专利名称：一种骨髓间充质干细胞的体外扩增纯化培养方法及培养基的制作方法
一种骨髓间充质干细胞的体外扩增纯化培养方法及培养基技术领域
本发明要求保护一种利于骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的骨髓间充质干细胞体外扩增纯化培养方法，以及在培养过程中所用的细胞培养基。
背景技术：
骨髓间充质干细胞在适当的条件刺激下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等细胞类型，而且易于分离培养，具有较强的自我更新、分化能力和免疫抑制等优点，使其在组织器官缺损性疾病、组织器官退行性疾病以及细胞治疗和组织工程领域具有重要的应用前景。近来有众多的国内外研究探索骨髓间充质干细胞的体外分离和培养方法，主要有贴壁分离、密度梯度离心和细胞分选等方法，结果显示通过贴壁传代分离的细胞纯度低，梯度离心和细胞分选可获得较高纯度的细胞，而细胞活力相对较低，且所需骨髓量较大，影响后续的研究和应用。而且通过这些方法获得的骨髓间充质干细胞在传代培养过程中逐渐失去增殖分化能力。近来有文献报道将一些细胞因子应用于干细胞相关的研究中，对骨髓间充质干细胞的体外生长具有一定的生物学效应。发明内容
本发明目的一种利于骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的骨髓间充质干细胞体外扩增纯化培养方法，以及在培养过程中所用的细胞培养基。
本发明采用的技术方案是一种骨髓间充质干细胞的体外扩增纯化培养方法，所述方法包括取骨髓细胞，经筛网过滤后的单细胞悬液接种于培养皿中进行贴壁培养，初始接种密度2飞X IO6个/mL (优选约为5X IO6个/mL)细胞培养基，培养3飞小时(优选为3小时)后更换细胞培养基(组成同前)，此后每隔8 15小时(优选12小时)再次更换细胞培养基(组成同前)，直到接种后6(Γ80 小时(优选为75小时)，然后再每隔3天更换细胞培养基(组成同前)继续培养，直到细胞长至80°/Γ90%融合，以胰酶消化，消化时间不超过2分钟，细胞传代继续培养，获得纯化后的骨髓间充质干细胞；所述细胞培养基终浓度组成如下bFGF 8^12 yg/L,EGF 8^12 μ g/L, PDGF-BB 8 12 μ g/L，胎牛血清10%，青霉素100U/mL，链霉素100mg/L，溶剂为基础培养基； 所述基础培养基为DMEM培养液、F12培养液或其混合物。
优选的，所述细胞培养基终浓度组成如下bFGF (小鼠碱性成纤维细胞生长因子) 10 μ g/L，EGF (小鼠表皮生长因子)10 μ g/L, PDGF-BB (小鼠血小板衍生生长因子_BB) 10 μ g/L,胎牛血清10%，青霉素100U/mL，链霉素100mg/L，溶剂为基础培养基；所述基础培养基为DMEM培养液和F12培养液体积比I: I的混合液。细胞传代具体步骤包括=PBS缓冲液洗涤细胞，添加0. 25%胰酶(含有0. 0296EDTA)室温消化细胞，添加完全培养基终止消化，细胞悬液经离心分离去除上层清液，再添加完全培养基悬浮细胞，接种于新的培养皿中继续培养，细胞接种密度为5X105/mL。完全培养基即细胞培养基中去掉生长因子成分，其组成如下胎牛血清10%，青霉素100U/mL，链霉素IOOmg/L，溶剂为基础培养基；所述基础培养基为DMEM培养液、F12培养液或其混合物。
本发明还涉及一种用于骨髓间充质干细胞的体外扩增纯化培养的细胞培养基，其终浓度组成如下bFGF 8 12 μ g/L, EGF 8 12 μ g/L, PDGF-BB 8 12 μ g/L，胎牛血清 10%， 青霉素100U/mL，链霉素100mg/L，溶剂为基础培养基；所述基础培养基为DMEM培养液、F12 培养液或其混合物。
优选的，所述细胞培养基终浓度组成如下bFGF 10 μ g/L, EGF 10 μ g/L, PDGF-BB 10 μ g/L，胎牛血清10%，青霉素100U/mL，链霉素100mg/L，溶剂为基础培养基；所述基础培养基为DMEM培养液和F12培养液体积比I: I的混合液。
本发明在以往的研究基础上，采用细胞贴壁传代和培养液中添加细胞因子(bFGF 、EGF和TOGF-BB)相结合的方法，获得的骨髓干细胞纯度高，体外增殖能力强，并且具有较好的向成骨细胞分化的能力。
细胞因子对骨髓间充质干细胞的体外增殖和分化具有重要的影响。H)GF、FGF信号通路是影响间充质干细胞生长和分化的两条关键通路，bFGF和EGF可以抑制造血干细胞的生长，有利于骨髓间充质干细胞的纯化和生长。本发明提供的骨髓间充质干细胞的体外分离和扩增的培养方法，通过低密度接种，早期更换培养液，联合添加细胞因子和胰酶传代消化相结合的细胞贴壁传代培养方法，从而达到提高骨髓间充质干细胞的体外纯化率和增殖分化能力的目的。
