专利名称：一种polyoxinK高产菌株的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种多氧霉素有效组分polyoxinK高产菌株的构建方法,属于生物制药领域。
背景技术：
近年来，生物学技术的发展为农业生产提供了更加广阔的前景；同时农业生产的快速发展，对相应的抗生素的需求量增加。目前需要高产高效药物来应对日益增加的市场需求。作为几丁质合成酶的特异性抑制剂，多氧霉素不仅具有广谱的抗真菌活性，并且对动植物毒性较低。多氧霉素属于多组分抗生素。附图
5所示是多氧霉素多种组分的结构。在所有的组分中,polyoxinA与polyoxinH为主要组分,但生物活性最高的组分却是polyoxinB (烟草赤星病,苹果斑点落叶病),polyoxinD (水稻纹枯病),polyoxinK (稻痕病)以及polyoxinL (烟草赤星病,苹果斑点落叶病),但是四者却是少量组分,所以这是一对矛盾。在传统的育种实践中，通过诱变提高多氧霉素整体效价的同时，生物活性较弱的组分效价也相应的提高，但是随着多氧霉素生物合成基因簇的成功克隆以及生物合成深入阐明为实现多氧霉素组分的优化与途径改造提供了坚实的基础。本发明通过基因工程的手段对多氧霉素工业菌株特定的功能基因进行敲出，从而来特定的积累具有较高生物活性的组分。
发明内容
本发明所解决的问题是提供一种多氧霉素有效组分polyoxinK的高产菌株的构建方法。本发明利用基因工程的策略对多氧霉素工业菌株的特定基因进行敲出而定向的积累特定的有效组分。polyoxinK,其结构式如下所示:
权利要求
1.一种polyoxinK高产菌株的构建方法,其特征在于,包括以下步骤: 1)工业菌株的polB突变株CXRl的构建及筛选 将polB的中断载体pJTU4720，通过转化导入ET12567/Puz8002的感受态中；挑取单菌落接入指形瓶中8-10h后按照1:10的比例转接到LB内37°C摇3小时；进行通过接合转移的方式转到金产色链霉菌工业菌株中，接合子经过抗性验证及PCR复证正确后，经放松培养，梯度稀释，在阿泊拉霉素和硫链丝菌素平板上验证，证明挑取的候选突变株为预期的polB中断突变株； 2)突变株的发酵 调节发酵液PH值至3.0，将突变株直接进行发酵。
2.根据权利要求1所述 的构建方法，其特征在于，用草酸调节发酵液PH值至3.0。
全文摘要
本发明涉及一种polyoxinK高产菌株的构建方法。通过构建polB中断载体，通过接合转移的方式转到工业菌株中，从而构建工业菌株的polB突变株CXR1。通过生物学测定发现突变株的发酵液与野生型相比，生物活性明显提高。同时又进行了进一步的液相和质谱的分析发现CXR1突变株所产的主要化合物为PolyoxinK组分。该发明对于在工业菌株之中实现组分改造提高多氧霉素的相对生物效价具有重要意义。
文档编号C12R1/465GK103114103SQ20121053370
公开日2013年5月22日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者陈文青, 邓子新, 秦娜娜, 周佳海 申请人:武汉大学