专利名称：导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种导入ClfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种人畜共患病的重要致病菌，并且是毒力最强的致病菌。其可引起局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒血症等全身感染。同时，金黄色葡萄球菌也是国内外最常见的细菌性食物中毒病原之一。据美国疾病预防控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希氏菌，居第二位，占细菌性食物中毒的33%。在我国，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒约占细菌性食物中毒事件的25%，而在美国、加拿大等发达国家，更是高达50%。美国每年因被金黄色葡萄球菌感染而丧生的人数已超过死于艾滋病人数。因此，金黄色葡萄球菌的防治具有重要的公共卫生学意义及经济意义。近年来，随着对金黄色葡萄球菌致病机理研究的不断深入，人们认识到，细菌感染的第一步就是在体内定殖，而实现定殖的前提是细菌黏附在宿主的组织表面。这也就要求细菌有可以黏附到组织表面的组分，即黏附素。从20世纪开始，国外的研究学者对金黄色葡萄球菌的黏附素进行了广泛的研究，发现了金黄色葡萄球菌主要黏附素——纤黏蛋白原凝集素A(ClfA)，ClfA主要黏附于纤维蛋白原和纤维蛋白上，与乳腺、皮下、血管、心内膜等的感染有关。迄今为止，所有临床分离的金黄色葡萄球菌中都存在编码ClfA的基因clfA。对金黄色葡萄球菌黏附素表达调控的研究发现，在金黄色葡萄球菌感染的早期主要表达黏附素，之后才表达毒素和荚膜，所以，对金黄色葡萄球菌的黏附进行干预，可以减少或阻止毒素和荚膜的表达，而以黏附素作为靶位进行疫苗研制可能是预防金黄色葡萄球菌感染的有效途径。目前已有学者用大肠杆菌表达金黄色葡萄球菌clfA基因，为下一步研制基因工程疫苗奠定了研究基础。但是以其作为载体研制的疫苗存在着可能保持侵袭性和毒性的问题，在应用于儿童、老人和免疫缺陷者时受到了限制。
发明内容
本发明是要解决目前使用大肠杆菌作为宿主表达clfA基因，研制基因工程疫苗存在侵袭性和毒性问题，提供导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法。本发明导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA ；二、以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，以 MG-CLaF和MG_CLaR2为引物，进行PCR扩增；三、将PCR扩增产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得clfA基因；四、采用质粒提取试剂盒提取保存于大肠杆菌JM109中的质粒pMG36c ；五、分别对clfA基因和质粒pMG36c进行双酶切，将酶切后的clfA基因和质粒pMG36c用连接试剂盒进行连接，得连接产物；六、将连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，采用氯霉素筛选转化子，完成重组质粒pMG36c-ClfA的构建；七、将重组质粒pMG36c-ClfA电转化乳酸乳球菌MG1363，即完成导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建；其中步骤一中PCR引物MG-CLaF的序列为5' -GCGGTCGACATG AATATGAAGAAAAAAG-3 ‘，引物 MG_CLaR2 的序列为 5 ‘ -TTACCCGGGCAACCTACCTTACACCCT-3 ‘
ο本发明以乳酸乳球菌作为载体表达ClfA基因，可用于研制基因工程疫苗，安全、 无致病性。基因工程疫苗以其作为载体，可避免用病原菌作为宿主的活菌疫苗存在的侵袭性和毒性问题，这有利于在儿童、老人和免疫缺陷者中应用。以大肠杆菌作为宿主表达ClfA基因，研制的疫苗存在着可能保持侵袭性和毒性的问题，在应用于儿童、老人和免疫缺陷者时受到了限制。而乳酸乳球菌是公认的食品级安全微生物，以其作为载体表达clfA基因而构建的疫苗，具有比大肠杆菌所不具有的优势。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式导入ClfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA ；二、以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，以MG-CLaF和MG_CLaR2为引物，进行PCR扩增；三、将PCR扩增产物用1 % 琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得clfA基因；四、采用质粒提取试剂盒提取保存于大肠杆菌JM109中的质粒pMG36c ；五、分别对clfA基因和质粒pMG36c 进行双酶切，将酶切后的clfA基因和质粒pMG36c用连接试剂盒进行连接，得连接产物；六、 将连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，采用氯霉素筛选转化子，完成重组质粒 pMG36c-ClfA的构建；七、将重组质粒pMG36c_ClfA电转化乳酸乳球菌MG1363，即完成导入 clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建；其中步骤一中PCR引物MG-CLaF的序列为5 ‘-GCGGTCGACATGAATATGAAGAAAAAAG-3 ‘，引物 MG_CLaR2 的序列为 5 ‘ -TTACCCGGGCAACCTA CCTTACACCCT-3‘。