专利名称：一种固定化碱性蛋白酶制备大豆多肽的方法
技术领域：
本发明属于大豆多肽提取加工领域，主要涉及一种固定化碱性蛋白酶制备大豆多肽的方法。
背景技术：
大豆肽具有良好的溶解性，在高浓度下黏度低，对热稳定，在酸性条件下不产生沉淀，具有良好的吸湿性与保湿性，具有促进微生物生长代谢等特点，因此可用于生产酸性饮料、营养饮品、高蛋白食品、焙烤食品中，具有软化食品、改善风味、提高产品品质等优点。采用蛋白酶直接在体外进行酶解反应制备肽产品是常用的制肽方法。优点主要是其最佳的温度和pH温和，反应时间及反应程度容易控制，可有效的控制酶解速度，可有效的分裂产生特定的肽。20世纪80年代后，随着发酵工业和基因工程的迅猛发展，酶的制取和提纯工艺日趋成熟，酶的产量和活性也大幅提高，生产成本也急剧降低，此外酶解蛋白质生产的活性肽安全性极高，受到了科研工作者得广泛关注，因此近几年报道的活性肽的制备方法多是酶解法。但是应用蛋白酶直接水解存在不能回收和成本高等缺陷因而在工业上的应用受到了限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种固定化碱性蛋白酶制备大豆多肽的方法，达到酶制剂可重复回收利用、降低成本、酶解过程连续、不需进行灭酶处理、实现连续化的生产的目的。本发明的目的是这样实现的一种固定化碱性蛋白酶制备大豆多肽的方法，所述的方法包括以下步骤(I)将海藻酸钠溶液与碱性蛋白酶经磁力搅拌Ih混匀后，逐滴滴入氯化钙溶液中，形成海藻酸钠固定化碱性蛋白酶，所述的海藻酸钠按重量百分比计，质量分数2. 9-3.3%，氯化钙质量分数2. 8-3.2% ； (2)将海藻酸钠固定化碱性蛋白酶放入填充床反应器中，所述的填充床反应器的填充柱的内径为I. 5cm，柱高30cm;(3)利用蠕动泵将大豆分离蛋白溶液注入填充床反应器进行酶解，所述的大豆分离蛋白溶液质量分数为I %，PH为9-10，酶解温度40-60°C，蠕动泵流量500-900ml/h ； (4)将酶解液离心，取上清液冻干，得到大豆多肽。本发明方法利用固定化酶与生物反应器相结合的方法酶解大豆分离蛋白，不仅保留了蛋白酶原有的优点，而且可反复使用，易与反应液分离，避免杂质混入并具有延长酶的使用期和保管期，具有反应条件温和、能耗低、产物性能佳、生产成本低等优点，同时可获得高质量的大豆肽。
图I 一种固定化碱性蛋白酶制备大豆多肽的方法工艺路线图；图2海藻酸钠浓度对酶活力回收率的影响；
图3 pH对酶活力回收率的影响；图4 CaCl2浓度对酶活力回收率的影响；图5游离酶添加量对固定化酶活力和回收率的影响；图6固定化时间对酶活力回收率的影响；图7各影响因素对固定化酶活力回收率的降维分析；图8 Y = f (X1, X2)的响应面； 图9 Y = f (X1, X4)的响应面；图10 Y = f (X1, X5)的响应面；图11 Y = f (x3, X4)的响应面；图12 pH对大豆分离蛋白水解度的影响；图13水解温度对大豆分离蛋白水解度的影响；图14底物流速对大豆分离蛋白水解度的影响；图15水解时间对大豆分离蛋白水解度的影响；图16 Y = f (X1, X2)的响应面图17 Y = f (X1, X3)的响应面；图18 Y = f (x2, X3)的响应面；
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明。一种固定化碱性蛋白酶制备大豆多肽的方法，所述的方法包括以下步骤(1)将海藻酸钠溶液与碱性蛋白酶经磁力搅拌Ih混匀后，逐滴滴入氯化钙溶液中，形成海藻酸钠固定化碱性蛋白酶，所述的海藻酸钠按重量百分比计，质量分数2. 9-3.3%，氯化钙质量分数2. 8-3.2% ；(2)将海藻酸钠固定化碱性蛋白酶放入填充床反应器中，所述的填充床反应器的填充柱的内径为I. 5cm，柱高30cm ； (3)利用蠕动泵将大豆分离蛋白溶液注入填充床反应器进行酶解，所述的大豆分离蛋白溶液质量分数为I %，PH为9-10，酶解温度40-60°C，蠕动泵流量500-900ml/h ; (4)将酶解液离心，取上清液冻干，得到大豆多肽。海藻酸钠质量分数优选为3.1%。氯化钙质量分数优选为3.0%。大豆分离蛋白溶液pH优选为9. 52，酶解温度优选为50. 5 °C。螺动泵流量优选为730mL/h。实验例I大豆蛋白酶解工艺条件最佳参数的筛选实验I材料与方法I. I材料、试剂大豆分离蛋白哈高科protex 6L喊性蛋白酶丹麦novo公司I. 2主要仪器设备pHS-25型酸度计上海伟业仪器厂
