1,3-专一性脂肪酶、其编码基因序列及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种1,3-专一性脂肪酶、其编码基因序列及其用途。具体而言，本发明涉及一种1,3-专一性脂肪酶基因序列，其编码(i)具有SEQ?ID?NO:2所示氨基酸序列的蛋白质；或具有1,3-专一性脂肪酶活性的(i)的衍生蛋白。本发明还涉及具有SEQ?ID?NO:2所示氨基酸序列的1,3-专一性脂肪酶或其具有1,3-专一性脂肪酶活性的衍生蛋白。本发明的重组脂肪酶具有良好的1,3-专一性，可广泛应用于粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业、造纸工业或药物合成等。
【专利说明】1,3-专一性脂肪酶、其编码基因序列及其用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程和酶工业领域。更具体而言，本发明涉及一种1，3-专一性脂肪酶、其编码基因序列及其用途。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(E.C.3.1.1.3)，亦称酰基甘油水解酶，是一类具有多种催化能力的酶，其可催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯类的水解，还可以催化酯交换反应、醇解反应、转酯化及酯类的逆向合成反应，以及生物表面活性剂的合成、催化旋光异构体的拆分和手性药物的合成等。
[0003]在产业中，脂肪酶被广泛应用于粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业、以及药物合成等许多领域，是重要的工业酶制剂
之一 O
[0004]脂肪酶催化反应位置专一性是指反应底物甘油三酯中的Sn-1 (或Sn-3)和Sn_2位酯键的识别和水解的反应性。微生物脂肪酶作用于底物三脂酰甘油的方式因酶的类型而异，具有1,3位置专一'丨生的脂肪酶如米黑根毛霉(Mucor miehei)、戴尔根霉(Rhizopusdelemar)等产生的脂肪酶。具有1，3_位置专一性脂肪酶可用于结构油脂生产、特殊脂肪酸、单甘酯的合成以及立体选择性化学合成和拆分，在工业生产中具有巨大的应用潜力。
[0005]在加快对微生物脂肪酶研究与开发的同时，积极拓展微生物脂肪酶应用领域具有一定的迫切性。然而，现有技术中也只有涉及紧密枝顶胞霉脂肪酶发酵生产的研究、培养基的改良等方面，未见紧密枝顶孢霉脂肪酶基因的研究。
[0006]因此，获得新型1，3专一`性脂肪酶基因，并利用基因工程技术进行重组表达，开发相应脂肪酶，具有重要的工业价值和意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的:提供一种新型脂肪酶的基因序列，该基因在黑曲霉中重组表达，所得的重组脂肪酶具有较好的1，3-专一性，可广泛应用于粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业、造纸工业或药物合成等。
[0008]在本发明的第一方面中，提供了一种1，3-专一性脂肪酶基因序列，所述序列编码:
[0009]⑴具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白质；或
[0010](ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有1，3-专一性脂肪酶活性的由(i)衍生的蛋白质。
[0011]在一些优选例中，所述蛋白质与SEQ ID NO:2的蛋白质有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的序列相同性。
[0012]在另一些优选例中，所述基因源自保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC、保藏号为CGMCC4420的紧密枝顶孢霉菌株。[0013]在本发明的一些实施方式中，所述基因序列选自:
[0014](i’)具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的序列；和
[0015](ii’)在严格条件下与(a)限定的序列杂交、且编码具有1，3-专一性脂肪酶活性的多肽或蛋白质的序列。
[0016]在一些优选例中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的序列有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的序列相同性。
[0017]在本发明的另一些实施方式中，所述序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0018]在本发明的第二方面中，提供了一种1，3-专一性脂肪酶，所述脂肪酶的序列选自:
[0019](a)具有SEQ ID NO:2所不氣基酸序列的蛋白质；
[0020](b) (a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有1，3-专一性脂肪酶活性的由(a)衍生的蛋白质；和
[0021](c) (a)或(b)中蛋白质的活性片段或其保守性变异蛋白。
[0022]在本发明的一些实施方式中，所述脂肪酶的序列如SEQ ID N0:2所示。
[0023]在一些优选例中，所述(b)中包含I~10个、I~8个、I~6个、I~4个、I~2个或I个氨基酸残基的取代、缺失或添加。
