一种miR-222的靶基因结合序列的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及一种miR-222的靶基因结合序列、重组载体、转化体及其用途。本发明公开了一种含有如SEQ?ID?NO.1所述核酸序列的miR-222的靶基因结合序列，为今后开发其抑制剂药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台和手段，将大大促进miRNA在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。
【专利说明】—种miR-222的靶基因结合序列
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及一种miR-222的靶基因结合序列、重组载体、转化体及其用途。
【背景技术】
[0002]自从1993年Lee等在秀丽新小杆线虫内首次发现miRNA编码基因lin_4、2000年Reinhart等在对线虫的发育调控中发现let_7以来，人们相继在烟草、果蝇、线虫、斑马鱼、哺乳动物与人体中发现并且鉴定几百种miRNA编码基因。
[0003]miRNAs是一种广泛存在的对基因进行微调的分子，约占人类基因组的总基因数2-3%。从结构上来说，miRNAs (microRNAs)是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，约18-24bp，通过与其靶mRNA分子的3端非编码区域(3’ UTR)互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制，从而进一步调控多种生物学行为，如发育的进程、干细胞分化、细胞凋亡、疾病、以及肿瘤发生。
[0004]最初对miRNA表达变化的探讨来自于对B细胞慢性淋巴性白血病(CLL)的研究，其后，众多研究小组在多种人类肿瘤中检测到miRNA的表达变化，因此被认为是发生癌变的共同特征，但是癌症的肿瘤的形成和miRNA表达变化究竟是谁因谁是果尚还没有明确的实验证据。大约50%得到注解的miRNA在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点(fragilesite)，这说明miRNA在肿瘤发生过程中起至关重要的作用。另外，在采用基因芯片技术对来自多种肿瘤组织样本的miRNA表达进行检测发现，一些miRNA表达下调，而另一些miRNA表达上调，这些miRNA所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人员将miRNA命名为 “oncomirs”。
[0005]研究表明 ，miR-222 (Homo sapiens miR-222)在肝癌、前列腺癌组织及胃癌、胶质瘤细胞中表达上调[Wong Qff, Ching AK, Chan AW, et al.[J].ClinCancerRes, 2010，16 (3):867-875 ;Chun-Zhi Z,Lei H, An-Ling Z, et al.[J].BMCCancer,2010, 10:367 ；Galardi S,Mercatelli N, Farace MG, et al.[J].Nucleic AcidsRes, 2011，39(9):3892-3902]
[0006]因此，明确miR-222的靶基因结合序列，对今后开发其抑制剂具有重要意义，将大大促进miRNA在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供miR-222的靶基因结合序列，为今后开发其抑制剂药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台和手段。
[0008]为此，本发明公开了一种含有如SEQ ID N0.1所述核酸序列的miR-222的靶基因
结合序列。
[0009]在一些实施例中，所述靶基因结合序列为如SEQ ID N0.2所述核酸序列。
[0010]在一些实施例中，所述靶基因结合序列为为如SEQ ID N0.3所述DKK2基因3’UTR核酸序列。
[0011]另一方面，本发明公开了一种包含本发明所述靶基因结合序列的重组载体。
[0012]在一些实施例中，所述重组载体含有萤火虫荧光素酶或海洋腔肠荧光素酶报告基因。
[0013]在一些实施例中,所述重组载体为pGL3_promoter载体。
[0014]另一方面，本发明公开了一种包含本发明所述重组载体的转化体。
[0015]在一实施方式中，所述转化体为U87胶质瘤细胞。
[0016]另一方面，本发明公开了本发明所述转化体在筛选miR-222抑制剂中用途。
[0017]本发明公开了 miR-222的靶基因结合序列，为今后开发其抑制剂药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台和手段，将大大促进miRNA在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图lpGL3-promoter 质粒酶切图。
[0019]图2PCR凝胶电泳图。
[0020]图3双荧光酶活性检测。
【具体实施方式】`
[0021]本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明miR-222的靶基因结合序列(多核苷酸)的方法。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。
[0022]用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，多核苷酸和/或载体可用于任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CH0、NS0和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如L细胞))、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例如 F.Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology.Greene PublishingAssociates and Wiley-1nterscience (1992)和 Sambrook et al.(1989)。可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。
[0023]已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。
[0024]含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3’，5’ -核酸外切活性除去突出的Y-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段。然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段与大摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。
