Ros1融合基因检测的pcr引物、试剂盒和液相芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了检测ROS1融合基因的PCR引物、试剂盒和液相芯片。所述液相芯片包括：PCR扩增引物；由tag序列和特异性引物组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对C6;R32的SEQ?ID?NO.34，针对C6;R34的SEQ?ID?NO.35、针对C5;R34的SEQ?ID?NO.36、针对S2;R32的SEQ?ID?NO.37、针对S4;R32的SEQ?ID?NO.38、针对S4;R34的SEQ?ID?NO.39、针对SL13;R32的SEQ?ID?NO.40、针对SL4;R34的SEQ?ID?NO.41、针对E10;R34的SEQ?ID?NO.42、针对L16;R35的SEQ?ID?NO.43、和/或针对T5;R35的SEQ?ID?NO.44；微球。本发明所述的液相芯片具有非常好的信号-噪声比，可一步完成11种融合亚型的扩增，且特异性引物具有非常好的特异性。
【专利说明】ROS1融合基因检测的PCR引物、试剂盒和液相芯片
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及ROSl融合基因检测PCR引物、试剂盒和液相芯片。
技术背景
[0002]v-ros UR2肉瘤病毒癌基因同源物I ( v-ros avian UR2sarcoma viral oncogenehomolog I，ROSl)，1987年Rabin M.克隆出与v_ros肉瘤生长有关基因，并命名为ROS基因。ROSl基因在第32，34和35个外显子处存在断点，可以与多种基因发生融合。ROSl融合基因被证实为新的肺癌驱动基因，在肺腺癌的形成中发挥着重大作用。在2012年6月举办的第48届美国临床肿瘤学会(ASCO)的年度会议中，美国麻省总医院Shaw首次报道了关于肺癌新分子靶点ROSl基因融合患者的I期临床试验，临床试验证明ROSl融合是一类新的肺癌分子亚型，且药物克唑替尼(crizotinib)对此类肺癌非常有效。本发明主要就ROSl融合基因检测作了研究。
[0003]目前，与ROSl相关的融合基因研究较多的主要有CD74-R0S1.、SDC4-R0S1、SLC34A2-R0S1、EZR-R0S1、LRIG3-R0SI 和 TPM3-R0S1 融合基因。vl) CD74-R0S1 融合基因
[0004]CD74 即 MHC-1I 类分子相关恒定链(major histocompatibility complexI1-associated invariantchain, Ii),主要表达于树突状细胞、单核巨曬细胞、B细胞等抗原提呈细胞(antigen presentingcells, APC),是在内质网中与新合成MHC-1I类分子连接在一起形成九聚体的辅助分子，属II型膜分子，与抗原提呈功能有关。研究还发现，CD74分子还在内皮细胞、肿瘤细胞表达，与相应疾病的发生、发展有关。血管内皮细胞是位于血管内壁的单层细胞，具有分泌血管活性物质、参与炎症细胞和免疫细胞游走、维持血管舒缩等多方面生物学功能。目前研究表明，CD74基因第6个外显子易与ROSl基因发生融合，该融合基因检测的发生率为1%。⑶`74-R0S1融合基因对克唑替尼(crizotinib)药物具有敏感性。
[0005]2) SDC4-R0S1 融合基因
[0006]多配体蛋白聚糖-4(Syndecan-4简称SDC4)是由硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素链组成，属于跨膜蛋白聚糖家族，可与多种肝素类生长因子结合充当复合受体，调节信号转导，同时，SDC4作为细胞结构的组成成分，还参与细胞间、细胞与细胞外基质间的黏附、生长因子结合和活化、大分子物质转运、免疫应答等行为。SDC4对瘢痕疙瘩形成的促进作用，在瘢痕疙瘩中表达高于正常皮肤组织，这种高表达促进瘢痕疙瘩中成纤维细胞的增殖。目前研究表明，SDC4基因第2、4外显子易与ROSl基因发生融合。
[0007]3) SLC34A2-R0S1 融合基因
[0008]溶质转运蛋白家族34 成员 2 (solute carrier family 34member2, SLC34A2)基因位于4pl5.31-pl5.2上。SLC34A2属于溶质转运蛋白家族SLC34的成员之一，在肺内强表达，编码Na依赖的Pi转运蛋白NaP1-1Ib，在维持体内无机磷的平衡中起着极其重要的作用。高浓度地塞米松促进人肺泡上皮细胞的SLC34A2基因表达及细胞外液的钙、磷转运。目前，在非小细胞肺癌细胞系样本中，已经检测出了 SLC34A2-R0S1融合基因。研究发现，SLC34A2基因第4、13外显子易与ROSl基因发生融合。
