专利名称：一种SeTPSP1316启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种启动子及其应用，特别涉及一种SeTPSP1316启动子及其应用。
背景技术：
启动子是DNA上结合RNA聚合酶并形成转录起始复合物的区域。外源基因在转基因动植物体内的表达依靠启动子对其的调控作用，表达量不足往往得不到理想转基因动植物。因此，选择合适的相关启动子是增强外源基因表达首要问题。根据启动子所控制的基因表达范围和方式不同，启动子可以分成组成型启动子和特异性启动子。在组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因动植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。外源基因在动植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响动植物的生长和发育。为了使外源基因在动植物体内有效发挥作用，同时又可减少对动植物的不利影响，近年来人们对特异性启动子的研究越来越重视。随着动植物特异性表达启动子研究的不断改进，现已分离了一些特异性表达基因和增强序列，这些序列能特异性或优先激活从而启动基因的表达，启动子中存在负责特异性表达的顺式作用元件，受外来因素诱导或特定蛋白调控，包括组织特异性启动子和诱导表达型启动子。例如来自烟草的富含羟脯氨酸的糖蛋白(HRGP)基因，尽管其表达水平很低但是根特异性的，在烟草侧根分化诱导过程中，在中柱鞘和内皮层中其启动子表现短时间活跃，特别是后期根发生组织细胞中活性强，属于组织特异性启动子。诱导表达是指动植物细胞由于环境的变化而导致相关基因的表达。动植物体内存在着一套防御机制来对付不良环境，在这个过程中，环境诱导基因启动子起着关键的作用。动物细胞是一种很好的材料，可以用于启动子提高下游基因的表达情况分析。在环境胁迫下，最先受到影响的动物器官是脂肪体，如果将脂肪体诱导型特异性启动子应用于植物抗胁迫基因工程中，使抗性基因在相关细胞中特异表达，这样就能降低能量消耗，使转基因植物在获得抗性的同时，又不影响正常的生长发育，对抗逆、抗病虫的基因工程具有十分重要的意义。
发明内容
本发明目的是提供一种能够调控目的基因高效特异表达于昆虫脂肪体组织的SeTPS1316启动子，并应用于提高昆虫细胞的抗逆能力和植物抗逆基因工程。本发明采用的技术方案是一种SeTPSP1316启动子，所述启动子含有下列任意一组核苷酸序列a、SEQ.ID. NO. I所示的核苷酸序列；b、与SEQ. ID. NO. I所示的核苷酸序列互补的序列；本发明也不排除对上述a或b所述序列进行一个或多个碱基的取代、缺失或修饰的核苷酸序列；或与上述a或b所述序列具有至少90%同源性的核苷酸序列。进一步，所述的SeTPSP1316启动子优选为含有SEQ. ID. NO. I所示的核苷酸序列的
启动子。
一种DNA构建体，所述DNA构建体包含所述的SeTPSP1316启动子以及与之进行可操作连接的基因序列。—种载体,所述载体含有所述的启动子或所述的DNA构建体。一种重组细胞,所述的重组细胞包含所述的启动子或所述的DNA构建体或所述的载体。进一步，所述的重组细胞优选为重组细胞Sf-9、重组细胞Tn_Hi5或重组细胞Se301，更优选为重组细胞Tn-Hi5。—种含有所述的启动子或所述的DNA构建体或所述的载体或所述重组细胞的动物细胞或植物愈伤组织。 进一步，所述的动物细胞优选为粉纹夜蛾细胞(系)Tn_Hi5。所述的SeTPSP1316启动子在动物特异诱导基因工程中的应用。进一步，所述的SeTPSP1316启动子在动物特异诱导基因工程中的应用为将下游基因置于SeTPSP1316启动子下游，构建表达载体，将载体导入动物细胞中，得到较高特异诱导表达的转基因动物细胞，提闻下游基因的表达。更进一步，所述的应用为SeTPSP1316启动子在粉纹夜蛾特异诱导基因工程中的应用将下游基因置于SeTPSP1316启动子下游，构建表达载体，将载体导入粉纹夜蛾细胞中，获得较高特异诱导表达的转基因粉纹夜蛾细胞Tn-Hi5。此外，本发明所述SeTPSP1316启动子还可以应用于植物抗逆基因工程中，具体为将抗逆基因置于SeTPSP1316启动子下游，构建植物表达载体，将载体导入烟草等作物，得到抗逆转基因植物。该基因可以转化烟草、水稻等农作物，提高其抗胁迫能力，具有重大的经济和社会价值。