专利名称：环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种改进的环介导等温扩增新方法及其在检测贝氏柯克斯体中的应用。
背景技术：
贝氏柯克斯体又称伯纳特柯克斯体(Coxiella burnetti),俗称Q热立克次体,是引起Q热的病原体，属于立克次体科、立克次体族、柯克斯体属，为革兰阴性小杆菌或球杆菌，能通过细菌滤器。电镜观察，伯纳特柯克斯体整个细胞可分为三部分由微荚膜、细胞壁和胞质膜构成的外表层；胞质膜内的含核糖体颗粒的致密外周层；由染色体细丝缠绕而成的中央致密体。系统发育研究表明，贝氏柯克斯体与其他立克次体亲缘关系相距甚远，它属变形菌纲的Y亚群，与肺炎军团菌关系密切。 贝氏柯克斯体的实验室检测常用血清学诊断和病原体分离，但耗时长、检出率不高。因此，国内外都相继将聚合酶链反应(PCR)技术用于其实验室检测的研究，其方式各有差异。
发明内容
针对现有技术存在必须经电泳凝胶成像才可以观察结果，或浊度仪显示的结果信噪比低的问题，本发明的目的在于提供一种具有操作简单、反应快速、耗时短等优点的环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法。为实现上述目的，本发明环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法，包括根据贝氏柯克斯体coml基因序列作为靶序列，比对后选取保守区域，引物设计和合成过程中包括两个外引物和两个内引物的设计和合成，内引物FIP(上端内引物)包含Flc序列和F2(F2c区域的互补序列)，即5' -Flc-F2;内引物BIP (下端内引物)包含Blc (BI区域的互补序列)和B2序列，即5，-B1C-B2。外引物为F3和B3序列，能特异结合靶序列上的6个特异区域。第一组靶基因序列及设计引物位置5 ' -TCCACCATTATTTAGTCAACCACCCAGAAGTTTTAGTAGAAGTATCCCA
GCATTGCAAAAAAAGACAGA^GCGCAACAAGAAGAACAf F3F2
gctcmcmgcmttamgaamtgcamG^TTATT^^^^
Flc
GGCAATGTTACATTGGTTGAATTTT TTCGATTATCAATGBlcB2
TGGCCA TTGCAAA G￡CMGMEI^rMncAAGC. TATCGTGAAACAAAATAAAAACCTCCGCGTTGTCTTCAAAGAACTGCCCATTTTTGGCGGCCAA-3，。
第二组靶基因序列及设计引物位置
5’ -AATACGCTGCCAAA GTATCATTAGCAGCCGCT^AACAAGGAAAATATTA
F3F "I
τγγλγγλγγγγγτγγτγλγτ QJCGACGGCCAATTATCAGATGCTT TCCACGACGCGCTGCTCAGT
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ACAAATCACCC τ「C AA ACCGC AG A A A A AGTAGG ,AJ TAAATGTTGCTCAGCTCAAB Ic
AAAAGACATGGATAATCCTGCT 从[[AM·丛AXAACX TTCCAAT
B 2<-
τα「丫1Tf，λ w'm
η -, ‘■ACAGCTAGCAGGCACCCCGACGTTCGTCATTGGTAATAAAGCGTTA-3’。
B j设计外引物和内引物为下面序列或其全部对应的互补序列第一组
F3 S--Gcattgcaaaaaaagacagaaj
B75 -GCTTGAATAACAGAATTCATGG-3 ■
FIP5 -GTGATGCAGGGTCGTTAAATAATTTGCGCAACAAGAAGAACAC-3 ’
BlP5 -C AGTGGCAGGCAATCCTCATTGGCCACATTGATAATCGA-3’_
LUUl 4」 第二组
Γ35GTATCATTAGCAGCCGCTA -3 ’
B'35 : GTAACGATTGAGCTAATTGGA -3
