拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途

拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
【专利摘要】本发明公开了一种拮抗抑制血管内皮细胞生长因子（VEGF）与其受体（VEGF-R）结合的小鼠单克隆抗体及其重链可变区与轻链可变区氨基酸序列。本发明还公开了该抗体的人源化制备过程及该人源化抗体重链可变区与轻链可变区氨基酸序列。该人源化抗体或其衍生体可作为药物组合物成分或制备成合适药物制剂，单独给药或与化疗药物等其他治疗手段合并使用，用于广谱治疗结肠癌、乳腺癌、横纹肌肉瘤等各种实体瘤。
【专利说明】拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术单克隆抗体领域。本发明涉及一种可拮抗抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)与其受体(即VEGF-R)结合的单克隆抗体及其用途。
【背景技术】
[0002]血管新生或增生(angiogenesis)在生物学上是指体内的已存在的血管(如毛细血管和微小动、静脉)通过出芽或分裂的方式而产生新的血管的过程。血管新生在维持机体的许多正常的生理过程如组织胚胎发育、外伤伤口的癒合与修复等是有益的和必需的。但过度的血管新生或增生也与许多病理变化(如肿瘤的增生扩散、炎症等)息息相关。体内的血管能够不断地增生与增长的关键是其内衬的血管内皮细胞具有不断分裂增生及定向迁移置入已有的血管管壁的能力。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelialgrowthfactor, VEGF)则是已知的最重要及最强烈的促血管内皮细胞分裂增生及血管增长的因子。VEGF在血管增生中的重要性已在VEGF基因剔除小鼠的研究中被充分证实:因为只要当VEGF基因中的一份被敲除后，小鼠胚胎在仅发育至11至12天时就会因血管增生受阻及异常而死亡(Carmeliet P 等 Nature 1996, 380:435;Ferrara N 等 Nature 1996,380:439)。
[0003]VEGF在多种恶性肿瘤组织中(如结直肠癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、多发性骨髓瘤等)呈过度表达，且其表达水平高低与肿瘤生长与转移复发程度呈高度正相关(DvorakHF 等 J Exp Medl991;174:1275-8 ；Brown LF 等 Cancer Res 1993;53:4727-35 ；ffeidnerN, Semple JP, Welch WR 及 Folkman J:N Engl J Med 1991 ;324:1-8.4-5)。近年来国内外一系列动物试验及临床实践已证明:通过基因调控或给予外来药物来阻断体内VEGF及其受体(VEGF-R)介导的促血管增生，则可导致肿瘤组织因缺血而坏死，从而达到抑制肿瘤生长和转移及延长患者生存期的良好疗效。因此，以VEGF及其受体为靶点的抗肿瘤血管增生药物已成为当今国内外药物研发竞争热点。
[0004]在以VEGF及其受体为靶点的抗肿瘤血管增生药物的开发上，目前主要有两大模式:
[0005]模式一是研制拮抗VEGF受体(VEGF-R)中位于细胞膜内的酪氨酸蛋白激酶活性的抑制剂，这类拮抗抑制剂一般都属于小分子化学类药，其中的代表性药物为2006年由美国Pfizer (辉瑞)开发上市的Sutent (舒尼替尼)；及由德国Bayer (拜耳)与美国OnyxPharmaceuticals 开发上市的 Nexavar0
[0006]模式二是研制可直接阻断VEGF与其受体(VEGF-R)结合的抗体或抗体Fe融合蛋白等大分子蛋白类生物制剂。该类代表性药物为由Roche/Genentech公司研发生产并于2004年2月获美国FDA批准上市的人源化抗VEGF单克隆抗体药Bevacizumab(贝伐单抗)，商品名Avastin(阿瓦斯丁)。Avastin是目前为止全球市场上唯一的一个抗VEGF单克隆抗体药物。Avastin通过与体内VEGF的高度特异结合，从而阻止VEGF与其受体的结合,进而达到阻断血管增生与抑制肿瘤增生的疗效(Presta LG等Cancer Res, 1997, 57:4593; Hurwitz H等N Engl J MeddOCMJSOJSSSXAvastin目前已获美国FDA批准用于治疗转移性结肠癌(metastatic colorectal cancer, mCRC)、晚期月市癌(advanced non-squamous non - smallcel I lung cancer, NSCLC)、脑胶质瘤(glioblastoma)、转移性肾癌(metastatic kidneycancer, mRCC)等多种实体瘤。Avastin 2010年2月获中国SFDA批准用于治疗结肠癌。