本发明提供的启动子核苷酸序列来自甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)。本发明利用同源克隆和RACE技术获得甜菜夜蛾SeTPS基因上游1316bp序列启动子，其核苷酸如SEQ. ID. NO. I所示，具体方法如下本发明从甜菜夜蛾脂肪体中提取DNA，根据国际基因库(GenBank EU647215)中已经发布的甜菜夜蛾SeTPS基因上游DNA序列，设计引物，序列如下Fl(APl) GTAATACGACTCACTATAGGGCRlCAGAATGTCTAAATTGACAT利用上述引物进行常规聚合酶链式反应(PCR)。将PCR产物与克隆载体(pEASY-T)连接转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后筛选阳性重组子，进行序列测序，根据获得的序列设计引物，引物序列如下F1316 AAAAGCTTCCGAGCTGTGAAACAGTTTTCCR2 AAGGATCCCATGGACGGAGATTGAAGTCG以甜菜夜蛾脂肪体DNA为模板进行PCR扩增，将PCR产物与克隆载体(pEASY_T)连接转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，然后筛选阳性重组子，进行序列测序，得到一个1316bp启动子序列，将该序列命名为SeTPSP1316。该启动子序列SEQ. ID. NO. I信息如下长度1316bp类型核酸
链型 双链来源甜菜夜蛾-1316CCGAGC TGTGAAACAG TTTTCCTAAA ACATAGTAGA TAAATTCGAACGATAAGAGG-1261 CAAATTGCCA AACAGATTAT ATACATTACT ACAAATATTT AATTGTAAGTTCGTTAGTTC-1201 GATATTTAAA TTCGATGCGT TTCTAGATGC ACCTTACAGA TGTCGTTTCTAGAATGTTTA-1141 TTTTTTTAAT TCTCTTTTAT TATACGGCCT CTTTGGTCCA CTTGACGAAAGAGACCCACG-1081 GTTTTAGGAC CCACTGCCAA CTTGAAAGAG AATGTTCTAT TCGGTCGAAGTTGTTATTTT-1021 TTTCATCACT TTTTTTGGTT TGGTACACAA AAGGGCTTCT CGAGAGTGTATAGGTACTTA-961 GTGTATTTTT TAAACATAAT TTTGTTGATA AATCTCATTT AAAAAATATTAGACAATGGG-901 TTTTATATAG CTCTGTAATA TCTAAATTAA GCCCTATTTT ATAAATGAAAAAAGGCTGTG-841 AAGTGAATTT CTGAGCACAT ACCTTTAGTT TTAAAAAGTT ATAGGATTTTTTTAAACGAA-781 TCGAAAAAAT TGATTGTTTT AAAAGTACAC GTATCCTGTA TGCCAGTGTAAACAGCCGGT-721 CCAAGGTTTT TGTAACAATT ACTTGGTCGT TAAGTGAGAA TGTGTTCATGAACCAACGGA-661 ATCATCTTTG TGATATCCAT TCATTAATGA GTTATTAATT ATTTAAAATATAATTGTTTA-601 TGACAATGCC TCGATTAATT TTATTTTTTA AAAGCTTTCT ATACTTTGGATGCAATCAAT-541 AAATCTTTCT GGCCATTTAA TAATAATATT AATATCTAAT AAAGCCTGCTTTTGGTGTGC-481 AGTAAATAAT TGATTCCTTT AGGATTATAC AAGTTAGTAT AGGAGGTATTTGTTTGCGCA-421 ATAAATTCTT TAACCGAATA AACACAACAA ACGTATCCGT CTCAAAATCACTAAAAACAC-361 GTTATCAGTG GCCCAATAAA AAAATAATAT TTATTTTCAT TGGCCCAGTTCTAATTCAAT-301 TTAGTGAACA AAGTTTATAG TTACTCATAG