FIPr 5 '-TTGTTCTGATAATTGGCCGTCGA-CAAGGAAAATATTATGCTTTCCAC-3 -BIP_5,- TCAAACCGCAGAAAAAGTAGGAT-CACGCAGTTGTTTTTGGA-/进一步，所述外引物、内引物优选第一组。进一步，所述外引物内引物=比例范围为I :Γ 12ο进一步,所述外引物:内引物=I 8ο进一步，所述环介导等温扩增温度为58°C 66°C。进一步，所述环介导等温扩增温度为63°C。进一步，所述环介导等温扩增时间为15分钟飞O分钟。进一步，所述环介导等温扩增时间为4(Γ60分钟。进一步，所述非诊断性方法包括步骤①提取基因组DNA :取培养后菌液于EP管，离心，收集后，弃上清，用dH20重悬洗涤细菌，离心，弃上清，重复一次，最后用dH20重悬，沸水浴处理裂解细菌，离心，使细菌蛋白质等杂质沉淀于底部，取上清于EP管，上清即成DNA溶液，_20°C冰箱放置备用或采用基因组DNA提取试剂盒进行提取；②利用所述外引物F3、B3和内引物FIP、BIP、样品基因组NDA、酶、缓冲液配制25 μ L反应体系；③环介导等温扩增。进一步，所述25 μ L反应体系组分如下
权利要求
1.环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法，其特征在干，该非诊断性方法包括 以贝氏柯克斯体coml基因序列作为靶序列，比对后选取保守区域，设计外引物F3、B3和内引物FIP、BIP为下面序列或其全部对应的互补序列
2.如权利要求I所述的非诊断性方法，其特征在于，所述外引物内引物=比例范围为I :4 I 12o
3.如权利要求2所述的非诊断性方法，其特征在于，所述外引物内引物=I:8。
4.如权利要求I所述的非诊断性方法，其特征在于，所述环介导等温扩增温度为58 0C "65 0C ο
5.如权利要求4所述的非诊断性方法，其特征在于，所述环介导等温扩增温度为63°C。
6.如权利要求I所述的非诊断性方法，其特征在于，所述环介导等温扩增时间为15分钟 60分钟。
7.如权利要求6所述的非诊断性方法，其特征在于，所述环介导等温扩增时间为60分钟。
8.如权利要求I所述的非诊断性方法，其特征在于，所述非诊断性方法包括步骤 ①提取样品基因组DNA:取培养后菌液于EP管，离心，收集后，弃上清，用dH20重悬洗涤细菌，离心，弃上清，重复一次，最后用dH20重悬沸水浴处理裂解细菌，离心，使细菌蛋白质等杂质沉淀于底部，取上清于EP管，上清即成DNA溶液，_20°C冰箱放置备用或使用基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取； ②利用所述外引物F3、B3和内引物FIP、BIP、提取的基因组DNA、酶、缓冲液配制25μ L反应体系； ③环介导等温扩增。
9.如权利要求8所述的非诊断性方法，其特征在于，所述25μ L反应体系组分如下
10.如权利要求8所述的非诊断性方法，其特征在于，所述等温扩增采用恒温水浴、PCR、Real-time PCR、LC320浊度仪、Geniell，使用仪器GenieII进行扩增时，试剂中加入SYBR Green I染料再进行扩增；使用所述荧光定量PCR仪进行扩增时，试剂中加入SYBRGreen I染料，进行扩增时选用SYBR通道进行荧光信号收集；试剂中加入钙黄绿素进行扩增时选用FAM通道进行荧光信号收集。
全文摘要
本发明公开了一种环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法，LAMP方法操作简单，反应快速，在恒温条件下进行1小时完成，耗时短实现反应及产物检测一步完成，操作简便，检测成本低。本发明为贝氏柯克斯体的检测提供了新的发展方向，有望成为简易的常规检测手段，尤其适用于基层检验检疫机构，对于提高卫生水平、保证人类生命安全和推动卫生检验事业的发展具有重要的意义。
文档编号C12Q1/68GK102851386SQ20121036774
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者王静, 杨宇, 杨永莉, 刘丽娟, 赵婷婷, 王旺, 王莎莎 申请人:中国检验检疫科学研究院