[0024]在另一些优选例中，所述1，3-专一性脂肪酶源自保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC、保藏号为CGMCC4420的紧密枝顶孢霉菌株。
`[0025]在本发明的第三方面中，提供了一种包含本发明的基因序列或脂肪酶的载体。
[0026]在一些优选例中，所述载体选自一29、卩("0丨(1'\ pETk、pPic9k或pMA5。
[0027]在本发明的第四方面中，提供了一种宿主细胞，其包含本发明的基因序列、脂肪酶或体。
[0028]在一些优选例中，所述宿主细胞选自:曲霉、里氏木霉、大肠杆菌、枯草杆菌、酵母(例如毕赤酵母、啤酒酵母)。
[0029]在另一些优选例中，所述宿主细胞是用权利要求6所述的载体转化的黑曲霉细胞。
[0030]在本发明的第五方面中，提供了一种生产1，3-专一性脂肪酶的方法，所述方法包括:在适合本发明的宿主细胞产生本发明的脂肪酶的条件下，培养所述宿主细胞；以及，分离由所述宿主细胞产生的所述脂肪酶。
[0031]在一些优选例中，所述培养的过程是发酵生产过程。
[0032]在另一些优选例中，所述培养的温度为20~60°C、25~50°C或30~40°C。
[0033]在另一些优选例中，所述培养的pH为7~9、7.5~8.5或7.8~8.2。
[0034]在另一些优选例中，所述方法还进一步包括对分离的脂肪酶进行纯化、冻干、包装和/或储存的步骤。在另一些优选例中，所述储存的温度为10~55°C、15~50°C或20~40°C。在另一些优选例中，所述储存的pH为6~9.5、7~9或7.5~8.5。
[0035]在本发明的第六方面中，提供了一种进行脂肪酶催化反应的方法，所述方法包括:
[0036](A)使本发明的脂肪酶、宿主细胞、或用本发明所述方法生产的1，3-专一性脂肪酶与反应体系接触；以及[0037](B)在适宜所述脂肪酶进行催化的条件下，进行催化反应。
[0038]在另一些优选例中，所述脂肪酶或宿主细胞是分散的、或固定化的。
[0039]在另一些优选例中，所述反应体系用于选自下组的反应:水解反应、酯交换反应、醇解反应、转酯化反应、酯类的逆向合成反应、生物表面活性剂的合成反应、催化旋光异构体的拆分反应、手性药物的合成反应。
[0040]在另一些优选例中，所述反应用于粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业、造纸工业或药物合成。
[0041]在另一些优选例中，所述反应的温度为20~60°C、25~50°C或30~40°C。
[0042]在另一些优选例中，所述反应的温度为20°C、2TC、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27 °C >28 °C >29 °C >30 °C >31 °C >32 °C >33 °C >34 °C >35 °C >36 °C >37 °C >38 °C >39 °C >40 °C >41 °C >42 °C >43 °C >44 °C >45 V、46 °C >47 °C >48 °C >49 °C >50 °C >51 °C >52 °C >53 °C >54 °C >55 °C >56 V、57。。、58。。、59。。、60。。。
[0043]在另一些优选例中，所述反应的pH为7~9、7.5~8.5或7.8~8.2。
[0044]在本方面的第七方面中，提供了本发明的基因序列、脂肪酶、载体、宿主细胞在脂肪酶催化反应中的应用。
[0045]在另一些优选例中，所述脂肪酶或宿主细胞是分散的、或固定化的。
[0046]在另一些优选例中，所述反应体系用于选自下组的反应:水解反应、酯交换反应、醇解反应、转酯化反应、酯类的逆向合成反应、生物表面活性剂的合成反应、催化旋光异构体的拆分反应、手性药物的合成反应。
[0047]在另一些优选例中，所述反应用于粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业、造纸工业或药物合成。
[0048]在另一些优选例中，所述反应的温度为20~60°C、25~50°C或30~40°C。
[0049]在另一些优选例中，所述反应的温度为20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27 °C >28 °C >29 °C >30 °C >31 °C >32 °C >33 °C >34 °C >35 °C >36 °C >37 °C >38 °C >39 °C >40 °C >41 °C >42 °C >43 °C >44 °C >45 °C >46 °C >47 °C >48 °C >49 °C >50 °C >51 °C >52 °C >53 °C >54 °C >55 °C >56 V、57。。、58。。、59。。、60。。。
[0050]在另一些优选例中，所述反应的pH为7~9、7.5~8.5或7.8~8.2。
[0051]在本发明的第八方面中，提供了一种脂肪酶制剂，其包含:
[0052]a)本发明的脂肪酶或用本发明的方法制备的脂肪酶；
[0053]b)包装物；和
[0054]c)任选的，可接受的辅料。
[0055]在一些优选例中，所述脂肪酶以粉末、溶液、颗粒、酶片、分散体、胶体、固定化酶、胶囊、或膜反应器形式存在。
[0056]在另一些优选例中，所述可接受的辅料选自:缓冲剂、填料、固定化载体、溶剂或分散基质、赋形剂。