CATTATCAAA TTCTGATACATTCGTCGCAG-241 TCAAGCATCG TGCTTTAATA ATCACAAACA CCGAATTCGC ATTTTCAGTCGGATAAGATG-181 CAAGACAATT CTTGAAGAGA GGTCAATGAG TGATAACCTC TTTACAACGACACCGCGGAC-121 CTCCGCCGCC GCCTCACAGA CGCACGCAAC CACTTCGCCC TTCTGCGACGCGTCTCGCAT-61AGTCTATAAA GGCACCCGAC GCACACAAAA GAAACAGTAC GACTTCAATCTCCGTCCATG-I ATGTCAATTTAGACATTCTGAACAACAGCGCGGGAATACACAACTTTCAAGTTACTTGCG60 ATGACAAAAA启动子序列SEQ. ID. NO. I中负号表示启动子序列，正号表示启动子下游序列。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一种新的SeTPSpl316启动子，具有较高的特异诱导表达活性，能够提高下游基因根特异转录水平；特别在功能基因的研究方面，将能够通过该启动子构建真核表达系统，提高下游功能基因的表达及活性，为动物基因功能在细胞中的应用提供有效的方法，并且将该启动子转入植物中，也能应用于转基因植物抗逆工程。
图lSeTPSP1316启动子在重组细胞中的活性。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此基于昆虫(粉纹夜蛾)细胞Tn_Hi5生长速度快、生活周期短、培养再生能力强和遗传转化效率高等特点，在下述实施例中以粉纹夜蛾的Tn-Hi5细胞为例对本发明进行了详细说明。氨苄LB固体培养基、LB固体培养基、MS培养基、YEP培养基、YEP固体培养基、GIBCO细胞培养基等均为公知常识。实施例I :调控目的基因高效特异表达于昆虫脂肪体组织的甜菜夜蛾SeTPSP1316启动子的克隆I. DNA提取利用动物DNA提取试剂盒(TransGen，Bei jing)提取甜菜夜蛾基因组DNA，作为模板。2. TPS基因上游DNA序列扩增利用引物Fl GTAATACGACTCACTATAGGGC 和 Rl CAGAATGTCTAAATTGACAT 进行 PCR 扩增，体系如下10XBuffer 5 μ L，10mmoL/L dNTP 2 μ L，PCR 引物各 25pmol，DNA 模板
Iμ L (约200ng), Taq酶2U,加灭菌双蒸水至50 μ L。PCR 反应步骤为94°C 预变性 5min ;93°C 变性 30sec，50°C 退火 30sec，72°C 延伸90sec，循环30次；最后72°C延伸lOmin。I %琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒(TransGen, Beijing)回收片段,将所得片段连入pEASY-T载体(TransGen, Beijing)，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(TransGen，Bei jing)，然后利用氨苄LB固体培养基筛选阳性重组子，并进行PCR鉴定，然后进行序列测序，获得一个1350bp序列。3. SeTPS启动子获得利用引物F1316AAAAGC TTC CGA GCT GTG AAA CAG TTT TCC和 R2 AAG GAT CCCATG GAC GGA GAT TGA AGT CG 进行 PCR 扩增，体系如下10 XBuffer 5 μ L, 10mmoL/L dNTP