[0007]Avastin其前身可追溯到代号为A4.6.1的小鼠单克隆抗体。该小鼠单克隆抗体的来源及分泌它的杂交瘤细胞系与用途在专利号为US6，582，959的美国专利(发明人:Kim, Kyung Jin,专利授权日期:June 24，2003,专利名称:Antibodies to vascularendothelial cell growth factor);及专利号为 US7, 227，004 的美国专利(发明人:Kim,Kyung Jin 专利授权日期:June 5，2007,专利名称:Antibodies to vascularendothelialcell growth factor)中都有所描述。该鼠源抗体及其人源化抗体rhuMab_VEGF (即Avastin)的序列及其制备方法在专利号为US6, 054, 297的美国专利(发明人:Carter;PaulJ.及Presta; LeonardG,专利 申请日期::May 9,1995,专利授权日期:April 25,2000,专利名称:Humanized antibodiesand methods for making them)公开并在国际期刊杂志上发`表(Presta LG 等 Cancer Res,1997,57:4593)。
[0008]但该抗体还存在如下不足:
[0009]I)与大多数的单克隆抗体一样，小鼠单克隆抗体A4.6.1及其人源化抗体Avastin也仅只是能结合VEGF抗原表位中的部分位点，无法结合或涵盖VEGF抗原表位中众多的其他位点。
[0010]2)先前在动物实验中及近年来的临床研究中发现仅单独给予小鼠单克隆抗体A4.6.1或Avastin抗体,无法达到完全中和抑制体内VEGF及其介导的促血管新生。
[0011]因此，研制具有新的VEGF结合位点的，且可拮抗抑制VEGF与其受体(VEGF-R)结合的全新单克隆抗体或药物制剂显得很有意义与必要。

【发明内容】

[0012]本发明要解决的技术问题是提供一种拮抗抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)与其受体(VEGF-R)结合的抗体或其衍生体。该抗体包括人源化抗体或其衍生体如抗体Fab片段、单链抗体等。
[0013]本发明的另一个要解决的技术问题是提供编码上述抗体的DNA分子或基因。
[0014]本发明的另一个要解决的技术问题是提供含有上述抗体的药物组合物。
[0015]本发明的还一个要解决的技术问题是提供制备上述抗体的方法。
[0016]为解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种拮抗抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)与其受体(VEGF-R)结合的鼠源单克隆抗体，该抗体的特征是其轻链可变区具有SEQID N0.:1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID N0.:2所示的氨基酸序列。该鼠源单克隆抗体来源于代号为PV19-5的小鼠杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株已于2012年03月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏编号为CGMCC No 5889.保藏地点:中国，北京)。此外，本发明还提供编码上述鼠源单克隆抗体的DNA分子，其轻链可变区具有SEQ ID N0.:3所示的核苷酸序列，重链可变区具有SEQ ID N0.:4的核苷酸序列。
[0017]本发明另一方面提供了来源于上述鼠源单克隆抗体的人源化单克隆抗体。与鼠源单克隆抗体相比，人源化单克隆抗体作为治疗药物具有在人体中半衰期长(可长达20天)及免疫原性低等优点，便于长期或反复多次体内使用。本发明中将上述鼠源单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区基因都进行了人源化改造，其中包括框架区和抗原结合区域/互补决定区临近位点的氨基酸置换。该人源化单克隆抗体的特征是其轻链可变区具有SEQ IDN0.:5所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID N0.: 6所示的氨基酸序列。此外，本发明还提供编码该人源化单克隆抗体可变区的DNA分子。其轻链可变区具有SEQ ID N0.:7所示的核苷酸序列，重链可变区具有SEQ ID N0.:8的核苷酸序列。
[0018]本发明的第三方面是提供上述人源化单克隆抗体的衍生体，其特征是该衍生体的轻链抗原互补决定区(complementarity-determining regions, CDR-L)包含 SEQ ID N0.:9，SEQ ID N0.:10及SEQ ID N0.:11的氨基酸序列，其重链抗原互补决定区(⑶R-H)包含SEQ ID N0.:12, SEQ ID N0.:13 及 SEQ ID N0.: 14 的氨基酸序列。
[0019]本发明第四方面是提供了一种表达载体，它含有编码上述人源化单克隆抗体的DNA分子序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
[0020]本发明第五方面提供了一种重组宿主细胞，它由上述表达载体转化而成。该重组宿主细胞或其子代细胞表达上述人源化单克隆抗体。
[0021]本文所采用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
