专利名称：转基因大豆a2704-12转化事件的检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因植物检测领域，特别涉及用于检测生物样品中是否存在转基因大豆A2704-12转化事件的方法和试剂盒。
背景技术：
在农业或工业上通过遗传操作成功地向植物中弓丨入在商业上感兴趣的性状是一个依赖不同因素的复杂过程。根据国际农业生物工程应用技术采集管理局(ISAAA )统计，自转基因产品商品化以来，转基因农作物的种植面积已经超过了 I亿公顷。而中国成为第六大转基因作物增长国。随着各国对转基因产品的管理和人们对转基因产品安全性的关注，世界各国纷纷出台相关法规政策，要求对转基因产品进行标识。转基因大豆品系A2704-12是把含有经改造的pat基因的pUC19质粒载体转入大豆后而获得具有对除草剂Liberty 具有抗性的大豆，花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子和终止子序列调控pat基因。A2704-12型转基因大豆是由德国拜耳作物科学公司开发成功的。2008年9月8日，欧盟委员会宣布批准A2704-12型转基因大豆进入欧盟市场的申请，同意将这种大豆用于食品及饲料的生产和加工，其有效期为10年。欧盟委员会在当日发表的一份公报中指出，欧洲食品安全局的评估认为这种大豆“绝对安全”。但欧盟委员会同时指出，根据有关规定，所有含这种大豆的产品都必须在标签中予以注明，以具有可追溯性。目前，拜耳公司开发了一种转基因大豆A2704-12的检测方法(国际公布号为W02006/108674),所述方法基于PCR检测技术，通过测定A2704-12外源DNA区与5’或3’侧翼区的连接区域(转化体特异性检测)的存在来确认转基因事件A2704-12的存在。上述检测方法需要依赖昂贵的仪器，并且，由于其扩增产物为DNA，为了防止DNA造成的实验结果相互污染的问题，在设计实验室场地时，常需要将样品提取、样品扩增和样品检测分布到不同的房间，并且需要严密谨慎小心的操作，这就增加了试验的复杂性。因此，需要开发一种高效、准确、灵敏且简便的检测方法。这对于国家的进出口贸易、转基因安全性以及对于海关、商检、出入境检验检疫部门、食品加工部门来说都是至关紧要需要解决的一个问题。
发明内容
本发明提供了一种检测转基因大豆A2704-12转化事件的方法，该方法包括以下步骤(a)将样品DNA 95°C变性后立即冰置，使用特异性识别A2704-12外源DNA区的特异引物对，在RNA聚合酶的作用下转录生成RNA ;所述引物之一包含所述RNA聚合酶的识别序列；(b)使用上述特异弓I物对，对上述所得RNA进行NASBA扩增，得RNA扩增产物；(c)分别设计捕获探针和检测探针，对上述RNA扩增产物进行检测。所述“外源DNA区”是相对于受体植物内源性DNA区的概念，包括通用元件、经改、造的pat基因和pUC19质粒载体序列。所述A2704-12外源DNA区具有SEQ ID No. I所示核苷酸序列。 在具体实施例中，所述RNA聚合酶为T7RNA聚合酶，所述T7RNA聚合酶的识别序列为 SEQ ID No. 2 所不的 T7promoter 序列。本发明所述引物对优选引物长度为20_28bp，GC含量为30%_40%，扩增长度为120-250bp, Tm值在62-64摄氏度的引物对。优选地，所述引物对分别包含SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示核苷酸序列，特异性识别A2704-12的外源DNA区。在具体实施例中，所述引物对分别为如SEQ ID No. 5和SEQ IDNo. 6所示的核苷酸序列。SEQ ID No. 5所示序列的5’端含有与捕获探针序列具有至少90%相似性的核苷酸序列；SEQ ID No. 6所示序列的5’端包含T7RNA聚合酶的识别序列。上述方法中，所述捕获探针或检测探针可特异性与上述RNA扩增产物杂交。当采用SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列为引物对时，所述捕获探针包含SEQ IDNo. 7所示核苷酸序列，可特异性与RNA扩增产物的5’端杂交；所述检测探针包含SEQ IDNo. 8所示核苷酸序列，可特异性与RNA扩增产物的中间段杂交。