专利名称：一种禽流感病毒、灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法及产品，属于生物工程领域。背景研究
禽流感病毒(Avian Influenza Virus，缩写为AIV)隶属于正粘病毒科A型流感病毒属，因为该病毒是AIV负链、分节段的RNA病毒，所以很容易发生变异并不断的突破其感染宿主的种属障碍，引起新的流感流行。自1966年首次在北美的火鸡体内分离到H9N2亚型AIV以来，该亚型的病毒不断传播，目前已在全世界范围的禽群中广泛存在。我国也于1992年首次报道了鸡群中H9N2亚型AIV的感染，H9N2亚型是目前我国鸡群中存在的AIV主要亚型，占禽流感总发病率的90%以上。H9N2亚型禽流感发病后虽然致死率不高(一般不超过30%)，但常导致呼吸道症状，蛋鸡的产蛋下降，并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病，影响家禽生产性能。AIV不仅对我国的养殖业造成了严重的损失，而且对人类健康也构成了威 胁。应用相应血清型的疫苗进行免疫接种是对低致病性禽流感所采取的切实可行的方法。但是，现有技术中，H9N2亚型禽流感疫苗毒株不能满足免疫原性强、交叉保护性好的要求。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种免疫原性强、交叉保护性好的H9N2亚型禽流感病毒HN03株。本发明的另一目的是提供一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗，该疫苗接种后，抗体效价高，对同源病毒攻毒和2011年以来新流行的H9N2亚型禽流感病毒SHOl、H9N2亚型禽流感病毒JX02攻毒保护率达到100%。安全性高、效力稳定，注射后预防效果显著，能很好地控制H9亚型禽流感疾病的发生与流行。本发明的再一目的是提供所述H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法，该方法简单、安全、成本低。本发明的再一目的是提供所述H9N2亚型禽流感病毒HN03株在制备预防和治疗禽流感药物中的应用。本发明所要解决的技术问题是通过以下途径来实现
一种禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/ (H9N2)株，缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株，其保藏登记号为CGMCC NO :6258。一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗，该H9N2亚型禽流感灭活疫苗含有采用3 -丙内酯灭活的H9N2亚型禽流感病毒HN03株。一种所述H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤
(1)制备H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液用H9N2亚型禽流感病毒HN03株接种SPF鸡胚，收获鸡胚液作为H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液；
(2)灭活H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液在H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液中加入3 —丙内酉旨；(3)油相溶液制备将注射用白油和司本一80按照体积比94 6混合混匀后作为油相溶液备用；
(4)水相溶液制备将灭活的H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液和吐温-80按照体积比96 4混合均匀,作为水相溶液备用；
(5)乳化将油相溶液和水相溶液按照体积比2.2 4:1混和均匀，即获得所述H9N2亚型禽流感灭活疫苗。步骤(2)中￠-丙内酯与H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液的体积比为1:1899 1:2099。所述H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液中H9N2亚型禽流感病毒HN03株的含量为 IO8 ci 108_5EID5(i/0. Imlo一种H9N2亚型禽流感病毒HN03株在制备预防和治疗H9N2禽流感药物中的应用。有益效果
(I)H9N2亚型禽流感病毒HN03株免疫原性强、交叉保护性好的。(2)H9N2亚型禽流感灭活疫苗接种后，抗体效价高，对同源病毒攻毒和2011年以来最新流行H9N2亚型禽流感病毒SH01、H9N2亚型禽流感病毒JX02攻毒保护率达到100%。该疫苗安全性高、效力稳定，注射后预防效果显著，保护率高，能很好地控制H9亚型禽流感疾病的发生与流行，显著提高养禽生产的经济效益。(3)本发明制备H9N2亚型禽流感灭活疫苗的方法，简单、安全、成本低。保藏信息如下