本发明的骨髓间充质干细胞分离及其培养的方法，具有如下优点(1)根据细胞贴壁速度不同，低密度接种后早期更换培养液可以去除骨髓中的造血干细胞、其它类型的细胞以及上清液中存在的细胞残片，利于细胞的早期纯化；(2)根据细胞对胰酶的敏感性不同，室温条件下消化不超过2分钟，可以将对胰酶敏感的间充质干细胞先消化下来，进一步纯化细胞；而且短时间消化不影响细胞的活力，有利于细胞的扩增；(3)培养液中添加的细胞因子有利于骨髓间充质干细胞的增殖，可以抑制造血系干细胞的贴壁生长，利于细胞的纯化；同时还可以保持细胞的未分化状态，有利于细胞的分化研究。
图I为初始接种后72小时细胞形态。
图2为初始接种后I周细胞形态。
图3为初始接种后15天的细胞形态。
图4为传至第3代的细胞形态。
图5为扩增至第3代细胞的流式细胞检测分析图(FL1-H是NA组细胞抗体的同型 IgG对照，FL2-H是A组细胞抗体的同型IgG对照)。
图6为成骨诱导不同时间的成骨细胞特异性基因表达图。
图7为成骨诱导2周的碱性磷酸酶染色图。
图8为成骨细胞诱导3周的Alizarin Red S染色图。
其中，NA表示添加细胞因子EGF和TOGF-BB的对比例，A表示添加细胞因子bFGF， EGF和PDGF-BB的实施例。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I:所用试剂胎牛血清(Hyclone)，青霉素、链霉素、DMEM培养液、F12培养液(Gibco) bFGF, EGF,PDGF-BB (PeproTech)1、取6周左右的ICR雄性成年小鼠(购买于浙江省医学科学院实验动物中心)，颈椎脱臼处死，无菌条件下取出股骨和胫骨；2、无菌剪刀剪开两端骨骺，用注射器吸取完全培养基冲洗骨髓腔，完全培养基组份: 10% (v/v)胎牛血清，青霉素100U/mL，链霉素100mg/L，溶剂为DMEM/F12培养液(即DMEM与 Fl2体积比1:1混合液)；3、获得的骨髓细胞悬液经200目筛网过滤，接种于10cm的培养皿中，初始接种密度约为5X IO6个/mL，细胞培养基为完全培养基联合添加细胞因子bFGF，EGF和TOGF-BB，终浓度均为10 μ g/L，初始接种细胞的培养基体积为2mL，可覆盖培养皿底；4、初始接种后置于37°C，饱和湿度，含5%CO2的培养箱中培养3小时，然后取出培养皿，更换细胞培养基，体积为2 mL ；5、初次更换培养基12小时后，再次更换细胞培养基，体积仍为2mL, 12小时后，再次更换细胞培养基，至初次接种后75小时，更换细胞培养基体积增加为8 mL,之后每3天更换一次细胞培养基，体积为8 mL,待细胞长至80%融合时进行消化传代，在倒置显微镜下观察培养不同时间的细胞形态；6、细胞传代PBS缓冲液洗涤细胞两次后，添加0.25% (w/v)胰酶(含有0. 02% (w/v) EDTA)ImL室温消化细胞2 min, 2mL完全培养基终止消化，细胞悬液经300g离心5 min后， 完全培养基悬浮细胞，接种于新的培养皿中继续培养，细胞接种密度为5X 105/mL ；对比例步骤与实施例中所述步骤相同，二者不同之处是本实施例中的培养液只添加相同浓度的细胞因子EGF和I3DGF-BB。
骨髓间充质干细胞的表型特征取传至第3代的小鼠骨髓间充质干细胞，0.25% (w/v)的胰酶室温消化2 min，完全培养基终止后300g离心5 min, PBS洗涤后再加入500 μ I PBS重新悬浮细胞，分别加入PE和 FITC标记的抗小鼠间充质干细胞表面抗原抗体⑶45和⑶90以及对应的同种荧光标记的非特异性同型抗体各I μ L,室温避光孵育30 min, 800 r/min离心5min,弃掉抗体孵育液后再加入200 μ I PBS缓冲液悬浮细胞，采用BD FACSCalibur流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。
骨髓间充质干细胞的成骨细胞诱导分化和鉴定取传至第3代的小鼠骨髓间充质干细胞接种于12孔板，待细胞达到80%融合时，更换成骨诱导培养基含细胞因子的培养基DMEM/F12 + 10%胎牛血清，I X 10_8 mol/L地塞米松， 50 μ mol/L抗坏血酸,10 mmol/L甘油磷酸钠,每3天更换I次培养基。提取诱导分化3、7 和14天的小鼠骨髓间充质干细胞总RNA，SYBGreen荧光定量PCR检测诱导分化的成骨细胞5特异性基因Collagen I和Osteocalcin的表达,分别选择诱导分化14天和28天的小鼠骨髓间充质干细胞，经4%多聚甲醛固定30分钟后进行碱性磷酸酶染色和茜素红S染色检测小鼠骨髓间充质干细胞的成骨细胞分化结果。
