专利名称：一种骨骼肌特异性MYHC-Ⅱa启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种骨骼肌特异性表达基因5'调控区特异性MYHC-Ha启动子及其在转基因猪中的应用。
背景技术：
真核生物基因表达的时间和水平严格按照发育顺序进行。某些特定基因表达模式的调节能够引起转录因子与相关元件的特异性结合，成为转录起始的关键步骤，并最终导致基因的时间和空间表达。编码组织特异蛋白的系列家族基因严格按照组织特异性和发育阶段性表达，为基因表达调控机制提供了很好的研究模式。在转基因动物中，获得能广泛应用的特异性启动子显得非常重要。但启动子的特异性由多个元件控制，在不同种类和不同发育时期起关键作用的调控元件并不相同，调控元件和反式作用因子之间的相互作用也十分复杂。因此要使外源基因能够在动物组织中特异高效地表达，必须构建一个可以特异高效表达的动物表达载体，其中启动子的选择是重要的条件之一。肌球蛋白(myosin)是一组肌肉和非肌肉细胞收缩装置中的蛋白质，具有ATP酶活性。重链的大部分是a螺旋，其头部具有ATP酶活性，并与肌动蛋白结合，而轻链具有激酶活性。肌肉中的肌球蛋白是肌原纤维粗丝的组成单位。头部具有ATP酶活性，属于可与肌动蛋白丝相互作用的马达蛋白质；肌球蛋白也是肌肉的主要组成蛋白质，占肌原纤维总蛋白质的60%。猪的骨骼肌肌球蛋白重链基因MYHC-I、MYHC-IIa、MYHC-IIb, MYHC-IIx都位于12号染色体。其中MYHC-IIa由39个外显子和38个内含子组成，编码1939个氨基酸。通过克隆该基因启动子区并在体外分析其启动特性，利用相关序列构建骨骼肌特异性表达载体是一种有效的方法，但是上述的研究均还处在起步阶段，对于转基因猪的培育和品质提高均没有起到较好的促进作用。
发明内容
基于上述的原因，本发明的发明人经过研究发现猪骨骼肌肌球蛋白重链基因MYHC-IIa基因5'调控区具有骨骼肌特异性启动特性，并利用这一特性设计了一种骨骼肌特异性MYHC-IIa启动子载体，该启动子可以在转基因猪的培育中应用。该启动子载体具有骨骼肌特异性启动特性，而在除骨骼肌外的多种细胞中均无启动活性，可见该启动子在骨骼肌中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，为转基因载体提供了一种重要的元件。本发明所提供的骨骼肌特异性表达基因5'调控区特异性启动子，其基因序列如Seq IDNo 1 所示；除了上述的启动子之外，还可以是该启动子变体或者片段，但均具有如Seq IDNo I所不的基因序列。“变体”是指对猪骨骼肌MYHC-II a启动子Seq ID No :I序列进行一个或者多个碱基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失或者添加所产生的序列，该序列仍然表现出类似于、Seq IDNo :1 DNA序列的活性。“片段”是指基本猪骨骼肌MYHC-II a启动子Seq ID No :1序列的一个或者多个区域，其仍然类似于基本DNA序列的活性。具有上述序列的启动子或其变体，或者片段，具有骨骼肌特异性启动特性，而在骨骼肌之外的多种细胞中均无启动活性，可见该基因启动子在骨骼肌中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，并能应用于转基因猪的培育中。应用上述的启动子时，一般采用重组核酸序列，该序列中含有上述的启动子或其变体，或者片段，这样就可以使于启动子下游的目的基因在骨骼肌中特异性表达，作为分析、开发、改造骨骼肌特性的研究模型。还可以利用已有的分子生物学操作技术获得包含目的基因的重组核酸，通过显微注射等基因导入技术获得转基因胚胎，用于建立转基因动物。重组核酸序列中的目的基因，含有下列的至少一种功能基因，主要包括提高肌肉品质 基因，加快生长速度基因，抗病基因，提高饲料报酬的基因以及生产特定药物的基因，这样就可以在获得骨骼肌特异性启动特性之外，提高该重组核酸序列的性能，为转基因猪的培养提供更多的功能性方向，增加其附加产值，如将去饱和脂肪酸酶基因在该启动子指导下表达可以特异性提高骨骼肌中不饱和脂肪酸的含量，提高肉品营养价值。在获得了上述的重组核酸序列之后，还可以用其建立特殊的表达系统，以便更好的应用于转基因猪的培育过程中。将目的基因重组至该启动子下游，通过基因转入技术使调控区与目的基因共同整合进染色体中，获得转基因动物，在该启动子作用下目的基因仅在骨骼肌中表达，在其他组织器官中不表达，降低目的基因对动物的影响，提高转基因的效果。本发明主要通过报告基因分析确定该启动子的启动特征。首先获得无启动子红色荧光蛋白载体。然后通过PCR或者基因捕获等技术获得骨骼肌中特异性表达的猪骨骼肌肌球蛋白重链II a型5'调控区，长度为2. 07kb，插入红色荧光蛋白上游，得到启动子报告基因分析载体，将CMV启动子(589bp)连入空载体DsRed载体中作为阳性对照，空载体DsRed载体为阴性对照。质粒去内毒素后，转染C2C12小鼠成肌细胞系，同时转染H9c2大鼠心肌细胞和猪肾上皮细胞系PK15为对照，转染24h后更换含马血清的诱导培养基至成肌细胞，诱导细胞分化融合，48h后用倒置荧光显微镜观察红色荧光蛋白表达情况，分析启动子特性。其中之所以选择CMV连入的空载体中作为阳性对照，主要是因为CMV为已知公认的强启动子，将强启动子连入无启动子的载体上游可以启动报告基因RFP的表达，该载体转染如细胞作为阳性对照，可以证明实验中所用的细胞以及转染试剂、转染技术等不存在问题，证明阴性对照无RFP表达是由于没有启动子的存在，而不是其他因素造成。