[0057]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。并且，本领域普通技术人员可对本文中所述的各种特征和方面进行有效的组合，这些组合仍然在本申请所要求保护的范围之内。【专利附图】
【附图说明】
[0058]下面结合附图对本发明作进一步说明，其中以下附图显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
[0059]图1:PCR扩增保守区间片段；
[0060]图2 =RACE扩增结果:泳道1:3’ -RACE结果；泳道M:DL2000分子量标记；泳道2:5' -RACE 结果；
[0061 ] 图3:黑曲霉表达载体pAZ9 ；
[0062]图4:以黑曲霉转化子基因组DNA为模板，PCR扩增紧密枝顶孢霉脂肪酶基因的检测:泳道I:DL2000分子量标记；泳道2: λ HindIII标记；泳道3 =PCR验证结果(1.2kb)；
[0063]图5:紧密枝顶孢霉重组脂肪酶纯酶活性与反应温度的关系曲线；
[0064]图6:紧密枝顶孢霉重组脂肪酶纯酶活性与反应pH值的关系曲线；
[0065]图7:紧密枝顶孢霉重组脂肪酶纯酶稳定性与温度的关系曲线；
[0066]图8:紧密枝顶孢霉重组脂肪酶纯酶稳定性与pH值的关系曲线；
[0067]图9:水解物中1，3-DAG的相对含量随时间变化；
[0068]图10:水解产物中1，2 (2，3) -DAG的相对含量随时间变化；
[0069]图11:水解产物中2-MAG的相对含量随时间变化。
[0070]菌种保藏
[0071]本发明中所使用的紧密枝顶孢霉(Acremonium strictum)菌株2823于2010年12月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC4420。关于该菌株的详情可参见中国专利申请号201110446326.3。
【具体实施方式】
[0072]本发明人经过长期而深入的研究，从紧密枝顶孢霉菌株CGMCC4420中获得了紧密枝顶孢霉脂肪酶基因序列，并采用基因工程方法使得该基因序列在合适的宿主细胞(如黑曲霉)中重组表达，并获得了相应的重组脂肪酶。本发明人进一步对该重组脂肪酶的性质进行了鉴定，结果表明该重组脂肪酶具有1，3-专一性，且在常规温度和pH下具有高活性和高稳定性，适于工业应用。在此挤出上，本发明人完成了本发明。
[0073]发明人进一步在patentLens、DDBJ, EMBL和NCBI等数据库中展开检索，在专利US20090325240和DDBJ中检索到与本发明SEQ ID NO: 2的氨基酸序列同源性最高的序列，即编码玉蜀黍赤霉脂肪酶氨基酸序列，但其同源性也仅为63%，而其核苷酸片段与本发明SEQ ID NO:1的核苷酸序列同源性更低，仅为6.4%。EMBL中的结果也来源于玉蜀黍赤霉的序列，但该序列为染色体上的序列，没有具体功能说明；在从^1等数据库文献检索中，未发现与紧密枝顶孢霉脂肪酶有显著同源性的相关核酸序列的报道。由此，进一步证明了本发明基因和脂肪酶序列的独特性。
[0074]如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上
由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”
属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0075]可对本发明提到的 特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0076]本发明的脂肪酶编码基因
[0077]如本文所用，术语“脂肪酶基因”、“1，3-专一性脂肪酶基因”或“脂肪酶编码序列”可互换使用，均是指编码本发明所述的脂肪酶或其衍生蛋白或活性片段的核苷酸序列。所述基因可为具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的序列、在严格条件下与SEQ ID N0:1序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的基因分子，所述基因表达本发明的具有1，3-专一性的脂肪酶。
[0078]如本文所用，术语“严格条件”是指:(I)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2 X SSC, 0.1%SDS, 600C ;或⑵杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll，42°C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上时才发生杂交。例如，所述序列可为具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的序列的互补序列，例如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的互补序列。
[0079]本发明的脂肪酶基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0080]应理解，本发明的 脂肪酶基因最初获自保藏号为CGMCC4420的紧密枝顶孢霉菌株。与初始基因具有高度同源(如具有50%以上，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上，更优选85%以上如85%、90%、95%、甚至98%、99%以上序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。