[0009]4) EZR-ROSl、LRIG3-R0SI 和 TPM3-R0S1 融合基因
[0010]Ezrin蛋白是ERM (Ezrin-Radixin-Moesin)家族成员之一,主要参与细胞骨架与胞膜之间的连接。研究证明，ezrin基因在食管癌、胰腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌以及其他多种肿瘤细胞中过表达。富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白3(leucine-rich repeatsandimmunoglobin-like domains 3, LRIG3)是LRIG基因家族成员之一，在多种肿瘤中均有表达下调。研究证明，LRIG3基因过表达能降低胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力，加速细胞凋亡，抑制胶质瘤的发生和发展。原肌球蛋白3基因(tiOpomyosin 3，TPM3)是肌肉收缩过程中重要的蛋白调苄基因之一，它在肌纤维细丝中与肌动蛋白双螺旋并行存在，可影响并调控肌动球蛋白之间的相互作用。TPM3基因突变与线状肌病和骨骼肌无力有关。研究表明，EZR、LRIG3和TPM3基因都能够与ROSl基因发生融合，目前已经发现，EZR基因第10外显子与ROSl基因第34外显子融合，LRIG3基因第16外显子与ROSl基因第35外显子融合，TPM3基因第5外显子与ROSl基因第35外显子融合。
[0011]目前，针对RET融合基因的研究大部分采用RT-PCR方法以及非放射性同位杂交FISH方法进行检测。RT-PCR方法是针对已知的RET融合基因的类型以及融合方式来设计引物，将RNA反转录获得cDNA后，通过PCR扩增目的片段的方式来进行检测，则存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点。而非放射性原位杂交技术FISH法尽管较为直观，但试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费时费力，且其只能检出融合基因是否存在，不能准确得出具体的融合类型，灵敏性较低，因而一定程度上限制了该法的应用。
【发明内容】
[0012]本发明的目的之一是提供一种检测RO`Sl融合基因的PCR引物，所述PCR引物可用于单独或并行检测ROSl融合基因的11种基因融合亚型:CD74-R0S1的C6; R32、C6; R34、C5;R34 ；SDC4-R0S1 的 S2; R32、S4; R32、S4; R34 ;SLC34A2_R0S1 的 SL13 ; R32、SL4; R34 ;EZR-R0S1 的 E10;R34 ；LRIG3-R0S1 的 L16;R35 和 TPM3-R0S1 的 T5;R35。
[0013]实现上述目的的技术方案如下:
[0014]一种检测ROSl融合基因的PCR引物，针对C6;R32的SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.5,针对 C6;R34、C5;R34 的 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.5、针对 S2; R32、S4; R32 的 SEQ ID N0.1和 SEQID N0.6、针对 S4;R34 的 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.6、针对 SL13; R32 的 SEQ ID N0.1和 SEQ IDN0.7、针对 SL4;R34 的 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.8、针对ElO; R34 的 SEQ ID N0.4和 SEQ IDN0.9、针对 L16;R35 的 SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.10、和 / 或针对 T5;R35 的 SEQID N0.4 和 SEQID N0.11。
[0015]本发明的另一目的是提供一种检测ROSl融合基因的PCR试剂盒。
[0016]实现该目的的技术方案如下:
[0017]一种检测ROSl融合基因的PCR试剂盒，包括有上述的PCR引物。