进而更有力的证明连入实验启动子的载体转入细胞后启动RFP的表达是因为该启动子的作用。与现有技术相比，本发明选用了独特的载体DsRed载体(商业载体全称为pDsRed-Express2-lvector),以适应本发明所米用的报告基因RFP(红色突光蛋白)，同时本发明为MYHC-II a特别设计了引物、启动子序列以及酶切位点等供研究其使用，均具有独特的代表性，因此与现有的骨骼肌特异性启动子，相比，本发明的技术具有明显的不同和显著的进步和针对性。当上述的启动子，或者重组核酸序列或者表达系统被应用到转基因猪的培育中后，可以有效的提高培育的效果，且通过添加各种功能性基因，使得转基因猪可以获得更好的肌肉品质，更高的生长速度，更好的抗病性以及降低饲养成本，还可以在特定药物的生产中得到更为广泛的应用，对于该领域的研究有着很好的参考价值。
图I为MYHC-II aF和MYHC-11 aR引物PCR扩增MYHC-11 a启动子片段电泳图，图中泳道I为PCR产物，M为MassRuler Maker ；图2为无启动子的DsRed载体图谱；图3为转染MYHC-IIa promoter DsRed 48h小鼠C2C12细胞照片灰度图，图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，可见RFP表达,MYHC-II a promoter有启动活性；
图4为转染MYHC-II a promoter DsRed 48h大鼠心肌H9c2细胞照片灰度图，图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，无RFP表达,MYHC-II a promoter无启动活性；图5为转染CMV Promoter DsRed 48h猪心细胞照片灰度图，图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，可见RFP表达，转染技术有效；图6为转染MYHC-II a promoter DsRed 48hPK15猪肾细胞照片灰度图，图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，无RFP表达,MYHC-II a promoter无启动活性；图7为转染CMV Promoter DsRed 48hPK15猪肾细胞照片灰度图，图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，可见RFP表达，转染技术有效。
具体实施例方式在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。实施例I启动子报告基因载体的构建基因组提取取大约克夏猪耳组织,按照TIANamp genomic DNA (天根)试剂盒说明书进行基因组DNA提取。无启动子的DsRed载体作为阴性对照；以DsRed为骨架用Sma I (Fermentas)酶切，回收4107bp片段，得到无启动子片段。将完整的CMV启动子正向连入该载体中，得到该载体的阳性对照载体。将包含阴性对照和阳性对照载体的菌液按照I :500的比例分别接种至含卡那霉素100 Ii g/ml LB培养基中,200rpm剧烈摇晃14h。4°C 6000g收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi (QIAGEN)说明书进行,纯化得到的质粒A260/280在I. 8-1. 9之间。根据NCBI (Gene ID :397256)设计如下引物，MYHC-II aF 基因序列如 Seq ID No:2所示，MYHC-II aR基因序列如Seq ID No :3所示，它包含了从转录起始位点下游27bp到上游2042bp的范围。
权利要求
1.一种骨骼肌特异性MYHC-IIa启动子，其特征在于该启动子的基因序列如Seq IDNo 1所示。
2.一种重组核酸序列，其特征在于序列中包含有基因序列如Seq ID No :I所示的启动子或者该启动子的变体，或者片段。
3.根据权利要求2所属的重组核酸序列，其特征在于序列中还包含有至少一种功能基因，所述功能基因包括提闻肌肉品质基因或加快生长速度基因或抗病基因或提闻词料报酬的基因或生产特定药物的基因或其组合。
4.一种表达系统，其特征在于包含有如权利要求2或3所述的重组核酸序列。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种骨骼肌特异性MYHC-II a启动子及其应用，特别提供了一种骨骼肌特异性表达基因5′调控区特异性启动子及其在转基因猪中的应用，该启动子只在骨骼肌中具有启动特性，而在除骨骼肌外的多种细胞中均无启动活性，可见该基因启动子只在骨骼肌中特异性地启动下游基因的表达，因此能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，为通过转基因技术来提高猪肉的品质提供了一种重要的元件。
文档编号C12N15/85GK102676528SQ20121017338
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者姜运良, 季相山, 康丽, 张旭, 王鹏飞 申请人:山东农业大学