专利名称：一种产减毒类脂a的大肠杆菌基因工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产减毒类脂A的大肠杆菌基因工程菌，特别是一种无需诱导直接生产减毒类脂A的大肠杆菌。
背景技术：
类脂A可以被宿主细胞表面的Toll样受体4 (Toll Like Receptor 4，TLR-4)识别，继而引发细胞内一系列的生理生化反应，产生TNF-α、IL-6、IL_8等多种炎性细胞因子。细胞因子的种类和数量主要取决于类脂A的结构，因此，某些特殊结构的类脂A可作为疫苗佐剂，非特异性的增强机体对抗原的免疫应答反应，提高疫苗效率。铝佐剂是目前全球公认的广泛应用于人体的疫苗佐剂，安全可靠，可显著增强体液免疫反应，但是对细胞免疫 的效果不够理想。因此，人们致力于开发更加高效安全的疫苗佐剂。MP! ”是由Corixa公司商业化生产的已应用于临床试验的脂质体佐剂，人类临床试验的不良反应频率与铝佐剂一样低，其炎症毒性是LPS的O. 1%。其他医药公司近年来也争相开发减毒的类脂A分子疫苗佐齐U，Avand”公司生产了一种减毒的脂质体佐剂产品LipidA-Purified (699200P)，是5条脂肪酸链(3 ’位无次级脂肪酸链)的单磷酸类脂A结构，其生产方法是从沙门氏菌Salmonel IaMinnesota R595中提取脂多糖，再进行一系列水解、层析、纯化等过程。该生产方法的缺点在于第一、沙门氏菌是致病菌，操作起来比较困难；第二、该方法涉及到化学处理，步骤繁多，影响产品质量和产量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新型的产减毒类脂A的基因工程菌，其生产过程中不涉及致病菌，并且无需诱导剂，可用于减毒类脂A的大规模生产。为解决上述技术问题，本发明提供的基因工程菌为E. coli W3110 Λ IacI Δ IpxMIacZ: :FnlpxE，其基因组中lacl、IpxM发生缺失突变失活，IacZ基因内部敲入表达FnlpxE基因。类脂A自细胞内膜内侧开始合成，合成途径比较保守，但在转运到外膜外侧的过程中可以发生多种修饰，以适应外界环境。目前，与类脂A结构修饰有关的基因及类脂A合成相关基因已有报道。利用这些基因，根据类脂A分子的合成及修饰机理，通过基因工程技术将大肠杆菌中类脂A的结构改造成为5条脂肪酸链单磷酸类脂A结构。具体方法是在野生型大肠杆菌染色体IacZ位点处敲入表达IpxE基因。IpxE来源于弗朗西斯菌，其编码的蛋白质可以水解类脂A分子I位上的磷酸；同时敲除染色体上的IpxM基因，其编码的蛋白质可以在类脂A分子3’位添加十四碳羟基脂肪酸链。为使外源基因在大肠杆菌中组成型表达，敲除染色体上的IacI基因，IacI基因编码Iac操纵子中的调节蛋白，敲除该基因可以解除调节蛋白的阻遏作用。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述基因工程菌生产减毒类脂A的方法。其中发酵方法为常规发酵方法，减毒类脂A的提取方法为将过夜培养的菌液按初始OD6tltl=O. 02转接到200mL LB液体培养基中，37。C培养至OD6tltl=I时8000rpm离心IOmin收集菌体，ddH20洗漆菌体一次后用Bligh-Dyer —相体系(氯仿/甲醇/水，1:2:0. 8, v/v/v)悬浮菌体，磁力搅拌lh,2000rpm离心20min分相,使用一相体系洗漆细胞碎片2_3次；加入27mL12. 5mM的醋酸钠(PH4. 5)溶液，超声震荡10min，100° C水浴30min裂解糖链。冷至室温后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer 二相体系(氯仿/甲醇/水,2:2:1. 8, v/v/v),2000rpm离心IOmin,取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发；最后加入氯仿/甲醇溶液(4:1,v/v)将类脂A洗出。类脂A的检测、分析薄层层析(TLC)检测将样品点于Gel 60TLC板上，展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水(40:25:4:2，v/v/v/v)。层析结束后吹干板上残留的展层剂，用溶于乙醇的10%硫酸进行碳化，置于加热板上显色。
ESI/MS分析类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERS SYNAPTQ-TOF MassSpectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小于m/z2500。
图1野生型大肠杆菌与基因工程菌类脂A TLC分析1:W3110类脂A样品；2:突变株HW003类脂A样品图2基因工程菌类脂AESI/MS分析A:W3110类脂A样品；B:突变株HW003类脂A样品图3野生型大肠杆菌与基因工程菌脂多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264. 7产生IL_6的分析