上述捕获探针的5’端带有Biotin标记,可通过与Streptavidin相互作用而结合到微孔板上，从而达到捕获RNA扩增产物的目的；所述检测探针的5’端带有地高辛标记(DIG)或Ru标记，分别用于酶联检测或电化学发光检测。本发明的另一个目的是提供一种检测转基因大豆A2704-12转化事件的NASBA检测试剂盒，所述试剂盒包括可特异性识别上述A2704-12外源DNA区的引物对，RNA聚合酶，以及可特异性与上述引物对介导的NASBA扩增产物杂交的捕获探针和检测探针，所述引物之一包含所述RNA聚合酶的识别序列。所述试剂盒，还包含用于NASBA检测的RNA聚合酶、逆转录酶和RNase H。优选地，所述引物对分别包含SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示核苷酸序列。更优选地，所述引物对序列分别如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。当采用SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示核苷酸序列组成的引物对时，所述捕获探针包含SEQ ID No. 7所示序列，所述检测探针包含SEQ ID No. 8所示序列。本发明所述检测方法具有以下优势(I)为等温扩增技术，无需购买大型仪器，从而降低了检测成本；(2)检测产物为RNA，易于降解，从而大大减少了样品间相互污染的问题；(3)简便快捷，易于操作，可应用到田间检测；(4)检测灵敏度高。
具体实施例方式为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例生物样品中转基因大豆A2704-12转化事件的检测一、检测对象(I)阳性对照质粒将SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列构建到pEASY -T3克隆载体所得到的质粒作为阳性对照，所述pEASY -T3克隆载体购自北京全式金生物技术公司(货号为 CT301-02)SEQ ID No. 9所示核苷酸序列是位于A2704— I 2外源DNA区内的待扩增序列；(2)阴性对照以非转基因大豆基因作为阴性对照；(3)空白对照以NASBA水为模板；(4)转基因大豆A2704-12基因组(美国石油化学家学会)。二、试剂转基因植物及深加工产品提取试剂盒(海康生命科技有限公司)、NASBA-MP试剂盒(海康生命科技有限公司)、阳性转基因大豆A2704-12基因组(美国石油化学家学会)。三、引物及探针上游引物(SEQID NO. 5)GA 'I Xi (\4 A ( (j TCGC 'I 'A G ( ( ’ CGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTA 斜体部分为
与捕获探针序列具有90%相似性的序列；下划线部分为可特异性识别A2704-12外源DNA区的序列，即SEQ ID NO. 3所示序列。下游引物(SEQID No. 6)AA TTC 'TAATA ('GA CTCA CTA TAGGGA GAAGG
CTTTGATATTTTTGGAGTAGACAAG斜体部分为T7RNA聚合酶的识别序列，即SEQ ID No. 2所示序列；下划线部分为可特异性识别A2704-12外源DNA区的序列，即SEQ IDNo. 4所示序列。捕获探针(Biotin-SEQID No. 7)BIOTIN-GATGCAAGGTCGCATATGAG检测探针(DIG-SEQID No. 8)DIG-GAAGAAAATCTTCGTCAACATG四、实验方案以下操作所用试剂均由海康生命科技有限公司的NASBA-MP试剂盒提供(引物、探针除外)。(I)基因组DNA的提取使用转基因植物及深加工产品提取试剂盒提取待检大豆基因组。(2)试剂预备按照NASBA-MP试剂盒说明书准备A、扩增试剂的预备试剂球中加入80 μ I试剂球稀释剂、16 μ I KCl和14 μ I NASBA水，振荡混匀。B、酶溶液的预备酶球中加入55 μ I酶稀释液，室温放置至少20min ;用手指轻轻叩击试管，让酶球充分溶解，使用前轻轻离心试管。、C、检测溶液的预备A2704-12检测探针(26μΜ)及捕获探针(26μΜ)解冻至室温；检测浓缩液按1:500在检测缓冲液中稀释。(3)核酸扩增I)取5μ I基因组样品(100-200ng DNA)或NASBA水(空白对照)，加入9. 