)、5，_catg1111gtggtggaaagc11-3，(SEQ ID NO :24)>-catgttttctggtggaaagctt-3> (SEQ ID NO:25)>5> -catgttttctggggcaaagctt-3>(SEQ ID N0:26)、5，- catg1111gtggtgcaaagc11-3，( SEQ ID NO :2 7)>5J-catgtcttctggtgcaaagctt-3J (SEQ ID NO:28)和 S’-catgttttctggtgcaaagctt-S’ (SEQID N0:29)。根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含由测试对象中分离DNA ;通过双重PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组(包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物)和对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组(包含如下引物具有SEQ IDNO: 12的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 13的核苷酸序列的反向引物)；以及对所述双重PCR的产物进行分析。实施例
通过下述实施例将更好地理解本发明，所述实施例用来对本发明进行说明，而不应被解释为对本发明进行限定。参考例寻找结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特征核苷酸序列1.目标和基因位点将下列分枝杆菌的16S核糖体RNA基因数据用于寻找结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特征核苷酸序列中脓肿分枝杆菌(M.abscessus) (AJ419970.1、AJ416940.1、AJ536038)、阿加普尔分枝杆菌(M. acapulcensis) (AF480575.1)、非洲分枝杆菌(M. africanum) (AF480605.1)、田野分枝杆菌(M. agri) (AJ429045.1)、爱知分枝杆菌(M. aichiense) (X55598.1)、河床分枝杆菌(M. alvei) (NR—024859.1)、亚洲分枝杆菌(M. asiaticum) (X55604.1)、金色分枝杆菌(M. aurum) (FJ172298.1)、南非分枝杆菌(M. austroafricanum) (GU121552.1)、鸟分枝杆菌(M. avium) (NR—025584.1、AJ536037.1、EF521892.1)、波希米亚分枝杆菌(M.bohemicum) (NR_026054.1)、波特尼分枝杆菌(M. botniense) (NR_028878.1)、牛分枝杆菌(M. bovis) (GU142937.1)、布氏分枝杆菌(M. branderi) (AF480574.1)、雾分枝杆菌(M.brumae) (NR—025233.1)、隐藏分枝杆菌(M. celatum) (L08169.1)、龟分枝杆菌(M. chelonae) (AM884324.1、AJ419969.1)、千田分枝杆菌(M. chitae)(NR—029220.1)、氯酚分枝杆菌(M. chlorophenolicum) (NR—026173.1)、楚布分枝杆菌(M. chubuense) (X55596.1)、汇合分枝杆菌(M.confluentis) (AJ634379.1)、炫耀分枝杆菌(M. conspicuum) (X029298.1)、库氏分枝杆菌(M. cookii) (X53896.1)、迪氏分枝杆菌(M. diernhoferi) (AF480599.1)、M. doricum (NR—025099.1)、杜氏分枝杆菌(M.duvalii) (NR—026073.1)、M. engbaekii (AF480577.1)、诡诈分枝杆菌(M. fallax) (AF480600.1)、产`鼻疽分枝杆菌(M. farcinogenes) (X55592.1)、转黄分枝杆菌(M. flavescens) (AY734993.1)、偶发分枝杆菌(M. forrtuitum) (AY457066.1、AF480580.1、GU142933.1)、加地斯分枝杆菌(M. gadium) (NR—026087.1)、胃分枝杆菌(M. gastri ) (GU142918.1 )、日内瓦分枝杆菌(M. genavense) (NR—029223.1 )、浅黄分枝杆菌(M. gilvum) (AB491971.1)、戈地分枝杆菌(M. goodii) (AY457079.1)、戈氏分枝杆菌(M. gordonae) (GU142923.1 )、嗜血分枝杆菌(M. haemophilum) (V06638.1 )、M. hassiacum(NR—026011.1)、海德堡分枝杆菌(M. heidelbergense) (NR—025268.1)、爱尔兰分枝杆菌(M. hiberniae) (NR—026092.1)、霍德勤分枝杆菌(M. hodleri) (NR—026286.1)、免疫原分枝杆菌(M.1mmunogen) (AJ011771.1)、居间分枝杆菌(M. interjectum) (X70961.1)、中间分枝杆菌(M.1ntermedium) (X67847.1)、胞内分枝杆菌(M.1ntracellulare) (AY652958.1、AJ536036. 1、X52927. 1、M61684.1)、堪萨斯分枝杆菌(M. kansasii) (M29575. 1、X15916.1)、缓黄分枝杆菌(M. lentiflavum) (AF480583. 