[0018]在其中一个实施例中，所述PCR试剂盒还包括有阳性对照品，所述阳性对照品为:针对C6;R32的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.5反向互补配对的序列的核酸片段，针对C6;R34、C5;R34的含有SEQ ID N0.2和与SEQ ID N0.5反向互补配对的序列的核酸片段、针对S2;R32、S4;R32的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.6反向互补配对的序列的核酸片段、针对S4;R34的含有SEQ ID N0.2和与SEQ ID N0.6反向互补配对的序列的核酸片段、针对SL13;R32的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.7反向互补配对的序列的核酸片段、针对SL4;R34的含有SEQ ID N0.3和与SEQ ID N0.8反向互补配对的序列的核酸片段、针对ElO; R34的含有SEQ ID N0.4和与SEQ ID N0.9反向互补配对的序列的核酸片段、针对L16;R35的含有SEQ ID N0.4和与SEQ ID N0.10反向互补配对的序列的核酸片段、和/或针对T5;R35的含有SEQ ID N0.4和与SEQ ID N0.11反向互补配对的序列的核酸片段。
[0019]更优选地，所述阳性对照品为:针对C6; R32的SEQ ID N0.12，针对C6; R34的SEQIDN0.13、针对 C5;R34 的 SEQ ID N0.14、针对 S2; R32 的 SEQ ID N0.15、针对 S4; R32 的 SEQIDN0.16、针对 S4;R34 的 SEQ ID N0.17、针对 SL13; R32 的 SEQ ID N0.18、针对 SL4; R34 的SEQ IDN0.19、针对 E10;R34 的 SEQ ID N0.20、针对 L16; R35 的 SEQ ID N0.21、和 / 或针对T5;R35 的 SEQ ID N0.22。
[0020]本发明的另一目的是提供一种检测ROSl融合基因的液相芯片，该液相芯片能够对上述11种ROSl融合基因亚型实现单独或并行的定性检测。
[0021]实现该目的的技术方案如下:
[0022]一种检测ROSl融合基因的液相芯片，包括有:
[0023](A)上述 PCR 引物；
[0024](B).针对ROSl融合基因不同融合类型分别设计的ASPE引物:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的融合类型的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对 C6; R32 的 SEQ ID N0.34，针对 C6; R34 的 SEQ ID N0.35、针对 C5; R34 的 SEQ IDN0.36、针对 S2;R32 的 SE`Q ID N0.37、针对 S4; R32 的 SEQ ID N0.38、针对 S4; R34 的 SEQ IDN0.39、针对 SL13;R32 的 SEQ ID N0.40、针对 SL4; R34 的 SEQ ID N0.41、针对 ElO; R34 的SEQ ID N0.42、针对 L16;R35 的 SEQ ID N0.43、和 / 或针对 T5; R35 的 SEQ ID N0.44 ;所述tag 序列选自 SEQ ID N0.23 — SEQ IDN0.33 ；
[0025](C).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.45—SEQ ID N0.55，且所述ant1-tag序列能相应地与(B)中所选的tag序列互补配对。
[0026]本发明的另一目的是提供一种用于检测ROSl融合基因的特异性引物。
[0027]具体技术方案如下:
[0028]一种用于检测ROSl融合基因的特异性引物，所述特异性引物为:针对C6;R32的SEQID N0.34，针对 C6; R34 的 SEQ ID N0.35、针对 C5; R34 的 SEQ ID N0.36、针对 S2; R32 的SEQ ID N0.37、针对 S4;R32 的 SEQ ID N0.38、针对 S4; R34 的 SEQ ID N0.39、针对 SL13; R32的 SEQ ID N0.40、针对 SL4;R34 的 SEQ ID N0.41、针对 ElO; R34 的 SEQ ID N0.42、针对L16;R35 的 SEQ ID N0.43、和 / 或针对 T5;R35 的 SEQ ID N0.44。
[0029]本发明的主要优点在于:
[0030]1、本发明所提供的ROSl融合基因检测液相芯片与测序法的吻合率高达100%。
[0031]2、本发明的检测液相芯片步骤简单，使用逆转录产物作为模板，通过严格筛选的PCR引物，可一步PCR完成含有11种ROSl融合基因亚型的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的定性分析特征。
[0032]3、本发明的检测试剂盒使用含有目标检测融合亚型序列的质粒载体作为阳性对照品，进一步保证了检测的准确性和可靠性。