[0081]本发明的脂肪酶
[0082]如本文所用，术语“本发明的脂肪酶”、"1,3-专一性脂肪酶”、“本发明的重组脂肪酶”可互换使用，是指具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质或其同源蛋白，或这些蛋白质具有脂肪酶活性的变异或修饰形式、活性片段等。例如，所述脂肪酶可选自:(a)SEQ IDNO:2的氨基酸序列；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有1，3-专一性脂肪酶活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。
[0083]本发明的蛋白质或多肽可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、曲霉、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等)中产生。
[0084]本发明蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的脂肪酶或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有1，3-专一性脂肪酶活性。
[0085]可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获得上述(b)中的蛋白质或多肽。可利用编码所述蛋白质或多肽的编码序列来构建转基因生物。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括脂肪酶的活性片段和活性衍生物。
[0086]该多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与脂肪酶编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗脂肪酶的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含脂肪酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白质外，本发明还包括了脂肪酶的可溶性片段。通常，该片段具有脂肪酶序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。
[0087]载体和宿丰
[0088]本发明还涉及包含脂肪酶基因的载体以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞。
[0089]通过常规的重组DNA技术(例如Science，1984 ；224:1431)，可利用本发明的编码序列可用来表达或生产重组的脂肪酶。一般来说有以下步骤:
[0090](I)用本发明的编码脂肪酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0091](2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；和
[0092](3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质或多肽。
[0093]本发明中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、动物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可`以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
[0094]本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含脂肪酶编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本发明中可使用pAZ^pColif、pET\pPic9k或pMA5等载体。
[0095]此外，表达载体可任选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如绿色荧光蛋白(GFP)或四环素或氨苄青霉素抗性等。
[0096]包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如动物细胞。代表性例子有:黑曲霉、大肠杆菌、链霉菌属、农杆菌等；真菌细胞如酵母，如毕赤酵母、啤酒酵母等。在本发明中，优选采用黑曲霉细胞作为宿主细胞。
[0097]在上面的方法中的重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
口 ο
[0098]酶制剂
[0099]本发明还提供了一种酶制剂，所述制剂含有有效量的本发明的脂肪酶或其编码序列、包装物、和任选的可接受的辅料。
[0100]如本文所用，术语“可接受的”是指适用于脂肪酶的保存和使用，不会过分影响酶促反应及其产物的物质，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量”是指可产生所需功能或活性的、且可在酶促反应中被接受的量。
[0101]本发明的辅料是本领域普通技术人员所熟知的，包括但不限于:缓冲剂、填料、固定化载体、溶剂或分散基质、赋形剂、助流剂。
