专利名称：一种脐带间充质干细胞生物学效力的检测方法
技术领域：
本发明涉及干细胞检测技术，具体地说，涉及一种脐带间充质干细胞生物学效カ的检测方法。
背景技术：
胳带间充质干细胞(umbilicalcord-mesenchymal stem cells,UC-MSCs)是从胳带组织中分离得到的ー种具有多向分化潜能的干细胞。脐带是怀孕期间连接母体与胎儿之间的组织，由两条动脉、一条静脉和粘液结缔组织(Wharton’ s Jelly)构成。脐带胶、脐带血管壁和血管周围均富含基质间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)和MSCs样细胞(包括基质细胞、血管周细胞等)。自2003年Mitchell等[I]首次自脐带中成功地分离出基质细胞并证实其神经分化潜能后，对脐带组织来源MSCs的研究引起了广泛关注。
脐带来自于胎儿生产后的废弃物，从脐带中获取MSCs，资源丰富、质量高、较纯净；比从成体组织中获取MSCs细胞在供者来源、细胞数量及増殖潜能、病毒感染率方面都有明显优势。另外UC-MSCs具有高度的分化潜能，良好的免疫调节能力，同时具有低免疫原性，异体移植时可避免排斥反应，使其具有重要的研究和应用前景，特别在治疗免疫相关疾病方面均具有重要的临床应用价值。然而，由于细胞治疗本身的特点，间充质干细胞用于临床治疗还具有某些方面的限制因素。其中最典型的方面是缺乏有效而快捷的具有针对性的生物学效カ检测手段。目前多数临床前或临床使用的间充质干细胞产品都是依据2006年国际细胞治疗协会提出的三条定义间充质干细胞标准[2]，而缺乏针对某ー类疾病的可以定义细胞质量或初歩判断细胞治疗效果的方法。为克服以上问题的不足，我们对UC-MSCs分泌的ー种糖蛋白-gal ect in-3 (半乳糖凝聚素-3)进行了系统研究，该蛋白是galectins(半乳糖凝聚素)家族的ー员，分子量为26kD，大量研究表明该蛋白可有效抑制T淋巴细胞的増殖，促进T淋巴细胞的凋亡[3-7]。我们在研究中发现UC-MSCs在核酸水平和蛋白水平均有较高剂量的galectin-3表达，而该蛋白在MSC的表达又分为分泌型的和膜表达型。我们通过RNA干扰试验和Transwell小室共培养试验发现分泌型的galectin-3在脐带间充质干细胞免疫调节方面发挥主要作用，我们同时检测了该蛋白在连续数批UC-MSC上清中的表达，由此提出了ー种检测MSC免疫抑制效カ的新方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有间充质干细胞生物学效カ检测手段的不足，建立ー套有效检测UC-MSC免疫抑制能力的新方法。本发明提供了一种脐带间充质干细胞生物学效カ的检测方法，其特征在于通过检测脐带间充质干细胞培养上清液中galectin-3的含量来判断其免疫抑制效力。
在ー个特定的实施方案中，所述脐带间充质干细胞为人脐带间充质干细胞，并且其判断标准为人脐带间充质干细胞培养上清液中galectin-3的含量以2. 62ng/ml为阈值，低于此数值的判定为人脐带间充质干细胞免疫抑制效カ不合格。优选地,使用ELISA方法检测脐带间充质干细胞培养上清液中galectin-3的含量。尽管之前的研究已经发现galectin-3表达与UC-MSC免疫抑制能力之间存在密切关系，但并没有开发出ー套成熟的脐带间充质干细胞生物学效カ的检测方法。本发明首次发现分泌型的galectin-3在UC-MSC免疫抑制过程中起主要作用，并在此基础上开发出ー套有效检测UC-MSC免疫抑制能力的方法。本发明的方法以脐带间充质干细胞培养上清液中的分泌型galectin-3蛋白质为检测对象,相比膜表达型galectin-3蛋白质的检测,针对性强，定量准确；并且由于不需要消化细胞，可适用于大規模连续脐带间充质干细胞培养时免疫抑制效カ的检测。本发明的方法检测样本处理简便，并可使用仪器进行自动或半自动 检测。
图1A. PCR结果分析hUC-MSC mRNA水平表达galecitn-3，其中I、3、5分别是三批细胞表达galectin-3的条带,2、4、6为相应细胞的β -actin。图IB. real-time qPCR结果分析3批hUC-MSC于P2 P5不同代次mRNA水平表达galecitn-3。以β -actin作为内參，对galectin-3的Cp值进行2_Δα分析。图2. Westernblot结果分析hUC-MSC上清液和RIPA裂解液中galecitn-3的表达。图3. ELISA分析hUC-MSC上清液和RIPA裂解液中galecitn-3的表达。图4.流式细胞仪分析hUC-MSC表面表达galectin-3的情况，其中空心部分表示同型对照表达情况，实心部分(M值)表示galectin-3表达。图5A. real-time qPCR 结果分析 RNA 干扰后 hUC-MSC mRNA 水平表达 galecitn-3，以β -actin作为内參，contr组作为对照,对galectin-3的Cp值进行分析；其中gal-3 ▼组表达量明显低于contr组和NA组(P < O. 01)。图5B. ELISA分析RNA干扰后hUC-MSC分泌至上清中的galecitn-3 (ng/ml),统计分析可知gal-3 ▼组表达量明显低于contr组和NA组(P < O. 01)。图5C. ELISA 分析 RNA 干扰后 RIPA 裂解 100 万个 hUC-MSC 中的 galecitn-3 (ng/ml),其中gal-3▼组表达量明显低于contr组和NA组(P < O. 01)。图6. BrdU吸收法检测各共培养组PHA-P刺激的PBMC增殖情况(以光吸收值表示)O 图7. BrdU吸收法检测各TranswelI共培养组PHA-P刺激的PBMC增殖情况(以光吸收值表示)。