2 μ I扩增试剂、O.8μ I primer mix (5 μ M each)，95°C变性5min后立即冰上放置3min, 41°C孵育5min ；2)向上述体系中加入5μ I NASBA酶溶液，混匀，41°C，孵育90min ；(4)扩增产物检测I)在支持板框中安放I条微孔板板条；2)在微孔板孔中加入NASBA扩增产物5 μ 1，上述检测探针及捕获探针各I μ 1，杂交缓冲液43 μ 1，混匀，41°C温育I小时。3)倾去溶液，以 250 μ I IXTBS (ΡΗ7. 4)洗三次4)每孔加100 μ I检测液,室温下温育30min5)倾去溶液，以 250 μ I IXTBS (ΡΗ7. 4)洗三次6)微孔加100 μ I连接液，避光温育5min7)微孔加100 μ I终止液终止显色反应8)测定405nm波长处的吸光度。五、实验结果阳性结果的判定测量10个以上的阴性样本，取吸光度平均值，数值大于Mean+IOSD的为阳性样本。根据此方法确定的A2704-12阳性结果判定值为O. 25。检测结果如表I显示，非转基因大豆组的0D405小于阳性结果判定值O. 25，而阳性转基因大豆A2704-12组的0D405值均远远大于阳性结果判定值O. 25，此结果较好地验证了本发明所述方法的准确性与灵敏性。表I.各组扩增产物405nm处吸光度检测值
样品名称_OD4Q5_
空白对照0.14
空白对照0.121
非转基因大豆基因组0.159
非转基因大豆基因组0.11权利要求
1.一种检测转基因大豆A2704-12转化事件的方法，其包括以下步骤 (a)将样品DNA95°C变性后立即冰置，使用特异性识别A2704-12外源DNA区的特异引物对，在RNA聚合酶的作用下转录生成RNA ;所述引物之一包含所述RNA聚合酶的识别序列； (b)使用上述特异引物对，对上述所得RNA进行NASBA扩增，得RNA扩增产物； (c)分别设计捕获探针和检测探针，对上述RNA扩增产物进行检测。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶为T7RNA聚合酶。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述引物对分别包含SEQID No. 3和SEQ ID No. 4所示核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物对序列分别如SEQID No. 5和SEQID No. 6 所示。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述捕获探针包含SEQID No. 7所示序列，所述检测探针包含SEQ ID No. 8所示序列。
6.一种检测转基因大豆A2704-12转化事件的NASBA检测试剂盒，其特征在于，包括特异性识别A2704-12外源DNA区的引物对，RNA聚合酶，以及可特异性与上述引物对介导的NASBA扩增产物杂交的捕获探针和检测探针，所述引物之一包含所述RNA聚合酶的识别序列。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对分别包含SEQID No. 3和SEQID No. 4所示核苷酸序列。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对序列分别如SEQID No. 5和SEQ ID No. 6 所示。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获探针包含SEQID No. 7所示核苷酸序列，所述检测探针包含SEQ ID No. 8所示核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测转基因大豆A2704-12转化事件的方法和试剂盒。该方法先将样品DNA进行高温变性后，使用识别A2704-12特异性区域的引物在RNA聚合酶的作用下转录生成RNA；再以所得RNA为模板，使用上述引物进行NASBA扩增；最后对扩增产物进行检测。该方法无需购买大型仪器，从而降低了检测成本；检测产物易于降解，从而减少了样品间相互污染的问题。
文档编号C12Q1/68GK102634595SQ20121013558
公开日2012年8月15日 申请日期2012年5月3日 优先权日2012年5月3日
发明者于常海, 刘乐庭, 杨滨 申请人:北京大学, 海康生物科技(北京)有限公司