`[0022]本文所采用的术语“人源化单克隆抗体”系将鼠源单克隆抗体的氨基酸序列除保留互补决定区(⑶R)外，其它序列(包括可变区中的框架区序列)全部或大部分替换成人免疫球蛋白的氨基酸序列，以达到通过基因工程手段最大限度地降低鼠源性单克隆抗体的免疫原性。
[0023]本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)。其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
[0024]本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中成为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(Frameworkregions, FR)。抗体重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β -折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR—起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.N0.91-3242，卷1，647-669页(1991))。抗体恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)或补体介导毒性(CDC)。
[0025]本发明的抗体通常可以通过以下方法来制备。
[0026]首先，将含有编码本发明的抗体的基因插入到含有合适的表达调控序列的表达载体中。
[0027]本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制基因表达的序列。表达调控序列包括与目标基因操作性相连的启动子和终止信号。编码本发明抗体的基因(DNA)序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的蛋白质序列人工合成或用PCR法扩增得到。其后可用本领域熟知的各种方法将合成或PCR扩增得到的DNA片段插入到合适的表达载体中。本发明中所用的表达载体可以是本领域技术人员已知的市售表达载体，如Invitrogen公司的ρΟ)ΝΑ3.I表达载体。
[0028]用于接纳表达载体转化的合适宿主细胞一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。在本发明中，较佳的宿主细胞是哺乳动物细胞，尤其是中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。
[0029]表达载体转化的宿主细胞在合适的条件下(如以无血清培养基在细胞培养瓶或生物反应器中贴壁或悬浮培养)培养后，收获培养上清液，然后用包括protein-A亲和层析、离子交换层析、过滤等本领域技术人员熟知的常规分离步骤或手段纯化得到本发明的抗体。
[0030]纯化得到的本发明抗体可以溶于适当的溶剂如生理盐水或PBS液体中，理想的最终溶度可以制备成0.1至100mg/ml之间。
[0031]本发明第六方面提供了一种药物组合物，它含有药学上有效量的如本发明中描述的人源化单克隆抗体或其衍生体以及药学上可接受的载体。
[0032]本文所用的术语“药学上可接受的”是指当该抗体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生过敏或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的抗体蛋白相容，即能与其共混而不会大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子包括糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween ;稳定剂；抗氧化剂；无热原无菌注射用水；生理盐水溶液；磷酸盐缓冲剂等。
[0033]本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型如冻干粉剂、注射剂、滴眼剂等给药，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。
[0034]本发明第七方面提供了上述药物组合物在制备治疗与血管增生相关的疾病的药物制剂中的应用。在本发明的具体实施实例中，描述了该人源化抗体在体内抑制人结肠癌、乳腺癌、横纹肌肉瘤等多种移植肿瘤生长的应用。
[0035]本发明第八方面是提供制备上述人源化单克隆抗体的方法，该方法包括如下步骤:
[0036]a)提供一表达载体，该表达载体含有编码所述人源化单克隆抗体的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；[0037]b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；
[0038]c)在适合所述人源化单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞:和
[0039]d)从该宿主细胞培养液中分离纯化获得所述人源化单克隆抗体。