步骤一中所述金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌ATCC25923，购买自中国医学细菌保藏管理中心。步骤四中所述大肠杆菌JM109购买自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。步骤七中乳酸乳球菌MG1363购买自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。步骤三所述胶回收试剂盒为购买自Omega公司的凝胶回收试剂盒MinElute Gel Extraction Kit。步骤四所述质粒提取试剂盒购买于Omega公司。步骤五所述连接试剂盒为购买自东洋纺(上海)生物科技有限公司的高效连接试剂盒Ligation high。步骤一中提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA的具体方法为1、取过夜培养的金黄色葡萄球菌菌液1. 5mL(0D6C1(1大约为20D)于1. 5mL离心管中， 12000rpm离心2min，得沉淀；2、用576 μ L TE溶液使沉淀悬浮，然后加入3 μ LlO%的SDS溶液和3 μ L20mg/mL 的蛋白酶K，37°C水浴30min ；3、加入100 μ L5mol/L的NaCl溶液，再加入80 μ LCTAB-NaCl溶液，充分混合后，在 65°C下保温 IOmin ；4、加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25 24 1)，混合后于12000rpm离心lOmin，将上清液转至一新的离心管中；5、重复步骤4 一遍，将上清液转移到一新的离心管中；6、加入0. 6倍体积的异丙醇，轻轻混合至DNA沉淀，12000rpm离心lOmin，去上清；7、用体积浓度70%的乙醇溶液洗涤沉淀，然后去上清，待沉淀风干后加入30 μ L 双蒸水即可。步骤七中将重组质粒pMG36c_ClfA电转化乳酸乳球菌MG1363的具体方法为(一 )乳酸菌感受态细胞的制备与转化1挑取平板上的乳酸乳球菌MG1363单菌落接种于MRS液体培养基中培养过夜；2将2mL新鲜菌液接种到50mL新鲜的MRS液体培养基中，30°C静止培养，测定0D_ 达到0. 5时停止培养；3在4 °C以6000r/min离心5min收集菌体，弃上清每管用Iml预冷的 Electroporation Buffer (预冷)重悬菌体，然后离心；4再用ImL冰预冷的Electroporation Buffer洗两次，将菌体重悬在 Electroporation Buffer中并使OD600达到0. 45，分装到离心管中，每管50 μ tL ；5菌悬液在45°C温育20min，然后在冰上放置IOmin ；6将50 μ L菌悬液和1. O μ g的DNA混合，转入0. 2cm的电转杯；7设置电转参数1200-1800V进行电击；8立即加入950yL的milk medium，置于30°C静止培养复壮3h ；9将复壮后的菌液梯度稀释，涂布在含有合适抗生素浓度(Cm 5 μ g/mL)的MRS平板上，每板涂布200 μ L，置于30°C静止培养2-3天。Electroporation Buffer :0. 4mol/L 蔗糖，5mmol/L 磷酸二氢钠，lmmol/L 氯化镁， 用HCl调pH值为6.0。milk medium :0. 2mol/L蔗糖，5%脱脂乳，0. 酵母提取物，酪蛋白氨基酸， 25mmol/L氯化镁，115°C高压灭菌20min，贮存于4°C。MRS液体培养基蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、吐温 801ml、K2HPO4 2g、NaAc 5g、C6H6O7 (NH4) 2 2g、MgSO4 · 7H20 0. 58g、MnSO4 · 4H20 0. 25g，先将 MgSO4 ·7Η20，MnSO4 ·4Η20，葡萄糖以及吐温80以外的各成分加入900ml去离子水加热溶解， 冷却至50°C调节pH值为6. O 6. 5，而后加MgSO4 · 7H20, MnSO4 · 4H20最后加吐温80和葡萄糖，用高压蒸汽灭菌锅以lkg/cm2灭菌20min，贮存于4°C。(二)转化子的筛选选取转化的单菌落30个重组质粒、10个空质粒；将上述单菌落先接种到没有加抗生素的MRS液体培养基中培养；菌长出后，再取部分菌液接种到含有抗生素的液体培养基中培养；其余菌液，一部分加入甘油，进行保存；另一部分放在4°C待用；菌在含有抗生素培养基中生长，进行菌落PCR;提取质粒，进行质粒酶切鉴定和PCR扩增鉴定。(三)结果1抗性筛选将重组质粒pMG36C_clfA转化到乳酸乳球菌感受态细胞中，转化后培养3天，长出转化子。获得转化子数目约为150个。阴性对照(即未转化质粒的感受态细胞)在抗性平板上未生长，在未含抗生素的平板上生长。阳性对照(即转化PMG36C的感受态细胞)在抗性平板上生长，有转化子。将获得转化子，进行镜检，并与对照感受态细胞进行比较，发现， 获得的转化子与感受态细胞相同，是乳酸乳球菌。2PCR检测情况从转化子中提取质粒，而从感受态细胞中未提到质粒。对提取的质粒进行酶切验证，Sal I，Sma I单酶切以及双酶切结果，均与预期结果相同。以提取的质粒为模板，进行 PCR扩增，获得了 3000bp的目标条带。表明转化成功。3重组蛋白的表达将含有重组质粒的乳酸乳球菌在MRS液体培养基中静置培养过夜，按2 %的接种量接种于新鲜MRS液体培养基中，继续静置培养至对数后期，离心收集菌体，电泳检测。基因全长^02bp，编码933个氨基酸，预测分子量为96942Da。蛋白电泳显示，与对照菌株(转化pMG36C的菌株)相比，转化pMG36C-c 1 fA的菌株，在97KDa附近，有一蛋白条带，表明c 1 fA 基因成功表达。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中PCR扩增的反应体系为20 μ L反应体系，由下列成分组成