具体实施例方式实施例1突变株E. coli W3110 Δ IacI的构建UlacI基因敲除片段的获得采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得IacI基因敲除片段，其两端为IacI基因上下游同源臂、中间为kan片段。IacI基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将IacI基因敲除片段克隆到pBlueScript II SK(+)，获得重组质粒 pBlueScript II SK(+)-1acI (U)-pkan-lacl (D)。其中，kan 基因两侧带有 IoxP位点。2、敲除感受态的制备及电转化接种带有Red 重组辅助质粒 pKD46 (Datsenko K A, Wanner B L. One-Stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A, 2000，97 (12) :6640-6645)的大肠杆菌 W3110 (ATCC39936)于含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，30° C，200rpm过夜培养。按2%接种量转接IOOmL LB液体培养基，30° C，200rpm培养至OD6tltl=O. 2时加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导重组酶的表达，继续培养至OD6tltl=O. 5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4° C，8000rpm离心IOmin收集菌体，沉淀用预冷的10%甘油洗涤3次，最后用ImL 10%甘油悬浮,每管80 μ L分装至预冷的无菌EP管中。
将500_1000ng IacI敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1. 5kv电击5ms, 30° C孵育2h，涂布30 μ g/mL卡那霉素的LB固体平板，30° C培养，挑取转化子于含30 μ g/mL卡那霉素及100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，PCR验证结果。3、温敏型表达载体pCRE的构建根据NCBI 数据库中 pSH47(Guldener U, Heck S，Fielder T,BeinhauerJ, Hegemann JH. A new effcient gene disruption cassette for repeated use inbudding yeast. Nucleic Acids Res, 1996，24:2519-2524)载体序列，米用化学全合成或PCR方法获得ere基因克隆到pKD46质粒，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布100 μ g/mL氨苄青霉素的LB固体平板，30° C过夜培养，挑取转化子提质粒酶切验证，得到Cre重组酶温敏型表达载体，并命名为pCRE。
4、突变株抗性标记的去除将PCR验证阳性的菌株接种含30 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，42° C过夜培养，将培养液划线30 μ g/mL卡那霉素的LB固体平板，37 ° C培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为W3110Iac1: :kan并保藏。以此为出发菌株做感受态，转入带有重组酶Cre的温敏型表达载体PCRE,将阳性菌株于含100 μ g/mL氨节青霉素的LB液体培养基中培养,加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导Cre重组酶的表达，介导IoxP位点特异性重组，PCR验证挑选转化子。将PCR验证正确的菌株42° C热激后划线LB平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素及卡那霉素的敏感性，选取对两种抗生素均敏感的菌株命名为W3110 Δ IacI并保藏。实施例2 突变菌株 E. coli W3110 Δ IacI IacZ: :FnlpxE 的构建1、敲入片段FnlpxE-Fkan的获得根据pWSK29-FnlpxE_Fkan (Jiuzhou Chen et al. 2010)序列，人工合成或 PCR 扩增带有lacZ-α天然同源臂的敲入片段FnlpxE-Fkan,其核苷酸序列如SEQ ΙΝΝ0. 2所示。其中，kan基因两侧带有FRT位点。2、敲入感受态的制备及电转化以带有pKD46质粒的W3110 Δ IacI菌株作为出发菌株，制备感受态，方法同前。