保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所。分类命名禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/ (H9N2)株。保藏号CGMCCNO :6258。保藏日期2012年7月2日。为了方便描述，将禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株。
具体实施例方式 实例I H9N2亚型禽流感病毒HN03株的分离与鉴定 I.病料
病料为无菌采集死亡病鸡的心血、肝、脑、肺组织。2.组织触片
将病料作心血涂片及各脏器的病毒组织触片，并进行染色镜检，发现病毒组织触片染色镜检结果为阴性。3.细菌培养
将上述病料，分别用马丁肉汤和绵羊血培养基培养(按现行《中国兽药典》附录方法配制)，结果显示无菌落生长，说明所述病料中不含有细菌。4.病料处理
将上述病料在无菌容器中剪碎、磨碎，用含青链霉素的灭菌生理盐水(每毫升生理盐水含2000单位的青霉素和2000单位的链霉素)作I : 5倍稀释，反复冻融三次后，3000r/min离心20分钟，取上清液保存于_20°C备用。5.病毒分离、接种及收获
将本实施例标题4中获得的上清液，尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，每胚接种量0. 2ml，接种后置37°C条件孵化。接种24小时以内死亡胚弃去，收获24小时以后死亡鸡胚尿囊液，测定尿囊液红细胞凝集价，将红细胞凝集价不低于I : 64的尿囊液置-20°C保存，为鸡胚扩繁的第一代种毒，简称El代种毒。将El代种毒继续传3代，即为E4代种毒，用于病毒生物学特性鉴定。红细胞凝集价采用红细胞凝集试验(微量法)进行检测，具体方法如下在96孔(角度为110° )微量板上，从第I孔至12孔，每孔加入生理盐水30 yl，用加液器吸取含毒尿囊液30 yl，从每排第I孔起，依次作倍比稀释，至11孔，弃去加液器内30 Ul液体，最后I个孔不加作为空白对照。每孔加入1%鸡红细胞悬液30 yl，立即在微量振荡器上摇匀，置20°C室温，20分钟后观察结果，使红细胞完全凝集的最高稀释度，作为判定终点。结果表 明El代种毒的红细胞凝集价为I : 256，E4代种毒的红细胞凝集价为I : 1024。6.血凝抑制试验
将E4代种毒用灭菌生理盐水作I : 256稀释，即为4个血凝单位抗原。分别用购自中国兽医药品监察所的鸡新城疫、鸡产蛋下降综合征、禽流感(H9)、禽流感(H5)标准阳性血清进行血凝抑制试验(参照现行《中国兽药典》中方法)，结果显示被检E4代种毒只可被禽流感(H9)标准阳性血清抑制，其它三种血清均不能抑制，初步说明本株病毒为H9亚型禽流感病毒。7.病毒含量测定
将E4代种毒10倍倍比稀释，取10_7、10_8、10_9三个稀释度，分别通过尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0. 1ml，置37°C孵育120小时。120小时后，逐胚测定红细胞凝集价(方法同前)，以红细胞凝集价不低于I : 16判为感染，按Reed-Muench方法计算病毒含量。结果表明E4代种毒的病毒含量为108 5EID5(i/0. Iml08.静脉致病指数(IVPI)测定
参照二 000年版《中华人民共和国兽用生物制品规程》(以下简称《规程》)附录448页方法进行。结果表明E4代种毒的静脉致病指数为0，表明该毒株为低致病禽流感H9亚型病毒。9.鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD)测定
按《规程》附录447页方法进行。结果表明E4代种毒的鸡胚最小致死量的平均死亡时间为81. 5小时/10_9。10.免疫原性测定
将E4代种毒按常规方法制成含量为108_°EID5(i/0. 3ml的灭活疫苗。按0. 2ml/羽份免疫I月龄SPF鸡10只，另取5只不免疫，作为空白对照。免疫21天后，所有试验鸡采血，分离血清，参照现行《中国兽药典》中方法进行血凝抑制试验。同时对免疫组和对照组进行攻毒，静脉注射E4代种毒IO5 tlEID5tl/只，免疫后第5天逐只用棉拭子采集鸡喉头分泌物，过滤除菌，接种9 10日龄SPF鸡胚，每个样品尿囊腔接种5枚鸡胚，0. 2ml/胚。37°C孵育120小时，测定尿囊液红细胞凝集价。5枚鸡胚中只要有I枚鸡胚的鸡胚液的红细胞凝集价不低于I : 16 (微量法)则判为感染。对病毒感染为阴性的鸡胚，应盲传一次。结果表明，该疫苗按照0. 2ml/羽份剂量免疫后21天，免疫组血清中E4代种毒血凝抑制抗体水平不低于I 128 (微量法)，空白对照组均不高于I : 4 (微量法)，免疫攻毒保护试验结果表明，免疫组10/10病毒分离为阴性，对照组5/5病毒分离为阳性。11.血凝素HA基因及神经氨酸酶NA基因鉴定