结果如附图1，2，3所示，初始接种的骨髓细胞经过早期换液，在胰酶消化传代之前，实施例和对比例的细胞形态一致，显微镜下观察到获得的原代细胞形态单一，呈长梭状多边形，折光性强，边缘清楚，而且呈现集落式生长模式，与对比例相比较，实施例中的原代细胞增殖速度相对较快。
原代纯化的骨髓间充质干细胞经过胰酶消化传代后，对比例的骨髓间充质干细胞逐渐失去原代培养时的梭状形，变成宽大扁平的形态，边缘模糊，增殖缓慢，呈现老化状态 (图4，NA所示)。实施例的骨髓间充质干细胞传至第3代时形态没有发生明显改变(图4，A 所示)，而且增殖速度较快。经过流式检测，实施例中的骨髓间充质干细胞基本不表达CD45， ⑶90表达阳性的细胞比例超过90% (图5，A所示)，对比例的细胞中仍有部分⑶45表达阳性的细胞，表达⑶90的细胞比例不超过70%(图5，NA所示)。可见，培养液中联合添加三种细胞因子更有利于骨髓间充质干细胞的体外扩增和细胞纯化。
如图6，7，8所示，经过传代培养的骨髓间充质干细胞经过不同时间的成骨诱导后，实施例中的成骨细胞特异性基因的表达和碱性磷酸酶的表达都明显高于对比例，且钙化物的形成量较多。本发明采用的细胞体外扩增纯化培养方法有利于骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。
权利要求
1.一种骨髓间充质干细胞的体外扩增纯化培养方法，所述方法包括取骨髓细胞，经筛网过滤后的单细胞悬液接种于培养皿中进行贴壁培养，初始接种密度2飞X IO6个/mL细胞培养基，培养3飞小时后首次更换细胞培养基，此后每隔8 15小时再次更换细胞培养基，直到接种后6(Γ80小时，然后再每隔3天更换细胞培养基继续培养，直到细胞长至809Γ90%融合，以胰酶消化，消化时间不超过2分钟，细胞传代继续培养，获得纯化的骨髓间充质干细胞；所述细胞培养基终浓度组成如下bFGF 8 12 μ g/L,EGF 8 12 μ g/L, PDGF-BB 8 12μ g/L，胎牛血清10%，青霉素100U/mL，链霉素100mg/L，溶剂为基础培养基；所述基础培养基为DMEM培养液、F12培养液或其混合物。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述细胞培养基终浓度组成如下bFGF10μ g/L, EGF 10 μ g/L, PDGF-BB 10 μ g/L，胎牛血清 10%，青霉素 100U/mL，链霉素 100mg/L，溶剂为基础培养基；所述基础培养基为DMEM培养液和F12培养液体积比I: I的混合液。
3.一种用于骨髓间充质干细胞的体外扩增纯化培养的细胞培养基，其终浓度组成如下bFGF 8 12 μ g/L, EGF 8 12 μ g/L, PDGF-BB 8 12 μ g/L，胎牛血清 10%，青霉素 100U/mL,链霉素100mg/L，溶剂为基础培养基；所述基础培养基为DMEM培养液、F12培养液或其混合物。
4.如权利要求3所述的细胞培养基，其特征在于所述细胞培养基终浓度组成如下bFGF 10 μ g/L, EGF 10 μ g/L, PDGF-BB 10 μ g/L，胎牛血清 10%，青霉素 100U/mL，链霉素100mg/L,溶剂为基础培养基；所述基础培养基为DMEM培养液和F12培养液体积比I: I的混合液。
全文摘要
本发明提供了一种利于骨髓间充质干细胞向成骨干细胞分化的骨髓间充质干细胞体外扩增纯化培养方法，以及在培养过程中所用的细胞培养基。本发明所用细胞培养基组成如下bFGF8~12μg/L，EGF8~12μg/L，PDGF-BB8~12μg/L，胎牛血清10%，青霉素100U/mL，链霉素100mg/L，溶剂为基础培养基；所述基础培养基为DMEM培养液、F12培养液或其混合物。本发明采用早期更换细胞培养液、细胞贴壁传代和培养液中联合添加细胞因子(bFGF、EGF和PDGF-BB)相结合的方法，获得的骨髓间充质干细胞纯度高，体外增殖能力强，并且具有较好的向成骨细胞分化的能力。
文档编号C12N5/0775GK102978156SQ20121053394
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月8日 优先权日2012年11月13日
发明者李静, 周国顺, 戴利成 申请人:湖州市中心医院