2μ L，PCR引物各25pmol，DNA模板I μ L(以步骤2获得的1750bp序列为模板)，Taq酶2U，加灭菌双蒸水至50 μ L0PCR 反应步骤为94°C预变性 5min ;93°C变性 30sec，50°C退火 30sec，72°C延伸90sec,循环30次；最后72°C延伸lOmin。I %琼脂糖凝胶电泳,利用胶回收试剂盒回收片段，将所得片段连入pEASY-T载体，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后利用氨苄LB固体培养基筛选阳性重组子，并进行PCR鉴定，然后进行序列测序，获得一个1316bp序列，命名为SeTPSP1316启动子，序列见SEQ. ID. NOl所示。实施例2 :表达载体构建及重组细胞的构建I. PCR扩增根据实施例I分离的SeTPSP1316启动子核苷酸序列，设计引物正向引物5’-GCC GCT AGC CCG AGC TGT GAA ACA GTT-3’划横线部分为NheI酶切位点反向引物5’-GGC CTC GAG TCA GCA CTG TGT TTG TAT TG-3’划横线部分为XholI酶切位点以SeTPSP1316启动子全长测序质粒为模板，利用上述正向和反向引物进行PCR反应，反应条件为及步骤为94°C预变性5min ;93°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸90sec，循环30次；最后72°C延伸IOmin02.阳性重组子取上述PCR产物2 μ L与pEASY-T载体(TransGen，Bei jing)连接转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞(TRANS，北京)，然后在含有氨苄(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜，筛选阳性重组子，进行PCR鉴定，获得阳性大肠杆菌。3.载体的构建利用质粒提取试剂盒(TRANS，北京)提取上述步骤2得到的阳性大肠杆菌的质粒，将质粒用NheI和XholI酶切，与用相同限制酶酶切的荧光素酶报告基因pGL3-Basic表达载体(购买于Promega公司)连接,连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后在含有氨苄(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜，对生长出的菌落进行PCR鉴定和质粒酶切鉴定，获得表达载体pGL3-SeTPSP1316，即荧光素酶报告质粒。4.重组细胞的构建1)粉纹夜蛾细胞株(Tn_Hi5)(中山大学生命科学学院提供)在含体积浓度10%胎牛血清(fetal serum)的Gibico细胞培养基中，27 °C条件下培养48h至细胞长满后，转移到24孔板中27°C培养24h后，可进行转染。2)采用脂质体(lipofectin,购买于invitrogen公司)介导质粒的细胞转染方法进行转染,转染液为在Gibico细胞培养基中加入Iyg荧光素酶报告质粒(pGL3-SeTPSP1316)，0. 5μ g内源参照质粒(pRL-TKControl Vector, Promega),最后加入 I μ I 脂质体(lipofectin,购买于invitrogen公司)，使总体积达到200 μ I,室温(25°C )吹打混勻约15min后,获得转染液。转染前把步骤I)的24孔板中含胎牛血清的细胞培养液倒出，用300 μ I的Gibico细胞培养液清洗两次。再分别将转染液均匀地释放到上述清洗后的24孔板培养的细胞中，每孔释放20μ 1，27°C条件下培养6h后，把孔板中的转染液全部倒出，每孔加入400μ I的含体积浓度10%胎牛血清(fetal serum)的Gibico培养基，在27°C培养48小时后，待细胞长满后吹打收集细胞，获得含表达载体pGL3-SeTPSP1316的粉纹夜蛾细胞Tn_Hi5。每个转染实验
重复三次以上实施例3 SeTPSP1316启动子在重组细胞中活性的测定(I)重组细胞按照实施例2方法分别将表达载体pGL3_SeTPSP1316转染粉纹夜蛾细胞Sf-9(中山大学生命科学学院提供)、粉纹夜蛾细胞Tn-Hi5和粉纹夜蛾细胞Se301(中山大学生命科学学院提供)，培养含表达载体pGL3-SeTPSP1316的粉纹夜蛾细胞Sf-9、含表达载体pGL3-SeTPSP 1316的粉纹夜蛾细胞Tn-Hi 5和含表达载体pGL3-SeTPSP1316的粉纹夜蛾细胞Se301。对照以pGL3_Basic空载(Promega)作为阴性对照替代实施例2中突光素酶报告质粒，PRT-TK(Promega)作为内源参照质粒替代实施例2中内源参照质粒来配制转染液，按照实施例2的方法分别转染粉纹夜蛾细胞Sf-9 (中山大学生命科学学院提供)、粉纹夜蛾细胞Tn-Hi5和粉纹夜蛾细胞Se301 (中山大学生命科学学院提供)作为对照。