[0040]为获得可拮抗抑制人VEGF蛋白与其受体(VEGF-R)结合的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系，本发明选取由酵母表达的重组人VEGF165蛋白为免疫抗原，通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，获得分泌高效价的抗VEGF多克隆抗体；再从中挑取小鼠，取其脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合、再经药物筛选及亚克隆等步骤而建立了多株稳定分泌抗人VEGF抗体的杂交瘤单克隆细胞。其中一代号为PV19小鼠杂交瘤细胞株，经ELISA、免疫印迹、免疫组化等多种方法鉴定，证实其所分泌的单克隆抗体能够特异识别并高亲合力结合人VEGF(包括VEGF121、165及VEGF189等主要亚型)。体外测试表明该鼠源单克隆抗体可高效抑制VEGF与其受体(VEGF-R)的结合。在人类移植肿瘤裸鼠模型上的测试结果还表明该鼠源单克隆抗体能有效抑制乳腺癌、横纹肌肉瘤等多种肿瘤在体内的生长。
[0041]本发明通过蛋白分离纯化及基因工程等手段获得了编码该鼠源抗体的重链及轻链可变区基因，并在此基础上完成了该抗体的人源化改造。人源化改造后的抗体基因插入表达载体(P⑶NA3.1)后转入中华仓鼠卵巢(CHO)细胞，获得重组工程细胞，并从重组工程细胞培养液中分离纯化得到具拮抗肿瘤体内增长生物活性的人源化抗体蛋白。该人源化抗体可作为药物组合物成分或制备成合适药物制剂，单独给药或与化疗药物等其他治疗手段合并使用，用于广谱治疗结肠癌、乳腺癌、横纹肌肉瘤等各种实体瘤。
[0042]本发明还公开了该抗体的人源化制备过程及该人源化抗体重链可变区与轻链可变区氨基酸序列。
【专利附图】

【附图说明】
[0043]图1为本发明实施例1中以重组人VEGF165蛋白包板，以ELISA法检测小鼠杂交瘤细胞(PV19)培养上清液与重组人VEGF蛋白结合的实验结果示意图。其中，M23为已知分泌抗人VEGF单抗的杂交瘤细胞上清液，为阳性对照。P16为非相关杂交瘤细胞培养上清液，为阴性对照；SP2/0代表未融合的骨髓瘤细胞培养上清液。
[0044]图2为本发明实施例2中以SDS-PAGE分析鉴定从PV19瘤细胞的培养上清液中经亲合层析柱纯化获得的鼠源PV19单克隆抗体蛋白。图2中，泳道I为DTT还原的PV19抗体蛋白；泳道2为未还原的PV19抗体蛋白；Marker为蛋白质分子量标志。
[0045]图3为本发明实施例3中竞争性ELISA结果的代表性示意图。其中的mPV19&Biotin-VEGF为PV19鼠源抗体组，WlO&Biotin-VEGF为非相关的抗体组，作为阴性对照。
[0046]图4为本发明实施例8中以SDS-PAGE分析鉴定从培养上清液中经亲合层析柱纯化获得的人源化hPV19单克隆抗体蛋白。图2中，泳道I为DTT还原的hPV19抗体蛋白；泳道2为未还原的hPV19抗体蛋白；Marker为蛋白质分子量标志。
[0047]图5为本发明实施例8中以直接ELISA法比较由表达上清中纯化获得的人源化抗体(hPV19)、嵌合抗体(chPV19)及鼠源抗体UPV19)与人VEGF165蛋白结合的相对活性结果示意图。其中的chP16为非相关嵌合抗体，作为阴性对照。
[0048]图6为本发明实施例8中以竞争ELISA法比较人源化抗体(hPV19)、嵌合抗体(chPV19)及鼠源抗体(mPV19)体外阻断生物素标记的人VEGF165蛋白(bio_VEGF)与其受体(VEGFRl)结合的相对活性的结果示意图。其中的WlO为非相关嵌合抗体，作为阴性对照。
[0049]图7为本发明实施例9中以ELISA法比较分析人源化hPV19抗体及Avastin抗体与野生型(VEGF165)及点突变型人VEGF蛋白(VEGF-G88/A)的结合活性的结果示意图。
[0050]图8A及图8B为本发明实施例10中人源化hPV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制人Ls-174-T结肠癌生长的实验结果示意图。其中图8A为实验期间各组相对肿瘤体积增长趋势图；图88为实验结束时与阴性对照组相比，各治疗组平均肿瘤瘤重下降率(瘤重抑制率％)。
[0051]图9A及图9B为本发明实施例11中人源化hPV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制人MD231-MBA乳腺癌生长的实验结果示意图。其中图9A为实验期间各组相对肿瘤体积增长趋势图；图98为实验结束时与阴性对照组相比，各治疗组平均肿瘤瘤重下降率(瘤重抑制
率％)。
[0052]图1OA及图1OB为本发明实施例12中人源化hPV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制人人A673横纹肌瘤结果示意图。其中图1OA为实验期间各组相对肿瘤体积增长趋势图；图1OB为实验结束时与阴性对照组相比，各治疗组平均肿瘤瘤重下降率(瘤重抑制率％)。
[0053]图1lA及图1lB为本发明实施例13中人源化hPV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制人HCT8结肠癌结果示意图。其中图1lA为实验期间各组相对肿瘤体积增长趋势图；图1lB为实验结束时与阴性对照组相比，各治疗组平均肿瘤瘤重下降率(瘤重抑制率％)。