[0033]4、本发明所制备的ROSl融合基因的液相芯片具有非常好的信号-噪声比，所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，同时，本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的融合基因亚型。
[0034]5、本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用的需要。
[0035]6、本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
[0036]说明书附图
[0037]图1是实施例2中PCR扩增的组I的聚丙烯酰胺凝胶电泳图片；
[0038]图2是实施例2中PCR扩增的组2的聚丙烯酰胺凝胶电泳图片。
【具体实施方式】
[0039]本发明实施例中未说明的常规条件和方法，按照本领域技术人员采用的常规方法来进行，如《分子克隆实验指南》第三版，或按照生产厂商所提供的操作方法来实施。
[0040]实施例1 一种检测ROSl融合`基因检测的PCR引物和阳性对照品
[0041]一、RT-PCR 扩增
[0042]1、逆转录
[0043]针对各种目标检测的ROSl融合基因亚型，本发明先使用随机引物对目标检测样本进行逆转录，将样本中mRNA反转录成为cDNA，具体实验步骤参照《分子克隆实验指南》，使用随机引物进行mRNA的反转录为常规操作步骤。
[0044]2、PCR 扩增
[0045]表1中的融合类型为本发明目标检测的11种ROSl融合基因亚型，根据该融合基因序列的核酸组成特征，利用Primer5.0设计正向弓丨物和反向引物。使用步骤I所得的cDNA作为模板，对11种目标检测融合基因亚型进行并行扩增。
[0046]所有引物由Invitrogen公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L TrisBuffer配制成300pmol/mL的忙存液。
[0047]其中，C6; R32表示⑶74基因的外显子6和ROSl基因的外显子32发生融合。
[0048]表1R0S1融合基因亚型扩增引物
[0049]
【权利要求】
1.一种检测ROSl融合基因的PCR引物，其特征是，所述PCR引物为针对C6; R32的SEQIDN0.1 和 SEQ ID N0.5，针对 C6; R34、C5; R34 的 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.5、针对 S2; R32、S4;R32 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.6、针对 S4; R34 的 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.6、针对SL13;R32 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.7、针对 SL4; R34 的 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.8、针对 E10; R34 的 SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.9、针对 L16; R35 的 SEQ ID N0.4 和 SEQ IDN0.10、和 / 或针对 T5;R35 的 SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.11。
2.一种检测ROSl融合基因的PCR试剂盒，其特征是，包括有权利要求1所述的PCR引物。
3.根据权利要求2所述的PCR试剂盒，其特征是，还包括有阳性对照品，所述阳性对照品为:针对C6;R32的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.5反向互补配对的序列的核酸片段，针对C6;R34、C5;R34的含有SEQ ID N0.2和与SEQ ID N0.5反向互补配对的序列的核酸片段、针对S2;R32、S4;R32的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.6反向互补配对的序列的核酸片段、针对S4;R34的含有SEQ ID N0.2和与SEQ ID N0.6反向互补配对的序列的核酸片段、针对SL13;R32的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.7反向互补配对的序列的核酸片段、针对SL4;R34的含有SEQ ID N0.3和与SEQ ID N0.8反向互补配对的序列的核酸片段、针对E10; R34的含有SEQ ID N0.4和与SEQ ID N0.9反向互补配对的序列的核酸片段、针对L16;R35的含有SEQ ID N0.4和与SEQ ID N0.10反向互补配对的序列的核酸片段、和/或针对T5;R35的含有SEQ ID N0.4和与SEQ ID N0.11反向互补配对的序列的核酸片段。