1)、M. mageritense (AY457076.1)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense) (GQ153278.1)、海分枝杆菌(M. marinum) (AF456238. UAY513243.1)、田鼠分枝杆菌(M. microti) (NR—025234.1)、M. monacense (GU142931.1)、莫里奥卡分枝杆菌(M. moriokaense) (AY859686.1)、产粘液分枝杆菌(M. mucogenicum) (AF480585.1)、新金色分枝杆菌(M. neoaurum) (FJ172306.1)、不产色分枝杆菌(M. nonchromogenicum)(DQ058406.1)、奥布分枝杆菌(M. obuense) (X55597.1)、石錯分枝杆菌(M. paraffinicum)(GQ153282.1)、副偶然分枝杆菌(M. parafortuitum) (NR—026285.1)、外来分枝杆菌(M. peregrinum) (AY457069.1)、草分枝杆菌(M.phlei) (AF480603.1)、猪分枝杆菌(M. porcinum) (AY457077.1)、海绵分枝杆菌(M. poriferae) (NR_025235.1)、灰尘分枝杆菌(M. pulveris) (NR025528.1)、罗得西亚分枝杆菌(M. rhodesiae) (NR_025529.1)、療病分枝杆菌(M. scrofulaceum) (GQ153271.1 )、M. senuense (DQ536409.1 )、胺毒性分枝杆菌(M. septicum) (AY457070.1)、施氏分枝杆菌(M. shimoidei) (X82459.1)、猿分枝杆菌(M. simiae) (GQ153280.1)、耻垢分枝杆菌(M. smegmatis) (NR_025311.1)、泥炭藓分枝杆菌(M. sphagni) (X55590.1)、苏加分枝杆菌(M. szulgai) (X52926.1)、地分枝杆菌(M. terrae) (NR_029168.1)、耐热分枝杆菌(M. thermoresistibile) (GU142928.1)、M. tilburgii (AJ580826.1)、三重分枝杆菌(M. triplex) (GQ153279.1)、次要分枝杆菌(M. triviale) (DQ058405.1)、结核分枝杆菌(M. tuberculosis)(⑶ 142936.1、⑶ 142935.1、AY53603. UX55588. UX52917.1)、托斯卡分枝杆菌(M. tusciae) (NR_024903.1)、溃疡分枝杆菌(M. ulcerans) (Z13990.1)、母牛分枝杆菌(M. vaccae) (X55601.1)、沃林斯基分枝杆菌(M. wolinskyi) (AY457083.1)和蟾分枝杆菌(M. xenopi) (X52929.1)。从 NCBI (美国国家生物技术信息中心)数据库中获得16S核糖体RNA基因的数据。通过Sequencher4. 9对分枝杆菌种的16S rRNA基因序列的数据进行分析得到特征核苷酸序列，即，结核分枝杆菌复合群的特征核苷酸以及在结核分枝杆菌复合群中缺失、但在非结核分枝杆菌中固有的核苷酸。实施例1 :结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌I的分离和检测1.检测目标和引物设计待检测的目标基因为结核分枝杆菌复合群的IS6110基因和非结核分枝杆菌的16S rRNA 基因。将通用引物用作正向引物来扩增分枝杆菌的16S rRNA基因。将非结核分枝杆菌特征性的NTM-1和NTM-2用作反向引物。使用Primer3程序设计用于目标基因检测的这些引物。(I)结核分枝杆菌复合群(MTC)I)目标基因IS61102)引物a.正向引物5，-cgaactcaaggagcacatca-3，(SEQ ID NO:1)b.反向引物5，-gtcgaggaccatggaggtg-3，(SEQ ID NO:2)3) PCR 产物大小385bp(2)非结核分枝杆菌(NTM)I)目标基因16S rRNA2)引物 a.正向引物5，-gtggcgaacgggtgagtaa-3，(SEQ ID NO:3)b.反向引物NTM-1 :5，_cccacaccgcaaaagctt_3’ (SEQ ID NO:4)、5，-cccacaccgcaaaagct-3，(SEQ ID NO:5)或 5， -tcccacaccgcaaaagct-3， (SEQID NO:6)NTM-2 :5， -catcccacaccgctaccw-3’ (SEQ ID NO:7)3) 0 产物大小128-135匕卩
<实施例1-1 :将SEQ ID NO:4的核苷酸序列用作对NTM进行检测的反向引物NTM-1的双重PCR>(I)DNA 的分离使用自动化分枝杆菌生长系统BACTEC MGIT960 (Becton, Dickinson andCompany,Maryland, USA)使结核分枝杆菌ATCC25177和脓肿分枝杆菌ATCC19977在特有的MGIT分枝杆菌生长培养基中生长。向1. 5mL管中移入500 u L培养有分枝杆菌的MGIT肉汤，并以14，OOOrpm离心5min。去除上清液,将沉淀溶于300 y L无菌蒸懼水中，并在沸水浴中加热lOmin。在以14，OOOrpm离心5min后，将上清液用作PCR中的模板。将结核分枝杆菌ATCC25177和脓肿分枝杆菌ATCC19977的混合物用作组合的MTC和NTM种。(2)双重 PCR使用GeneAmp PCR 系统 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA),双重PCR从在约94°C下预变性2min开始；再以如下条件运行40个循环在约94°C下变性30秒，在56°C下退火30秒，以及在约68°C下延伸2min ;接着在约68°C下终延伸3min。下表I中总结了所述双重PCR的组成。在引物混合物中，以相同的量(IOpmole/ii L)包含正向引物和反向引物。因此，对于MTC，1.5 ii L引物混合物包含含量各自为15pmole的正向引物和反向引物。由于PCR混合物的总体积为25iiL，所以其以0. 6uM (15pmole/25 u L)的浓度含有引物。对于NTM，正向引物和反向引物各自的含量为lOpmole/1 ii L，终浓度为0. 4iiM (10pmole/25u L)0在这一背景下，当NTM-2反向引物由5pmole的5，_catcccacaccgctacct_3，(SEQ ID NO:8)和 5pmole 的 5，_catcccacaccgctacca_3，(SEQID N0:9)组成时，NTM-1反向引物(SEQID N0:4)和NTM-2反向引物(SEQ ID N0:7)各自以IOpmole的量使用。