成分用量金黄色葡萄球菌基因组DNAΙμ ΙΟμιηοΙ/L 引物 MG-CLaFΙμ ΙΟμιηοΙ/L 引物 MG-CLaR2Ιμ IOxBuffer2μLIOmMdNTP2μL25mM Mg2+0.8|iLΟυ/μ KOD-Plus-DNA 聚合酶0.5|iL无菌水11.7|iLPCR扩增条件为94°C变性 2min，94°C变性 15s，58°C退火 30s，68°C延伸 90s，共；35 个循环，再68°C延伸5min，4°C保温。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤五中ClfA基因双
酶切的体系如下成分用量200ng/|iL clfA 基因5 |iLSal IΙμ Sma IΙμ 1.5 X T Buffer3μLBSA (牛血清白蛋白)2μL无菌水8|iL酶切反应条件37°C水浴，lh。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤五中质粒pMG36c
双酶切的体系如下
成分用量200ng/|iL pMG36c5μLSal IΙμ Sma IΙμ 1.5 X T Buffer3μLBSA2μL无菌水8|iL 酶切反应条件37°C水浴，lh。其它与具体实施方式
一相同。
权利要求
1.导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA ；二、以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，以MG-CLaF和MG_CLaR2为引物，进行PCR 扩增；三、将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得clfA基因；四、采用质粒提取试剂盒提取保存于大肠杆菌JM109中的质粒pMG36c ；五、分别对clfA基因和质粒pMG36c进行双酶切，将酶切后的clfA基因和质粒pMG36c用连接试剂盒进行连接，得连接产物；六、将连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，采用氯霉素筛选转化子，完成重组质粒pMG36c-ClfA的构建；七、将重组质粒pMG36c_ClfA电转化乳酸乳球菌MG1363，即完成导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建；其中步骤一中 PCR 引物 MG-CLaF 的序列为 5 ‘ -GCGGTCGACATGAATATGAAGAAAAAAG-3 ‘，引物 MG_CLaR2 的序列为 5' -TTACCCGGGCAACCTACCTTACACCCT-3‘。
2.根据权利要求1所述的导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中PCR扩增的反应体系为20 μ L反应体系，由下列成分组成
3.根据权利要求1所述的导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤五中clfA基因双酶切的体系如下
4.根据权利要求1所述的导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤五中质粒pMG36c双酶切的体系如下成分用量.200ng/pL· pMG36c5μLSal IΙμ Sma IΙμ .1.5 X T Buffer3μLBSA2μL无菌水^μL酶切反应条件37°C水浴，Ih。
全文摘要
导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法，涉及一种导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法。是要解决目前使用大肠杆菌作为宿主表达clfA基因，研制基因工程疫苗存在侵袭性和毒性问题。方法提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA；以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得clfA基因；提取保存于大肠杆菌JM109中的质粒pMG36c；分别对clfA基因和质粒pMG36c进行双酶切，将酶切后产物连接；将连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，采用氯霉素筛选转化子，构建重组质粒；将重组质粒电转化乳酸乳球菌，即完成。本发明可用于研制基因工程疫苗，安全、无致病性。
文档编号C12N15/74GK102559733SQ20121006511
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月13日 优先权日2012年3月13日
发明者于冲, 夏海华, 孙建华, 崔艳华, 张超, 曲晓军, 王金英 申请人:哈尔滨工业大学, 黑龙江省科学院微生物研究所