[0102]本发明酶制剂中的脂肪酶可为粉末、溶液、颗粒、酶片、分散体、胶体、固定化酶、胶囊或膜反应器形式。如果本发明的酶制剂是固体制剂，则可在使用前，根据需要将所需量的本发明酶制剂分散或溶解在适当的溶剂或反应体系中。
[0103]本发明酶制剂的保存温度通常为10~55°C、15~50°C或20~40°C，保存的pH通常为6~9.5、7~9或7.5~8.5。如果本发明的酶制剂是固体形式，则其对温度和pH的要求通常低于相应的液体制剂。使用本发明酶制剂的反应的温度可为20~60°C、25~50°C或30~40°C ;反应体系的pH可为7~9、7.5~8.5或7.8~8.2。
[0104]本发明的酶制剂中脂肪酶或其编码序列有效成分占组合物总重量的0.001~99.9wt% ;优选为组合物总重量的I~95wt%，较优选为5~90wt%，更优选10~80wt%。余量为辅料等物质。
[0105]应理解，所用脂肪酶或其编码序列的有效量可随待施用的反应体系、反应效果、反应速度等而变化。可由本领域普通技术人员根据具体情况来检测、判断和/或决定所述有效量。
[0106]本发明脂肪酶的应用
[0107]本发明的脂肪酶可用于需要其进行催化的各种反应中，这些反应包括但不限于:水解反应、酯交换反应、醇解反应、转酯化反应、酯类的逆向合成反应、生物表面活性剂的合成反应、催化旋光异构体的拆分反应、手性药物的合成反应等。由于本发明的脂肪酶具有1，3-专一性，其尤为适用于需要1，3-专一性的反应中，例如在定向酯交换中，将廉价的油脂经过改性变成高利用价值的油脂。
[0108]本发明的脂肪酶可用于粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业、造纸工业或药物合成等，具有广泛的应用前景。
[0109]本发明的优点
[0110]1.本发明揭示了一种1，3_专一性脂肪酶及其编码序列，为本领域提供了的新的可供选择的材料；
[0111]2.应用分子生物学和基因工程技术可提高脂肪酶的产量，降低脂肪酶的生产成本，简化下游的加工； [0112]3.本发明的脂肪酶可广泛应用于多种催化反应中，且具有高专一性、稳定性，具有广泛的工业应用前景。
[0113]实施例[0114]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
[0115]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。以下实施例中所有试剂都可来源于市售，例如，本发明所用的培养基成分均可购自国药集团化学试剂有限公司。
[0116]除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0117]出发菌株来源、选育、鉴定和保藏
[0118]1.采样:
[0119]分别在烟台和青岛海岸采集83个样品，包括沙滩土样、沙滩沙、朽木、海洋动物尸体、海边腐朽的海草、海带、海菜、海岸岩石表层、海岸边的沟泥以及饭店前的沟泥等。
[0120]2.培养基配制:
[0121]平板分离培养基(%，以重量百分数计算):豆粉0.5、蛋白胨0.5、KH2PO40.1、Na2HPO40.1、MgSO40.01，pH6.5，蒸馏水配制)121°C灭菌30分钟后，在上述成分中再加0.4%
的甘油丁酸三酯，制备成平板分离培养基。
[0122]脂肪酶筛选发酵培养基(％，以重量百分数计算):豆粉2.0、鱼油2.0、KH2PO40.2、Na2HPO40.2、MgSO40.01、CaCl20.2，蒸馏水配制)。每IOOmL三角瓶中加发酵培养基20mL(pH6.0)，121°C 灭菌 30 分钟。
[0123]营养肉汁琼脂培养基(%，以重量百分数计算):蛋白胨1.0、牛肉浸取物0.3、NaCl0.5、琼脂1.5、ρΗ7.0，蒸馏水配制。
[0124]PDA培养基(％，以重量百分数计算):葡萄糖2.0、琼脂1.5、余量为马铃薯浸出液，自然pH。其中马铃薯浸出液配制:取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1.0升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液用水补足至1.0升。
[0125]3.菌种平板初筛:
[0126]在IOmL试管中，加入2mL液体分离培养基，0.2g采集的样品，28° C摇床震荡培养24-48小时。取发酵液少许，划线接种在平板分离培养基)上，28° C培养，随时观察，生长2-3天后，挑选产透明圈的菌落。接种到营养肉汁琼脂培养基或PDA培养基中，其中细菌接到营养肉汁琼脂培养基斜面，霉菌接到PDA培养基斜面。菌种再进行平板划线分离，挑选菌落小透明圈大的菌落，接种到斜面培养基。
[0127]4.菌种摇瓶发酵复筛:
[0128]对于细菌，从营养肉汁琼脂培养基斜面取半耳环菌体，对于霉菌，从PDA培养基斜面切3毫米左右大小的菌块，分别接种于250ml摇瓶中，摇瓶中含有20ml发酵培养基，28° C培养，在接种后24小时、48小时、72小时取样，常规氢氧化钠碱滴定法(QB/T1803-1993脂肪酶测定方法)测定脂肪酶活力，获得初筛活力达10-50U/mL菌种，并将菌种保存在试管斜面。
[0129]5.菌种初步编号和鉴定:
[0130]依据上述方法，在青岛海岸曾长有海蛎子的岩石上的第28号样品中，分离出第23个菌落，经检测在平板上具有明显的水解透明圈，摇瓶发酵复筛检测，具有较强的脂肪酶水解活力，故编号2823，命名为紧密枝顶孢霉2823。