[0025]多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体久PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA, UGA 或 UAG)。
[0026]如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培养物而言的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶、新霉素抗性、萤火虫荧光素酶、海洋腔肠荧光素酶；以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于:细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母);昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CHO，COS, NS0, 293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。
[0027]本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞,所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解)蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。
[0028]通过磷酸钙转染、 DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis et al., Basic Methods In MolecularBiology(1986)。
[0029]编码本发明所述miR-222的靶基因结合序列(多核苷酸)可以与含有选择标记的载体连接以在宿主中增殖。一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入质粒载体。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装，再转导至宿主细胞。
[0030]通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明的DNA重组载体的细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细胞，使用如 Southern(1975) J.Mol.Biol.95，503 或 Berent et al (1985) Biotech.3，208 所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。或者，使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。
[0031]为进一步详细描述在本发明的实践中所使用的常规技术，实践者可参看有关细胞生物学、组织结构学以及胚胎学的标准的教科书及评论。包括Teratocarcinomasand embryonic stem cell: A practical approach[E.J.Robertson 编，IRL 出版有限公司，1987] ；Guide to techniques in Mouse Development[P.M.Wasserman 等编，学术出版社，1993] ；Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro[M.V.Wiles, Meth.Enzymo1.225:900，1993] ；Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospectsfor Application to Human Biology and Gene Therapy[P.D.Rathjen等，ReprocL Fertil.Dev.10:31，1998]。
[0032]细胞生物学技术可以在“细胞生物学中的当前方案” [J.S.Bonifacino等，Wiley& Sons ]中找到。与本发明相关的试剂、克隆载体、和基因操作试剂盒可从商业供应商那得至丨J，例如 BioRacU Stratagene、InvitrogeruClonTech 以及 sigma-AIdrich 公司。
[0033]细胞培养方法通常在“动物细胞培养:基本技术手册”最新版本(R.1.Freshney编辑，Wiley & Sons)细胞培养一般技术”(M.A.Harrison和1.F.Rae,剑桥大学出版);和“胚胎干细胞:方法和操作规定” (K.Turksen编辑，Humana出版)中有描述。组织培养基和试剂可从商业供应商那得到，例如 Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma ChemicalC0.、以及 ICN Biomedicals。
[0034]对本发明使用的培养基的类型没有限制，只要可用于干细胞培养的培养基即可。在这类培养基中CO2的浓度优选是5%，但本发明不限于此。
[0035]以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0036] 仪器与试剂
[0037]台式高速冷冻离心机(Eppendorf公司)
[0038]多功能荧光酶标仪
[0039]凝胶成像系统
[0040]台式离心机
[0041]电子天平
[0042]生物电泳图像分析系统
[0043]50 X TAE 溶液
[0044]Agrose
[0045]实施例1.构建 pGL3-DKK2-promoters-basic 质粒
[0046](I)用pGL3-promoter质粒转化常规制备的DH5 a感受态细胞，进行扩增，碱裂解法制备pGL3-promoter质粒，电泳检测质粒的纯度和含量，用XbaI对质粒进行酶切,试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物；
[0047](2)DKK2基因的3' UTR序列的克隆、酶切及纯化
[0048]采用数据库TargetScan5.2，预测DKK2基因的3’UTR序列中的miR-222结合序列如SEQ ID N0.1所述核酸序列，然后设计其引物为
[0049]引物1:5' -GATCGCCGTGTAATTCTAGAGTTTCATTGCCCTCT~3/ ；
[0050]引物2:5' -CGTCGATAACTCTAGACAAAGTCAATAGCTGC-3'；
[0051]以基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增，用试剂盒凝胶回收PCR产物，将回收的PCR产物用XbaI酶切；[0052](3)将上述获得的pGL3-promoter载体和DKK2基因3’ UTR片段进行连接反应；
[0053](4)筛选重组子，将上述连接产物直接转化感受态大肠杆菌，经过含有氨苄青霉素的LB培养基中选择培养，从转化子的平板上随即挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法少量提取质粒备用，经过酶切，PCR扩增结果:目的条带出现在774bp左右，证实已经成功扩增DKK2靶基因(见附图2)、同时经测序鉴定如SEQ ID N0.2所述核酸序列。序列正确的质粒命名为PGL3-DKK2-3’ UTR-promoter 质粒(以下简称 “DKK2-WT”)。