具体实施例方式实施例I mRNA水平检测galectin-3表达连续培养三批人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)，培养至P4代后，分别消化离心，用RNA提取试剂盒(Invitrogen公司产品)提取细胞总RNA,逆转为cDNA后,用galectin-3引物分别进行常规PCR扩增(正向引物5 ' -CCAAAGAGGGAATGATGTTGCC-3 ,，反向引物5! -TGATTGTACTGCAACAAGTGAGC-3!)，并进行琼脂糖电泳分析(结果图1A);选取相同批次P2 P4代细胞提取RNA后逆转为cDNA，用real-time qPCR(实时定量PCR)分析，引物序列与PCR相同，并对real-time qPCR结果进行目标产物的分析(结果见图IB)。由结果可知，hUC-MSC在mRNA水平表达gal ect in_3，且代次之间表达量无明显差异。实施例2 Western blot 检测 galectin-3 蛋白表达培养人脐带间充质干细胞，培养体系为10ml，培养48h后收集上清液备用；细胞消化后离心计数，每100万细胞加入Iml RIPA试剂(细胞裂解液，Sigma公司)裂解细胞。细胞上清液和RIPA裂解液同时做SDS-PAGE电泳，将电泳条带用半干法转移至PVDF膜上进行Western blot 分析，一抗为 goat 抗-galectin-3 抗体(R&D 公司)，ニ抗为 rabbit 抗 goatIgG(Abeam公司),结果见图2。由结果可知,hUC-MSC可表达galectin-3蛋白，并且此蛋白可分泌至细胞培养液中。实施例3 ELISA检测galectin-3蛋白表达连续培养3批人脐带间充质干细胞，培养体系为10ml，培养48h收集上清液备用；48h末消化细胞，每100万细胞加入Iml RIPA试剂裂解细胞。细胞上清液和RIPA裂解液同时做ELISA检测(galectin-3ELISA试剂盒，Bender公司)，结果如图3。进ー步证明galectin-3蛋白可在hUC-MSC细胞中表达并可分泌至细胞外。实施例4流式细胞仪检测galectin-3表达连续培养3批人脐带间充质干细胞，培养48h后消化细胞，每100万细胞加入5 μ I Alexa488 goat anti galectin-3抗体或同型对照,进行流式细胞分析,检测细胞表面galectin-3表达。结果如图4所示，galectin-3在细胞表面表达量可达47. 95%。实施例5对galectin-3进行RNA干扰采用galectin-3 siRNA对hUC-MSC进行RNA干扰；同时选择siRNA的阴性序列作为RNA干扰的阴性对照。galectin-3 siRNA及阴性对照序列来源于 Sigma-Aldrich 公司，其中 galectin-3siRNA的序列(5' -3')如下sense CACUUUAACCCACGCUUCAdTdT,anti-sense UGAAGCGUGGGUUAAAGUGdTdT ；阴性对照序列(5' -3')如下sense :UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，anti-sense :ACGUGACACGUUCGGAGAATT。具体方法为同一来源的细胞等分为3份，贴壁培养24h后，其中两份分别加入含有脂质体(lipofectamine RNAi MAX, Invitrogen 公司)和 galectin-3 siRNA ( gal-3 T组)或阴性对照序列(NA组)的Opti-MEM溶液,另外ー份不做处理(contr组)。细胞加入siRNA培养24h后，分别检测三份细胞mRNA水平、蛋白水平galectin-3表达情況。结果如图5A-5C，gal-3 ▼组与NA组和contr组相比，hUC-MSC在mRNA水平、蛋白水平表达galectin-3均显著降低(P < 0. 01)。经RNA干扰后，mRNA水平表达抑制率为95. 1%，细胞内galectin-3表达抑制率为6L 2%，细胞分泌galectin-3抑制率为82. 3%。、