[0131]委托中国科学院微生物研究所菌种保藏管理委员会普通微生物中心(即中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC，北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)对该菌种进行鉴定，鉴定结果为紧密枝顶孢霉，拉丁学名为=Acremoniumstrictum。
[0132]将紧密枝顶孢霉菌株2823于2010年12月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC4420。关于该菌株的详情可参见中国专利申请号 201110446326.3。
[0133]实施例1.1 紧密枝顶孢霉脂肪酶基因的克隆
[0134]通过分子生物学方法从紧密枝顶孢霉菌株CGMCC4420中克隆出1，3_专一性脂肪酶基因lipAS，具体步骤如下:
[0135]1.脂肪酶基因保守序列的获得
[0136]设计并合成用于扩增脂肪酶基因保守序列的PCR引物Blip-1和Blip-2，其序列分别如下:
[0137]Blip-KSEQ ID NO:3):5，-GTS(C/G)GTS(C/G)CTCGCCTTCCGCGG-3’
[0138]Blip-2(SEQ ID NO:4)`:5' -GCCGCACCAGR(A/G)CTR(A/G)TGR(A/G)CC-3'
[0139]序列中的S(C/G)及R(A/G)，括号中的内容是指括号外的简并碱基的可能情况。
[0140]米用Promega 公司 SV 总 RNA 分离系统试剂盒(SV Total RNA IsolationSystemKit, Cat#Z3100)提取紧密枝顶孢霉总RNA,并使用Fermentas公司反转录试剂盒第一链cDNA 合成试剂盒(First Strand cDNA Synthesis Kit, Cat#K1611)对紧密枝顶抱霉总 RNA进行反转录。以反转录得到的cDNA为模板，以引物Blip-1和Blip-2为引物对，进行PCR扩增，具体条件如下:
[0141]反应体系(总体积为50 μ I):EasyTaq DNA聚合酶(北京全式金生物技术有限公司)1μ 1，缓冲液 5μ 1，模板 1μ 1，(1ΝΤΡ4μ 1，上、下游引物各 1μ 1，(ΜΗ2037 μ I。
[0142]反应过程:95°C5min ；95°C 30s, 53°C 30s, 72°C 60s, 30 个循环；72°C IOmin0
[0143]对获得的PCR产物进行琼脂糖电泳检测(图1)，回收后测序，测序结果显示获得的PCR产物符合预期，为IipAS基因保守区间的序列。
[0144]2.全长脂肪酶基因IipAS的获得
[0145]根据获得的IipAS基因保守区间的序列，设计并合成用于扩增全长基因的PCR引物up-1、up-2和down-1、down-2,其中，up-1与up_2用于扩增保守区间序列的上游片段，down-Ι与down-2用于扩增保守区间序列的下游片段，其序列分别如下所示:
[0146]up-1 (SEQ ID NO:5):5’-GTGACAATTGCGCAGTGCAT-3’
[0147]up-2 (SEQ ID NO:6):5’-GCTCAAGTCCACGACCGTAT-3’
[0148]down-1(SEQ ID NO:7):5’-CGCAACGAGTTTCCCACGCT-3’
[0149]down-2(SEQ ID NO:8):5’-GATGTTCCGCCGAGTGAGGT-3’[0150]按照Ambion公司提供的FirstChoiceS RLM-RACE试剂盒(AM1700)所示的方法，分别进行3' -RACE与5’ -RACE以得到IipAS的侧翼序列(图2)。将侧翼序列与保守区间的序列拼接后得到全长脂肪酶基因lipAS，其核苷酸序列如SEQ IDN0:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
[0151]将紧密枝顶孢霉脂肪酶IipAS的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列在DDBJ中检索，与本发明SEQ ID N0:2的氨基酸序列同源性最高的序列，即编码玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)的三酰基甘油脂肪酶(triacylglycerol lipase)氨基酸序列，但其同源性仅为63%，而其核苷酸片段与本发明SEQ ID N0:1的核苷酸序列同源性更低，仅为6.4%。在NCBI等数据库文献检索中，未发现与紧密枝顶孢霉脂肪酶有显著同源性的相关核酸序列的报道。
[0152]实施例2.1 紧密枝顶孢霉脂肪酶基因在黑曲霉中重组表达
[0153]1.基因lipAS的克降
[0154]根据lipAS全长基因序列，设计并合成扩增引物qh-lipl与qh_lip2,其序列如下所示:
[0155]上游qh-lipl (SEQ ID NO:9):
[0156]5’-AAActgcagATGCGGCATCCGCAGTCTCT-3’
[0157]下游qh_lip2(SEQ ID NO: 10):
[0158]5’-CCaagcttTTAATGGTGGTGATGATGGTGTAACTCATCGCCATTCACG-3’
[0159]其中，在引物qh-lipl与qh_lip2上分别引入PstI和HindIII酶切位点(如下划线所示)。下游qh-lip2引入6XHis-tag标签(ATGGTGGTGATGATGGTG，如黑体所示)。
[0160]从紧密枝顶孢霉菌中提取总RNA并进行反转录。以反转录得到的cDNA为模板，以引物qh-lipl与qh_lip2为引物对，进行PCR扩增，具体条件如下:
[0161]反应体系(总体积50 μ I):NEB Phusion?高保真 DNA 聚合酶(Cat#M0530S) I μ I,缓冲液5μ 1，模板1μ 1，(1ΝΤΡ4μ 1，上、下游引物各1μ 1，纯水37μ I。
[0162]反应过程:95°C5min ；95°C 30s，56°C 30s，72°C 90s，30 个循环；72°C IOmin0
[0163]2.重组表达载体的构建与转化
[0164]将米曲霉烯醇化酶启动子(GenBank:D63941.1，起始密码子前520bp序列)中的顺式作用兀件(cis-acting element) regionIII 序列(gtcgtgtcgggcatttatcgggggatggaccaatcagcgtagg)进行12个重复串联,从而构建enoA-cis启动子。
[0165]以pSP72 (Promega, Catalog#P2191)为骨架，把 enoA-cis 启动子插入 BamHI 和PstI酶切位点中，glaA终止子插入HindIII和XhoI酶切位点中，获得表达载体为pAZ9，载体见图3。
[0166]PCR扩增LipAS基因片段后经PstI和HindIII酶切，然后与同样经PstI和Hindi 11酶切的黑曲霉表达载体pAZ9进行连接构建好的重组质粒pAZ_l ipAS与p3SR2按原生质体转化方法共转化黑曲霉3.795 (CGMCC，编号:3.795)，获得黑曲霉重组表达菌株。
[0167]3.重组菌株表达产物的鉴定与性质分析
[0168]3.1表达产物鉴定
[0169]用获得的重组菌株所产生的表达产物脂肪酶，命名为LipaseAS，催化对硝基苯棕榈酸酯(PNPP)进行水解反应，以鉴定表达产物的脂肪酶活性。[0170]pNPP比色法检测脂肪酶酶活，其原理是:脂肪酶在一定温度和pH条件下，水解底物pNPP，生成黄颜色的对硝基苯酚。在一定的浓度范围内，生成对硝基苯酚的量和反应液的410nm处吸光值，呈线性关系。据此可以通过测定反应液的410nm吸光值计算脂肪酶活力。
[0171]测定方法具体如下:
[0172]溶液A:将0.03g pNPP溶于IOml异丙醇，4°C保存备用。
[0173]溶液B:pH8.0，50mM磷酸钠缓冲液(其中另添加2.3g/L的脱氧胆酸钠，1.lg/L的阿拉伯树胶粉)。
[0174]使用时将溶液A与溶液B按1:9的体积比混合，配成底物反应液，每2mL离心管加Λ 600 μ L底物反应液，40°C预热5min。每离心管加入25 μ L粗酶液，混匀，在40°C水浴锅内反应15min,立即加入无水乙醇500 μ L终止反应。12000rpm离心2min,在410nm测吸光值。以硝基苯酚系列浓度测定的吸光度，制定标准曲线。
[0175]脂肪酶I个酶活单位的定义:每分钟释放I μ mol对硝基苯酚所需的酶量。在催化反应过程中有明显的黄绿色产物生成，表明重组菌株所产生的表达产物可以催化对硝基苯酚酯生成对硝基苯酚。
[0176]同时，以重组菌株基因组DNA为模板，以qh-lipl与qh_lip2为引物对，可以扩增出紧密枝顶孢霉脂肪酶基因，测序结果表明此基因序列与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列一致，表明目的基因已成功转化入黑曲霉中(见图4)。
[0177]3.2重组脂肪酶的 发酵及纯化
[0178]按照如下配方配制所需试剂:
[0179]黑曲霉发酵培养基(w/v):葡萄糖2%，淀粉10%，TSB (胰酪胨大豆肉汤)4%，柠檬酸钠 7%, (NH4)2SO4L 5%, NaH2PO4.H2O0.1%，MgSO4.7Η200.1%，Tween800.07%, *1000 X 微量元素液 0.1%(ν/ν)，**100 X 铁盐 1%(ν/ν)；
[0180]*1000X 微量元素液(w/v):ΚΙ0.83%，H3BO30.62%，MnSO4.4Η202.23%，ZnSO4.7Η200.86%, Na2MoO4.2Η200.025%, CuSO4.5Η200.0025%, CoCl2.6Η200.0025% ；
[0181]**100 X 铁盐(w/v) =FeSO4.7Η200.278%, Na2.EDTA0.373%。
[0182]接种IO7个的黑曲霉孢子到50mL黑曲霉发酵培养基中，28°C，200rpm发酵培养144h后取样。离心收集的发酵液上清经过Miradoth? (Calbiochem, Cat#475885)过滤后即获得粗酶液。粗酶液经过镍柱HisTrap HP (GE，CodeN0.17-5247-01)纯化与脱咪唑后得到了纯化的脂肪酶。以纯化后的脂肪酶进行以下实施例中的酶学性质分析。
[0183]实施例3.重组脂肪酶的酶学性质分析
[0184]1.反应温度对紧密枝顶孢霉重组脂肪酶纯酶酶活的影响
[0185]分别在20°C、30°C、40°C、5(rC、6(rC下按实施例2中所述的pNPP方法测定纯酶脂肪酶活力，以最高酶活为相对酶活，计算其它温度下纯酶的相对活力。
[0186]实验结果如图5所示。该结果表明LipaseAS在25_45°C范围内有较高的酶活，最适反应温度为40 °C。
_7] 2.反应pH值对'紧密枝顶孢霉重组脂肪酶纯酶酶活的影响
[0188]分别在pH值为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液中按实施例2中所述的pNPP法测定脂肪酶纯酶活力，以最高酶活为相对酶活，计算其它pH值下纯酶的相对活力(pH值