表I
权利要求
1.一种对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物 具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物； 选自于由SEQ ID N0:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少ー个反向引物； 以及具有SEQ ID N0:7的核苷酸序列的反向引物。
2.一种对结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO: 10的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的反向引物。
3.用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含 对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDNO: 2的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID N0:4_6的核苷酸序列所组成的组中的至少ー个反向引物和具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物。
4.用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含 对结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO: 10的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的反向引物；以及 对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID N0:4_6的核苷酸序列所组成的组中的至少ー个反向引物和具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物。
5.用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含 由测试对象中分离DNA ； 通过双重PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID N0:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少ー个反向引物和具有SEQID NO:7的核苷酸序列的反向引物；以及对所述双重PCR的产物进行分析。
6.用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含 由测试对象中分离DNA ； 通过双重PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增对结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO: 10的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID N0:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少ー个反向引物和具有SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的反向引物；以及对所述双重PCR的产物进行分析。
7.用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含 对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的反向引物；以及 对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO: 12的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 13的核苷酸序列的反向引物。
8.用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含 由测试对象中分离DNA ； 通过双重PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID N0:2的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物具有SEQ ID NO: 12的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO: 13的核苷酸序列的反向引物； 以及对所述双重PCR的产物进行分析。
全文摘要
本发明提供了通过双重聚合酶链式反应对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法利用对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的引物组，所述引物组对结核分枝杆菌特异性的IS6110基因或16s rRNA基因和非结核分枝杆菌特异性的16s rRNA基因具有特异性。本发明提供了使用便宜的常规PCR仪对结核分枝杆菌和/或非结核分枝杆菌同时进行更加有效的检测的临床诊断手段。
文档编号C12R1/32GK103038346SQ201180036628
公开日2013年4月10日 申请日期2011年5月26日 优先权日2010年5月27日
发明者金廷昱 申请人:蔚山大学校产学协力团