由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室进行，鉴定结果为E4代种毒的HA基因(如SEQ ID NO: I所示)属于A型流感病毒H9亚型，NA基因(如SEQ ID NO: 2所示)属于A型流感病毒N2亚型。因此，将该毒株命名为禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株，缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株。将E4代种毒进行保藏。12.对流行毒株的交叉攻毒保护性研究 A/Chinken/Shanghai/01/2011/ (H9N2)(简称 H9N2 亚型禽流感病毒 SHOl )，由上海兽·医研究所2011年于上海分离。A/Chinken/Jiaxing/02/2011/ (H9N2)(简称H9N2亚型禽流感病毒JX02)由南京天邦公司生物技术研究所2011年于浙江嘉兴分离。将H9N2亚型禽流感病毒HN03株按常规方法制成病毒含量为108_°EID5(i/0. 3ml的灭活疫苗，免疫I月龄SPF鸡30只；另取15只I月龄SPF鸡，分为3组，5只/组，不免疫作为空白对照组。免疫后21天，将免疫组随机分成三组，其中一组静脉注射H9N2亚型禽流感病毒HN03株尿囊液攻毒，另一组静脉注射H9N2亚型禽流感病毒SHOl尿囊液攻毒，剩余的一组静脉注射H9N2亚型禽流感病毒JX02尿囊液攻毒；3个空白对照组的攻毒方法同免疫组。攻毒后第5天，逐只用棉拭子采集鸡喉头分泌物，过滤除菌，接种扩10日龄SPF鸡胚，每个样品尿囊腔接种5枚鸡胚，0. 2ml/胚。37°C孵育120小时，测定尿囊液红细胞凝集价。5枚鸡胚中只要有I枚鸡胚的鸡胚液的红细胞凝集价不低于I : 16 (微量法)则判为感染。对病毒分离阴性的样品，肓传一代。结果表明H9N2亚型禽流感病毒HN03株对同源毒及非同源毒保护率均为100%，表明该毒株不但可以针对同源毒提供良好保护，对2011新分离的流行毒株也同样具有良好的保护性。H9N2亚型禽流感病毒HN03株生物学特性研究结果表明，该毒株可在鸡胚中高滴度增殖，血凝效价较高，为I : 1024(微量法)，免疫原性好，能完全抵抗同源病毒攻击，异源攻毒保护率也高达100%。因此可作为H9N2亚型禽流感疫苗候选毒株，用于制备灭活疫苗。实例2本发明H9N2亚型禽流感灭活疫苗安全性试验 制备本发明H9N2亚型禽流感灭活疫苗，具体方法如下
(I)制备H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液用H9N2亚型禽流感病毒HN03株接种SPF鸡胚，收获鸡胚液，取红细胞凝集价为I : 256 1024的鸡胚液作为H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液。该毒液中H9N2亚型禽流感病毒HN03株的含量为108 5EID5(l/0. 1ml。将H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒种用灭菌生理盐水作I : 5000稀释，尿囊腔内接种9 11日龄SPF鸡胚，每胚0. 1ml，接种后密封针孔，置36 37°C继续孵育，不必翻蛋。鸡胚接种后,24小时内照蛋I次，弃去死胚。此后，每4 8小时照蛋I次，直至96小时，死亡的鸡胚随时取出，气室向上，置2 8°C冷却4 24小时。将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚的鸡胚液，取红细胞凝集价为I : 256 I : 1024鸡胚液作为H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液。在H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液中加入抗生素(每毫升抗原中青霉素终浓度800单位，链霉素终浓度800单位)，同时按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。注意在吸取鸡胚液前对每个鸡胚均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液浑浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获。(2)灭活H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液按照P -丙内酯与H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液体积比为1:1999，在119吧亚型禽流感病毒11腸3株毒液中加入￠-丙内酯。具体方法如下将H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液置于无菌灭活罐内，加入3 -丙内酯，随加随搅拌，使其充分混合。之后用无菌压缩空气将其压入另一无菌灭活罐内，置4°C下灭活24小时。期间每隔4小时搅拌I次。停止灭活后，从罐内取样进行灭活检验。
乳化