将500-1000ngFnlpxE_Fkan敲入片段电转入感受态细胞中，通过kan抗性筛选获得染色体IacZ 基因内部敲入表达 FnlpxE-Fkan 的突变株 W3110 Δ IacIlacZ: :FnlpxE_Fkan。3、突变株抗性标记的去除通过转入pCP20 质粒(Cherepanov P P, Wackernagel ff. Gene disruptionin Escherichia col1:TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzedexcision of the antibiotic-resistance determinant. Gene, 1995, 158(1):9-14),42° C热激表达FLP酶，介导FRT位点的特异性重组即可去除kan抗性标记，筛选方法同前，得到的突变株命名为E. coli W3110 Δ IacIlacZ: :FnlpxE并保藏。 实施例3突变株HW003的构建1、IpxM基因敲除片段的获得采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得IpxM基因敲除片段，其两端为IpxM基因上下游同源臂、中间为kan片段。IpxM基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。将IpxM基因敲除片段通过HindIII和SacI克隆到pBlueScript II SK(+)多克隆位点，获得重组质粒 pBlueScript II SK (+) -1pxM (U) -pkan-lpxM (D) 其中，kan 基因两侧带有 IoxpLE/IoxpRE 位点。2、敲除感受态的制备及电转化以带有pKD46质粒的E. coli W3110A IacI IacZ: =FnlpxE菌株作为出发菌株，制备感受态，方法同前。将500-1000ng IpxM敲除片段电转入感受态细胞中，通过kan抗性筛选获得突变菌株 E. coli W3110 Δ IacI IacZ: :FnlpxE IpxM: :Pkan。3、突变株抗性标记的去除转入温敏型表达载体pCRE，加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导Cre重组酶的表达，介导IoxP位点特异性重组，可去除kan抗性标记，筛选方法同前，得到的突变株命名为HW003并保藏。 实施例4突变菌株HW003的类脂A结构分析1、突变菌株HW003的类脂A提取及薄层层析(TLC)分析类脂A的提取采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法。将过夜培养的菌液按初始OD600=O. 02转接到200mL LB液体培养基中，37。C培养至0D_=1时8000rpm离心IOmin收集菌体，ddH20洗漆菌体一次后用Bligh-Dyer —相体系(氯仿/甲醇/水，1:2:0. 8, v/v/v)悬浮菌体，磁力搅拌lh, 2000rpm离心20min分相,使用一相体系洗漆细胞碎片2_3次。加入27mL 12. 5mM的醋酸钠(PH4. 5)溶液，超声震荡lOmin，100° C水浴30min裂解糖链。冷至室温后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer 二相体系(氯仿/甲醇/水,2:2:1. 8,v/v/v), 2000rpm离心IOmin,取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发。加入氯仿/甲醇溶液(4:1,v/v)将类脂A洗出。接着进行薄层层析(TLC)检测，将样品点于Gel 60TLC板上，展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水(40:25:4:2，v/v/v/v)。层析结束后吹干板上残留的展层剂，用溶于乙醇的10%硫酸进行碳化，置于加热板上显色(图1)。TLC结果显示野生型大肠杆菌类脂A (泳道I)结构比较单一，为双磷酸形式，突变株HW003的类脂A (泳道2)结构也非常单一，为5条脂肪酸链单磷酸形式，说明突变菌株可以产生单一结构的减毒类脂A。2、类脂A结构的ESI/MS分析类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERS SYNAPT Q-TOF MassSpectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小于m/z 2500(图2)。野生型大肠杆菌类脂A结构为双磷酸形式，m/z值为1797.2，提取过程中会造成少量I位磷酸基团丢失；减毒类脂A结构是3’位无次级脂肪酸链的单磷酸类脂A，m/z值为1507. 1,MS结果显示突变株HW003可以产生结构非常单一的类脂A。实施例5突变菌株HW003脂多糖(LPS)毒性分析1、突变菌株HW003LPS的提取及纯化LPS的提取采用热酚法。