6.0-9.0为磷酸氢二钠-磷酸氢二钾缓冲液；pH值9.0-10.0为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)。[0189]实验结果如图6所示。该结果表明LipaseAS对反应pH值的变化具有一定敏感性，pH为7.0-9.0，优选7.5-8.5范围内有较高的酶活，而最适pH值为8.0。
[0190]3.保存温度对紧密枝顶孢霉重组脂肪酶纯酶稳定性的影响
[0191]将纯酶液分装于不同的反应管中，于20°C、30°C、40°C、50 V、60 V保温一小时后按实施例2中所述的pNPP方法测定脂肪酶纯酶活力，以不经保温处理所测的脂肪酶纯酶酶活为相对酶活，酶活测定反应温度均为40°C。
[0192]实验结果如图7所示。该结果表明LipaseAS在50°C以下相对稳定，只在高于50°C时酶活才表现出较大损失。
[0193]4.保存PH值对紧密枝顶孢霉重组脂肪酶纯酶稳定性的影响
[0194]将纯酶液分别在不同pH值(pH值6.0-10.0)的缓冲液体系中4°C保温24h后按实施例2中所述的pNPP方法测定脂肪酶纯酶活力，以不经保温处理所测的脂肪酶纯酶酶活为相对酶活。
[0195]实验结果如图8所示。该结果表明LipaseAS的最佳保存pH值是8.0,当保存在PH值6.0-9.0范围内时，酶活稳定性较好。
[0196]5.HPLC分析紧密枝顶孢霉重组脂肪酶纯酶一一 LipaseAS水解反应的1，3专一性
[0197]取0.1U的脂肪酶与乳化后的橄榄油底物(橄榄油:4%聚乙烯醇=1:3，高剪切乳化机乳化3min，静止lmin，再乳化3min)进行水解反应，精确控制反应时间X (X=0.25,0.5、
1、2、5、10、20、35分钟)，反`应结束时用乙醇终止反应，并用正己烷萃取反应产物，最后通过HPLC-ELSD检测水解产物。
[0198]HPLC检测条件如下:
[0199]仪器:AgilentllOO，配Grace3300ELSD ；
[0200]色谱柱:Alltimasilica250mmX 4.6mmX 5 μ m ;
[0201]柱温:30O;
[0202]进样量:20yL;
[0203]Grace3300ELSD参数:漂移管温度90°C，雾化器流量:2L/min ；
[0204]增益因子:2 ；
[0205]流动相梯度洗脱程序:见表1
[0206]流动相A:正己烷
[0207]流动相B:正己烷:异丙醇:乙酸乙酯:10%甲酸(V/V)=80:10:10:1
[0208]表1流动相梯度洗脱程序
[0209]
时间(min)流速(mL/min)流动相A 流动相B
O2982
826535
8?52298
Τδ2298
【权利要求】
1.一种1，3-专一性脂肪酶基因序列，所述序列编码: (i)具有SEQ ID NO:2所不氣基酸序列的蛋白质；或 (?)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有1，3-专一性脂肪酶活性的由(i)衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的基因序列，其中，所述基因序列选自: (i，)具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的序列；和 (ii’)在严格条件下与(a)限定的序列杂交、且编码具有1，3-专一性脂肪酶活性的多肽或蛋白质的序列。
3.如权利要求1或2所述的基因序列，其特征在于，所述序列为SEQID N0:1所示的核苷酸序列。
4.一种1，3-专一性脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶的序列选自: (a)具有SEQID NO:2所不氣基酸序列的蛋白质； (b)(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有1,3-专一性脂肪酶活性的由(a)衍生的蛋白质；和 (c)(a)或(b)中蛋白质的活性片段或其保守性变异蛋白。
5.如权利要求4所述的脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶的序列如SEQID N0:2所示。
6.一种包含权利要求1 ~3中任一项所述的基因序列或权利要求4~5中任一项所述的脂肪酶的载体。
7.—种宿主细胞，其包含权利要求1~3中任一项所述的基因序列、权利要求4~5中任一项所述的脂肪酶或权利要求6中所述的载体。
8.—种生产1，3-专一性脂肪酶的方法，所述方法包括:在适合权利要求7所述的宿主细胞产生如权利要求4~5中任一项所述的脂肪酶的条件下，培养所述宿主细胞；以及，分离由所述宿主细胞产生的所述脂肪酶。
9.一种进行脂肪酶催化反应的方法，其特征在于，所述方法包括: (A)使权利要求4~5中任一项所述的脂肪酶、权利要求7中所述的宿主细胞、或用权利要求8所述方法生产1，3-专一性脂肪酶与反应体系接触；以及 (B)在适宜所述脂肪酶进行催化的条件下，进行催化反应。
10.权利要求1~3中任一项所述的基因序列、权利要求4~5中任一项所述的脂肪酶、权利要求6中所述的载体、权利要求7所述的宿主细胞在脂肪酶催化反应中的应用。
11.一种脂肪酶制剂，其包含: a)权利要求4~5中任一项所述的脂肪酶或用权利要求8所述的方法制备的脂肪酶； b)包装物；和 c)任选的，可接受的辅料。
【文档编号】C12N1/21GK103805617SQ201210448438
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2012年11月9日
【发明者】佟小雪, 毛爱军 申请人:丰益(上海)生物技术研发中心有限公司