(3)油相溶液制备将注射用白油和司本一 80按照体积比94 6混合均匀后作为油相溶液备用。(4)水相溶液制备将灭活的H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液和吐温_80按照体积比96 4混合均匀，作为水相溶液备用。(5)乳化将油相溶液和水相溶液按照体积比3 1混和均匀，即获得本发明H9N2亚型禽流感灭活疫苗。具体方法如下将3份油相放入乳化罐内，启动乳化罐搅拌机搅拌，同时徐徐加入水相一份，加完后继续搅拌l(Tl5min，打开均质机进出口开关，启动均质机，使乳化液经均质机进入另一罐，如此反复乳化数次(一般61次)。乳化后取IOml疫苗，以3000r/min离心15分钟,应不出现分层现象。注疫苗的配制过程需无菌操作。为了检验H9N2亚型禽流感病毒HN03株的安全性，按照上述方法制备5批次灭活疫苗。对7日龄SPF鸡、7日龄三黄肉鸡颈背部皮下注射该禽流感(H9亚型)灭活疫苗(HN03株)0. 6ml/只(双倍剂量)，通过观察接种后14天内是否出现由疫苗引起的任何局部和全身反应以及接种后14天、28天疫苗吸收情况，对疫苗安全性进行研究。试验设计用7日龄SPF鸡(购自北京梅里亚维通实验动物有限公司)、7日龄三黄肉鸡(购自南京石佛寺养鸡场)。各批鸡购回后，适应数天，核实鸡的全身状况和临床疾病情况，剔除弱鸡，选择健康鸡进入试验。对SPF鸡分别双倍剂量(0. 6ml/只)量颈背部皮下注射五批本发明H9N2亚型禽流感灭活疫苗，每次设I组不接种，作为对照；对三黄肉鸡分别双倍剂量颈背部皮下注射三批本发明H9N2亚型禽流感灭活疫苗，每次设I组不接种，作为对照。结果7日龄SPF鸡及7日龄三黄肉鸡接种本发明H9N2亚型禽流感灭活疫苗，14日内未观察到临床异常，采食、饮水正常，健康情况良好，未发现由疫苗引起的任何局部和全身反应(见表I)。接种后14天，剖检注射部位90%以上肉眼可见少量粟粒样大小颗粒未吸收完全，注射后28天剖检，大部分接种对象已基本吸收，注射部位未见由疫苗接种引起的异常反应，见表I。因此，本发明H9N2亚型禽流感灭活疫苗双倍剂量接种是安全的。表I接种后14天和28天疫苗吸收检验结果
权利要求
1.一种禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株，缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株，其保藏登记号为CGMCC NO :6258。
2.—种H9N2亚型禽流感灭活疫苗，其特征在于该H9N2亚型禽流感灭活疫苗含有采用β -丙内酯灭活的Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株。
3.—种权利要求2所述Η9Ν2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤 (1)制备Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株毒液用Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株接种SPF鸡胚，收获鸡胚液作为Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株毒液； (2)灭活Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株毒液在Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株毒液中加入β_丙内酉旨； (3)油相溶液制备将注射用白油和司本一80按照体积比94 6混合混匀后作为油相溶液备用； (4)水相溶液制备将灭活的Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株毒液和吐温-80按照体积比96 4混合均匀,作为水相溶液备用； (5)乳化将油相溶液和水相溶液按照体积比2.2 4:1混和均匀，即获得所述Η9Ν2亚型禽流感灭活疫苗。
4.根据权利要求3所述Η9Ν2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤(2)中丙内酯与Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株毒液的体积比为1:1899 1:2099。
5.根据权利要求4所述H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液中H9N2亚型禽流感病毒HN03株的含量为108_° 108· 5EID50/0. Imlo
6.一种H9N2亚型禽流感病毒HN03株在制备预防和治疗H9N2禽流感药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种禽流感病毒、灭活疫苗及其制备方法，属于生物工程领域。本发明禽流感病毒A/chicken/HeNan/03/2009/(H9N2)株CGMCCNO6258，缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株。本发明H9N2亚型禽流感灭活疫苗含有采用β-丙内酯灭活的H9N2亚型禽流感病毒HN03株。制备所述疫苗的方法，制备H9N2亚型禽流感病毒HN03株毒液，灭活，制备成油乳剂。H9N2亚型禽流感病毒HN03株免疫原性强、交叉保护性好的。H9N2亚型禽流感灭活疫苗接种后，抗体效价高。本发明制备H9N2亚型禽流感灭活疫苗的方法，简单、安全、成本低。
文档编号C12R1/93GK102816740SQ20121032072
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月3日 优先权日2012年9月3日
发明者于漾, 揭鸿英, 朱亚露, 何家惠, 邓碧华, 张小飞, 艾玉春, 刘志凌, 顾巍巍 申请人:江苏省农业科学院