(2)具体的测定方法为先将含表达载体pGL3_SeTPSP1316的粉纹夜蛾细胞Sf_9、含表达载体pGL3-SeTPSP1316的粉纹夜蛾细胞Tn_Hi5和含表达载体pGL3_SeTPSP1316的粉纹夜蛾细胞Se301培养孔板及各个对照孔板中的培养液全部倒掉，再分别加入200 μ I的Dua I-GI O Luciferase Reagent (Promega)米用 GloMax Multi 多功能检测仪(Promega)测定荧光素酶活性(Luciferase)。测完荧光素酶后，每孔(不需要其他处理)再加入200 μ I的Stop Glo Reagent (Promega)再利用GloMax Multi多功能检测仪测定海肾突光素酶活性(Renilla Luminescence),启动子在重组细胞中的相对活性计算方法为数据分析采用荧光素酶活性的数值除以海肾荧光素酶活性的数值，为最终的活性表达结果。PGL3-B、Sf-9、Η 5和Se301活性进行相对表达分析，其中的最低值为0%，最高值为100%，从而获得相关的数据，结果见图I所示。如图I的结果显示SeTPSP1316启动子在Sf_9细胞中相对活性比较低，而Tn_Hi5细胞转染的SeTPSP1316启动子的相对表达活性最高，为Se301的5倍。根据这些荧光素酶报告基因的检测结果显示，Se301和Tn-Hi5细胞系中，SeTPSP1316启动子能够提高下游PGL3-荧光素酶基因表达活性，具有较高的特异表达能力，这为筛选和提供良好的启动子用于功能基因的研究提供应用价值。同时将SeTPSP1316启动子转入到植物中，将提高其抗胁迫能力，具有重大的经济和社会价值。
权利要求
1.一种SeTPSP1316启动子，其特征在于所述启动子含有下列任意一组核苷酸序列a、SEQ. ID. NO. I所示的核苷酸序列；b、与SEQ. ID. NO. I所示的核苷酸序列互补的序列。
2.如权利要求I所述的SeTPSP1316启动子，其特征在于所述启动子为含有SEQ.ID. NO. I所示的核苷酸序列的启动子。
3.一种DNA构建体，其特征在于所述DNA构建体包含权利要求I所述的SeTPSP1316启动子以及与之进行可操作连接的基因序列。
4.一种载体，其特征在于所述载体含有权利要求I所述的启动子或权利要求3所述的DNA构建体。
5.一种重组细胞，其特征在于所述的重组细胞包含权利要求I所述的启动子、权利要 求3所述的DNA构建体或权利要求4所述的载体。
6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于所述的重组细胞为重组Tn-Hi5细胞。
7.一种含有权利要求I所述的启动子、权利要求3所述的DNA构建体、权利要求4所述的载体或权利要求5所述重组细胞的动物细胞。
8.如权利要求7所述的动物细胞为粉纹夜蛾细胞Tn-Hi5。
9.如权利要求I所述的SeTPSP1316启动子在动物特异诱导基因工程中的应用，其特征在于所述的应用为将下游基因置于SeTPSP1316启动子下游，构建表达载体，将载体导入动物细胞中，获得较高特异诱导表达的转基因动物细胞。
10.如权利要求9所述的SeTPSP1316启动子在动物特异诱导基因工程中的应用，其特征在于所述的应用为SeTPSP1316启动子在粉纹夜蛾特异诱导基因工程中的应用将下游基因置于SeTPSP1316启动子下游，构建表达载体，将载体导入粉纹夜蛾细胞Tn_Hi5中，获得较高特异诱导表达的转基因粉纹夜蛾细胞Tn-Hi5。
全文摘要
本发明公开了一种SeTPSp1316启动子、DNA构建体、载体、重组细胞及所述的SeTPSp1316启动子在动物细胞中的应用，所述启动子含有下列任意一组核苷酸序列a、SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列；b、与SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列互补的序列；本发明SeTPSp1316启动子具有较高特异诱导表达活性，能够提高下游基因在Tn-Hi5和Se301细胞系中的特异转录水平，从而为基因的功能和转基因植物抗逆研究提供应用价值。
文档编号C12N15/63GK102634517SQ201210097399
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者唐斌, 张文庆, 王世贵 申请人:杭州师范大学