电子分析天平梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司
离心机北京医用离心机厂
磁力搅拌器江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司
循环式水浴锅余姚市东方电工仪器厂
蠕动泵江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司
DU800型紫外分光光度计美国贝克曼库尔特有限公司
电热恒温水浴锅余姚市东方电工仪器厂I. 3实验方法I. 3. I固定化碱性蛋白酶的制备称取一定质量的海藻酸钠于一定pH的硼酸缓冲溶液中，配制成不同质量分数的海藻酸钠溶液。量取一定量的protex 6L碱性蛋白酶,并用硼酸缓冲液稀释。将一定质量分数的海藻酸钠溶液按一定比例与protex 6L混合,充分搅拌均勻后,用螺动泵将混合液以5cm高度注入一定质量分数的CaCl2中形成凝胶珠，放入4°C冰箱中进一步硬化一段时间。得到颗粒均匀、形状规整的海藻酸钠微球。用无菌生理盐水洗涤3 5次，以洗去表面CaCl20取出抽滤，并用滤纸吸干，称总重％，同时测其酶活，剩余的于4°C冰箱保存备用。I. 3. 2单因素试验设计以固定化酶酶活力回收率为评价指标，研究不同海藻酸钠浓度，pH, CaCl2浓度，游离酶添加量，固定化时间对固定化酶效果的影响。I. 3. 3响应面试验设计依据单因素实验结果，以固定化酶活力回收率为指标，利用SAS软件进行响应曲面设计，因素水平表见表I。表I响应面设计因素水平编码表
权利要求
1.一种固定化碱性蛋白酶制备大豆多肽的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤(1)将海藻酸钠溶液与碱性蛋白酶经磁力搅拌Ih混匀后，逐滴滴入氯化钙溶液中，形成海藻酸钠固定化碱性蛋白酶，所述的海藻酸钠按重量百分比计，质量分数2. 9-3.3%，氯化钙质量分数2. 8-3.2% ； (2)将海藻酸钠固定化碱性蛋白酶放入填充床反应器中，所述的填充床反应器的填充柱的内径为I. 5cm，柱高30cm ; (3)利用蠕动泵将大豆分离蛋白溶液注入填充床反应器进行酶解，所述的大豆分离蛋白溶液质量分数为1%，PH为9-10，酶解温度40-60°C，蠕动泵流量500-900ml/h ； (4)将酶解液离心，取上清液冻干，得到大豆多肽。
2.根据权利要求I所述的一种固定化碱性蛋白酶制备大豆多肽的方法，其特征在于海藻酸钠质量分数优选为3. 1%。
3.按照权利要求I所述的一种固定化碱性蛋白酶制备大豆多肽的方法，其特征在于氯化钙质量分数优选为3.0%。
4.根据权利要求I所述的一种固定化碱性蛋白酶制备大豆多肽的方法，其特征在于大豆分离蛋白溶液PH优选为9. 52，酶解温度优选为50. 50C。
5.根据权利要求I所述的一种固定化碱性蛋白酶制备大豆多肽的方法，其特征在于蠕动泵流量优选为730mL/h。
全文摘要
一种固定化碱性蛋白酶制备大豆多肽的方法属于大豆多肽提取技术；该方法将自制的固定化碱性蛋白酶加入到填充床反应器中，将大豆分离蛋白溶液注入填充床反应器进行酶解，经柱层析分离，冻干，得到大豆肽产品；本发明方法利用固定化酶与生物反应器相结合的方法酶解大豆分离蛋白，酶解过程连续，不需进行灭酶处理，实现了连续化的生产，具有反应条件温和、能耗低、产物性能佳、生产成本低等优点，且固定化酶可重复利用，同时可获得高质量的大豆肽。
文档编号A23J3/34GK102613387SQ20121009704
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者李杨, 江连洲, 王梅, 王胜男, 齐宝坤 申请人:东北农业大学