实施例6 hUC-MSC( gal-3▼组/NA组/contr组)与PBMC共培养将6个不同批次的UC-MSC接种于24孔板，相同细胞各 做3个平行孔，其中2孔分别进行galectin-3和阴性对照序列的RNA干扰(gal-3 ▼组/NA组)，另一孔不做处理(contr组)。干扰24h后各组细胞一起与经PHA-P刺激的PBMC共培养，48h后BrdU法检测经上述各组hUC-MSC共培养后PBMC的增殖作用，增殖量以OD值(A450nm-A690nm)表示。如图6所示，PBMC经PHA-P刺激后可显著增殖(PP组)，然而与hUC_MSC共培养后，PBMC增殖明显被抑制(NA组和contr组)。而经galectin-3 siRNA干扰后，hUC-MSC抑制PBMC能力明显降低(P < O. 01)。其中PP组为经PHA-P刺激的PBMC单独培养组，gal-3 T组/NA组/contr组为经galectin-3 siRNA处理/阴性对照序列处理/不处理的hUC-MSC与经PHA-P刺激的PBMC共培养组。gal-3 ▼组与NA组相比hUC-MSC对PBMC增殖抑制率降低了 69. 03 %。说明抑制率计算方法inhibitiongai—3T= (ODpp-ODgai—3T ) / ODpp,
(0D值为各组平均值，其他共培养组抑制率算法相同)。抑制率降低率算法Δ inhibition= (inhibitiongai.3T-inhibition να) / inhibition να, η=6。以上结果发现，经galectin-3 siRNA干扰后，hUC-MSC抑制PHA-P刺激的PBMC增殖能力明显下降(P < 0. 01)，表明galectin-3的表达对于hUC-MSC免疫抑制有重要作用。实施例7 hUC-MSC ( gal-3 ▼组 /NA 组 /contr 组)与 PBMC 经 TranswelI 小室共培
养将6个不同批次的hUC-MSC接种于24孔板，相同细胞各做3个平行孔，其中2孔分别进行galectin-3 siRNA和阴性对照序列处理(gal-3 ▼组/NA组)，另一孔不做处理(contr组)。RNA干扰24小时后各孔细胞分别植入transwell小室，在小室中加入经PHA-P刺激的PBMC，共培养48h后BrdU法检测经上述各组hUC-MSC共培养后PBMC的增殖作用，增
殖量以OD值表示。在transwell作用下，hUC-MSC主要通过分泌各种抗炎症因子而对PBMC增殖产生抑制作用。如图7所示，transwell存在情况下，hUC-MSC仍然可以显著抑制PBMC増殖(NA组和contr组)。而经galectin-3 siRNA干扰后，hUC-MSC抑制PBMC能力明显降低(P< 0. 01)。gal-3 ▼组与NA组相比hUC-MSC对PBMC增殖抑制率降低了 79. 22%。经RNA干扰后的hUC-MSC分泌至细胞外的galectin-3表达量降低，从而使其抑制PBMC增殖的能力降低率高达79%，说明分泌型的galectin-3在hUC-MSC免疫抑制过程中起主要作用，可作为检测hUC-MSC免疫调节能力的标志性因子。实施例8 hUC-MSC上清galectin-3含量检测连续培养6批不同批号的hUC-MSC，按I. 5X IO6/瓶细胞接种于T75细胞瓶中，培养体系为IOml培养液。从P2代开始至P6代，每批细胞传代接种48小时后取Iml上清液，用galectin-3 ELISA试剂盒检测上清液中galectin-3的含量(如表I所示)。6批细胞在各代次间差异不显著(P > 0. 05)，各批次和各代次细胞平均值(土标准差)为5. 23 (±0. 45)ng/ml。表I 6批次UC-MSC P2 P6代培养48小时后上清中galectin-3含量
Γ MSCl ] MSC2 Γ MSC3 J MSC4 l' MSC5 [ MSC6 ] Mean [ Std.:
权利要求
1.一种脐带间充质干细胞生物学效カ的检测方法，其特征在于通过检测脐带间充质干细胞培养上清液中galectin-3的含量来判断其免疫抑制效力。
2.根据权利要求I所述脐带间充质干细胞生物学效カ的检测方法，其中所述脐带间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述脐带间充质干细胞生物学效カ的检测方法，其判断标准为人脐带间充质干细胞培养上清液中galectin-3的含量以2. 62ng/ml为阈值，低于此数值的判定为人脐带间充质干细胞免疫抑制效カ不合格。
4.根据权利要求1-3任ー项所述脐带间充质干细胞生物学效カ的检测方法，其中使用ELISA方法检测脐带间充质干细胞培养上清液中galectin-3的含量。
全文摘要
本发明提供了一种脐带间充质干细胞生物学效力的检测方法，其特征在于通过检测脐带间充质干细胞培养上清液中galectin-3的含量来判断细胞的免疫抑制能力强弱，针对性强，定量准确；并且由于不需要消化细胞，可适用于大规模连续脐带间充质干细胞培养时免疫抑制效力的检测。本发明的方法检测样本处理简便，并可使用仪器进行自动或半自动检测。
文档编号C12Q1/68GK102643909SQ20121009680
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者刘广洋, 刘拥军, 徐燚, 朱德琳, 聂艳波 申请人:天津和泽干细胞科技有限公司