4.根据权利要求2所述的PCR试剂盒，其特征是，所述阳性对照品为:针对C6;R32的SEQ ID N0.12，针对C6;R34 的 SEQ ID N0.13、针对C5;R34 的 SEQ ID N0.14、针对S2;R32 的SEQ ID N0.15、针对 S4;R32 的 SEQ ID N0.16、针对 S4; R34 的 SEQ ID N0.17、针对 SL13; R32的 SEQ ID N0.18、针对 SL4;R34 的 SEQ ID N0.19、针对 ElO; R34 的 SEQ ID N0.20、针对L16;R35 的 SEQ ID N0.21、和 / 或针对 T5; R35 的 SEQ ID N0.22。
5.—种检测ROSl融合基因的液相芯片，其特征是，包括有: (A)权利要求1所述的PCR引物； (B).针对ROSl融合基因不同融合类型分别设计的ASPE引物:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的融合类型的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对 C6;R32 的 SEQ ID N0.34，针对 C6; R34 的 SEQ ID N0.35、针对 C5; R34 的 SEQ ID N0.36、针对 S2;R32 的 SEQ ID N0.37、针对 S4;R32 的 SEQ ID N0.38、针对 S4;R34 的 SEQ ID N0.39、针对 SL13;R32 的 SEQ ID N0.40、针对 SL4; R34 的 SEQ ID N0.41、针对 ElO; R34 的 SEQ IDN0.42、针对 L16; R35 的 SEQ ID N0.43、和 / 或针对 T5; R35 的 SEQ ID N0.44 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.23-SEQ IDN0.33 ； (C).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.45—SEQ ID N0.55，且所述ant1-tag序列能相应地与(B)中所选的tag序列互补配对。
6.根据权要求5所述的液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为:针对C6;R32的由SEQIDN0.23 和 SEQ ID N0.34 组成的序列，针对 C6; R34 的 SEQ ID N0.24 和 SEQ ID N0.35 组成的序列、针对C5;R34的SEQ ID N0.25和SEQ ID N0.36组成的序列、针对S2; R32的SEQ IDN0.26 和 SEQID N0.37 组成的序列、针对 S4;R32 的 SEQ ID N0.27 和 SEQ ID N0.38 组成的序列、针对S4;R34的SEQ ID N0.28和SEQ ID N0.39组成的序列、针对SL13; R32的SEQ IDN0.29 和 SEQ ID N0.40 组成的序列、针对SL4; R34 的 SEQ ID N0.30 和 SEQ ID N0.41 组成的序列、针对E10;R34的SEQID N0.31和SEQ ID N0.42组成的序列、针对L16; R35的SEQ IDN0.32 和 SEQ ID N0.43 组成的序列、和 / 或针对 T5; R35 的 SEQ ID N0.33 和 SEQ ID N0.44组成的序列。
7.根据权利要求5或6所述的液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5— 10个T。
8.一种用于检测ROSl融合基因的特异性引物，所述特异性引物为:针对C6;R32的SEQID N0.34，针对 C6; R34 的 SEQ ID N0.35、针对 C5; R34 的 SEQ ID N0.36、针对 S2; R32 的SEQ ID N0.37、针对 S4;R32 的 SEQ ID N0.38、针对 S4; R34 的 SEQ ID N0.39、针对 SL13; R32的 SEQ ID N0.40、针对 SL4;R34 的 SEQ ID N0.41、针对 E10; R34 的 SEQ ID N0.42、针对L16;R35 的 SEQ ID N0.43、和 / 或针对 T5;R35 的 SEQ ID N0.44。
【文档编号】C12Q1/68GK103805686SQ201210448618
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2012年11月9日
【发明者】陈昌华, 陈菲, 许昌有 申请人:益善生物技术股份有限公司