将过夜培养的菌液按初始OD6tltl=O. 02转接到800mL LB液体培养基中，37° C培养12小时后8000rpm离心IOmin收集菌体，ddH20洗涤菌体一次后称量菌体湿重，每3g湿菌体溶于IOmL ddH20中，68°C预热。加入等体积预热的90%苯酚，68°C剧烈振荡I小时。低温冷却后，4°C, 4000rpm离心20分钟,上清液用ddH20透析三天以去除苯酚，真空冷冻干燥得到LPS粗品。粗品用适量ddH20重悬后，加入RNase A(终浓度50 μ g/ml ^PDNase I (终浓度100 μ g/ml)37°C处理2小时，再加入蛋白酶K (终浓度100 μ g/ml)37°C处理过夜。酶处理后的样品中加入5mL水饱和苯酚，混匀，4000rpm离心30分钟，上清液用ddH20透析一天，真空冷冻干燥得到LPS。将LPS复溶到氯仿/甲醇溶液(2:1，v/v),涡旋振荡30秒，12000rpm离心10分钟，移除上清，沉淀复溶在水中，真空冷冻干燥得到LPS纯品。2、LPS刺激小鼠巨噬细胞白血病细胞RAW264. 7后产生白介素-6 (IL_6)的分析RAW264. 7接种于96孔板，每孔105个细胞，37°C，5%C02培养12小时后，细胞贴壁，换新鲜培养液，加入不同浓度LPS (终浓度分别为10、100、1000ng/ml)，刺激24小时后取上清液，使用ELISA试剂盒(eBioscience，88-7064)检测IL-6含量(图3)。野生型大肠杆菌W3110和突变菌株HW003利用最小显着差法进行了差异分析，**P〈0. 01。由于突变菌株类脂A结构的改变，包括I位磷酸基团和3’位次级脂肪酸链的缺失，使得RAW264. 7细胞产生的IL-6显著下降，削弱了炎症反应，因此，突变菌株HW003产生的类脂A结构具有减毒的效果，可应用于后续疫苗佐剂的开发。
本发明构建的菌株避免了使用致病菌生产类脂A，同时保持了类脂结构的单一，更有利于大规模工业化生产。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
权利要求
1.一种产减毒类脂A的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌lacl、IpxM 发生缺失突变失活，IacZ基因内部敲入表达FnlpxE基因，所述减毒类脂A为5条脂肪酸链的单磷酸类脂A结构。
2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤O将人工构建的IacI敲除片段转化E. coli W3110,获得突变株E. coli W31 IOlac1: :Pkan，通过位点特异性重组去除卡那霉素抗性基因；2)FnlpxE-Fkan片段电转入步骤I)制备的E.coli W3110 Δ IacI感受态细胞中，获得 E. coliff3110 Δ lacl IacZ: :FnlpxE_Fkan,再次通过位点的特异性重组去除其中的卡那霉素抗性基因。3)将人工构建的IpxM敲除片段电转入步骤2)制备的E.coli W3110 Δ IacIlacZ: :FnlpxE感受态细胞中,获得突变株E. coli W3110 Δ IacIlacZ: :FnlpxE lpxM: :Pkan，再次通过位点的特异性重组去除其中的卡那霉素抗性基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述IacI敲除片段的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述IpxM敲除片段的核苷酸序列如SEQID NO. 3所示。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述FnlpxE-Fkan片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
6.权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于步骤I)步骤3)所述的位点特异性重组为Cre酶介导的IoxP位点特异性重组。
7.权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于步骤2)所述的位点特异性重组为FLP酶介导的FRT位点特异性重组。
8.权利要求1所述基因工程菌应用于减毒类脂A的生产。
全文摘要
本发明公开了一种产减毒类脂A的大肠杆菌基因工程菌，其lacI、lpxM发生缺失突变失活，lacZ基因内部敲入表达FnlpxE基因，所述减毒类脂A为5条脂肪酸链的单磷酸类脂A结构。本发明构建的菌株在保持类脂降低了生产成本，其生产过程中不涉及致病菌，并且无需诱导剂，可用于减毒类脂A的大规模生产。
文档编号C12P9/00GK102994436SQ20121042143
公开日2013年3月27日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者王小元, 韩雅宁, 陈久洲, 李烨 申请人:江南大学