[0054]实施例2.构建含DKK2基因3’ UTR片段突变序列的pGL3-promoter载体
[0055]将DKK23’ UTR中的TGTAGCA中的TAG碱基换成CGA碱基，根据pGL3_DKK2_3’ UTR-promoter质粒序列设计其引物为
[0056]引物3:5，-ACAGAAAGCTTTGCGACAGAATATATTT-3，；
[0057]引物4:5，-CAAATATATTCTGTCGCAAAGCTTTCTGT-3 ’ ;
[0058]以实施例1所制备的pGL3-DKK2-3，UTR-promoter质粒为模板，采用TaKaRaMutanBEST KU，按照试剂盒说明书步骤操作，参照实施例1 (4)的步骤筛选出含DKK2基因3’ UTR片段突变序列的pGL3-promoter载体(以下简称“DKK2_Mut”)
[0059]实施例3.荧光酶活性检测
[0060]用U87胶质瘤细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul，12-24小时贴壁后细胞达到50%左右融合率时进行转染；按照常规技术方法，将DKK2-WT质粒、DKK2-Mut质粒、空pGL3-promoter载体分别联合海肾荧光素酶PRL-SV40质粒共转染U87胶质瘤细胞，形成了 DKK2-WT组、DKK2-Mut 组和 DKK2-Ctrl 组，同时分别加入 miR-222 mimics、miR-222 inhibitor 或等体积培养液(作为空白对照)；转染24小时后进行双荧光素酶检测
[0061]双荧光素酶检测实验步骤:
[0062]1.裂解细胞:将报告基因细胞裂解液充分混匀，按如下方式加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。
[0063]a.对于贴壁细胞:吸尽细胞培养液后可以直接加入报告基因细胞裂解液；对于悬浮细胞:离心去上清后加入报告基因细
[0064]胞裂解液。
[0065]b.充分裂解后，10，000-15, OOOg离心3_5分钟，取上清用于测定。
[0066]注:细胞裂解后可以立即测定荧光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。
[0067]器皿类型96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板
[0068]报告基因细胞裂解液(微升/孔)100 150 200 300 500
[0069]2.融解萤火虫荧光素酶检测试剂和Renilla荧光素酶检测缓冲液，并达到室温。Renilla荧光素酶检测底物(100X)置于冰浴
[0070]或冰盒上备用。
[0071]3. 按照每个样品需100微升的量，取适量Renilla荧光素酶检测缓冲液，按照1:100加入Renilla荧光素酶检测底物(100X)配
[0072]制成Renilla荧光素酶检测工作液。例如，I毫升Renilla荧光素酶检测缓冲液中加入10微升Renilla荧光素酶检测底物[0073](100X)充分混匀后即可配制成约I毫升Renilla荧光素酶检测工作液。
[0074]4.按仪器操作说明书开启荧光测定仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。
[0075]5.每个样品测定时，取样品20-100微升(如果样品量足够，请加入100微升，但每次样品的使用量要保持一致)，加入100微升
[0076]萤火虫荧光素酶检测试剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relativelight unit)。以报告基因细胞裂解液为空白
[0077]对照。
[0078]6.在完成上述测定萤火虫突光素酶步骤后,加入100微升Renilla突光素酶检测工作液，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测
[0079]定RLU (relative light unit)。
[0080]7.在以Renilla荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值除以Renilla荧光素酶测定得到的RLU值。根据
[0081 ] 得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。
[0082]实验结果(图3)，过表达miR-222可下调DKK2的3’ UTR荧光活性，而将miR-222抑制后DKK2的3’UTR荧光活性上调，同时miR-222的改变不会引起空白组和种子序列突变组的荧光活性。，这表明DKK23’ UTR中的TGTAGCA为miR-222结合序列。
[0083]本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的`描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
[0084]序列表
[0085]<110>上海交通大学医学院附属新华医院
[0086]<120> 一种miR-222的靶基因结合序列
[0087]〈130〉说明书序列表
[0088]<160>3
[0089]<170>PatentIn version 3.3
[0090]〈210〉I
[0091]<211>7
[0092]<212>DNA
[0093]<213>Homo sapiens
[0094]〈400〉I
[0095]tgtagca7
[0096]<210>2
[0097]<211>756
[0098]<212>DNA
[0099]<213>Homo sapiens
[0100]<400>2
[0101]gtttcattgc cctctataag cttctgacta gccaatggca tcatccaatt ttcttcccaa 60
【权利要求】
1.一种含有如SEQ ID N0.1所述核酸序列的miR-222的靶基因结合序列。
2.根据权利要求1所述miR-222的靶基因结合序列，其特征在于所述靶基因结合序列为如SEQ ID N0.2所述核酸序列。
3.根据权利要求1所述miR-222的靶基因结合序列，其特征在于所述靶基因结合序列为如SEQ ID N0.3所述DKK 2基因3’ UTR核酸序列。
4.一种包含权利要求1所述miR-222的靶基因结合序列的重组载体。
5.根据权利要求4所述重组载体，其特征在于所述靶基因结合序列为如SEQID N0.2所述核酸序列。
6.根据权利要求4所述重组载体，其特征在于所述靶基因结合序列为如SEQID N0.3所述DKK2基因3’ UTR核酸序列。
7.根据权利要求6所述重组载体，其特征在于所述重组载体含有萤火虫荧光素酶或海洋腔肠荧光素酶报告基因。
8.根据权利要求7所述重组载体，其特征在于所述重组载体为pGL3-pix)m0ter载体。
9.一种包含权利要求4-8中任一项所述重组载体的转化体。
10.权利要求9所述转化体在筛选miR-222抑制剂中的用途。
【文档编号】C12N5/10GK103484453SQ201210378376
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年9月29日 优先权日:2012年6月13日
【发明者】马杰, 李奇峰, 沈克, 许佳明 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院