[0054]代号为PV19-5的小鼠杂交瘤细胞株已于2012年03月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微`生物中心(保藏编号为CGMCCN0.5889 ;保藏地点:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)。
【具体实施方式】
[0055]下面将结合实施实例来进一步描述本发明，这些实施例只是为了起说明作用，而不是用来限制本发明。
[0056]实施例1:分泌抗血管内皮细胞生长因子抗体的小鼠杂交瘤细胞系的建立与筛选鉴定
[0057]步骤1.重组人VEGF165蛋白(免疫抗原)的制备
[0058]利用PCR技术从人肺组织细胞cDNA文库中扩增得到编码人VEGF165完整开放读码框架序列(openreading frame, 0RF)的基因片断,经序列测定鉴定正确,用限制性内切酶处理后，将其克隆到酵母表达载体pPic9K(Invitrogen公司)载体中，获得重组表达质粒pPic9K-VEGF165，用其转化毕赤酵母菌后，筛选出高效表达酵母菌。酵母菌经发酵、诱导表达，分离纯化后，获得纯度95%以上的重组人VEGF165蛋白。
[0059]步骤2、动物免疫
[0060]将上述纯化的重组人VEGF165蛋白与弗氏完全佐剂混合，于皮下多点注射Balb/c小鼠(100 μ I/只，共IOyg VEGF165蛋白)。首次免疫2-3周后，小鼠再给予皮下多点注射含VEGF165蛋白与不完全佐剂的混合物，加强免疫2-3次后，取少量小鼠血清，用包被人VEGF165蛋白的96-板以ELISA法检测小鼠血清中抗VEGF蛋白抗体的效价，取效价高者小鼠的脾细胞用于下一步的细胞融合。[0061]步骤3、细胞融合
[0062]在末次免疫后3天，无菌制备小鼠脾细胞悬液，与小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞(购自中国科学院上海生命科学院细胞保藏中心)，以5:1的比例在50%PEG-1000 (Sigma公司产品)作用下融合。融合按常规法(KohlerG.and Milstein CiNature 1975; 256:495-497)，PEG用量lml，I分钟内缓慢加完。反应90秒后，以无血清的RPM1-1640培养基终止反应，1000rpm离心10min，去除上清液，再将离心沉淀下的细胞以含10%HAT(H为次黄嘌呤、A氨基碟呤、T胸腺嘧啶核苷，为Sigma公司产品)的RPMI 1640_10%FCS培养基将细胞浓度调节至I X IO6/ml，加入96孔平底细胞培养板(每孔200μ 1)，于37°C，5%C02培养箱中培养2_3周。
[0063]步骤4、酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选抗体分泌阳性的小鼠杂交瘤细胞[0064]以重组人VEGF165 蛋白(2μ g/ml，pH 9.6,0.1M NaHC03 液)包被酶标板，37°C包被2小时或4°C过夜；2%牛血清白蛋白(BSA) 4°C封闭过夜。经PBS-0.l%Tween20液洗涤后加入待检杂交瘤细胞培养上清(以未融合的SP2/0骨髓瘤细培养上清为阴性对照)37°C孵育2小时；经PBS-0.l%Tween20液洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)-标记的羊抗小鼠IgG(Sigma公司产品)，37°C孵育I小时；再经PBS-0.l%Tween20液充分洗涤后，加入邻苯二胺(OPD) -0.1%H202 底物液显色 10-15min,以 0.1M HCl 终止反应。在 MK3_Multiskan 酶标仪(Thermo Scientific公司产品)中读取492nm处OD值。测得的OD 492值比阴性对照高5-10倍的杂交瘤细胞再克隆化，并进行扩增冻存。
[0065]步骤5、阳性杂交瘤细胞的亚克隆-有限稀释法
[0066]将上述初筛得到的阳性细胞以RPM1-1640_10%FCS培养基稀释至每孔1_10个细胞，铺于96-孔细胞培养板，于37°C，5%C02培养箱中培养2_3周。待克隆长成，取上清液以ELISA再次检测鉴定抗VEGF抗体的分泌。经检测鉴定，获得多个抗体分泌阳性细胞株。其中，经再次亚克隆鉴定，获得了一株代号为P19-5(简称PV19)的稳定分泌抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株。图1为以ELISA法检测鉴定PV19杂交瘤细胞上清液与重组人VEGF165蛋白结合，结果证明该杂交瘤细胞上清液含高效价抗人VEGF165蛋白的抗体。该抗体经鉴定为IgG类。该杂交瘤细胞株再经大量扩增，长期传代培养并于2012年03月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏编号为CGMCC No 5889.保藏地点:中国，北京)。
[0067]实施例2.鼠源抗人VEGF单克隆抗体(PV19)的体外制备及纯化
[0068]本实施例中，鼠抗人VEGF单克隆抗体(PV19)的分离纯化采用亲合层析法。
[0069]其纯化步骤如下:
[0070]将PV19杂交瘤细胞扩增后，接种于200ml无血清的1640培养基中，37 °C培养5天，随后收集培养上清，经过0.45 μ m滤膜过滤后上样至含Protein G-Sepharose FastFlow (购自通用电气GE公司)亲合层析柱；层析柱先以PBS液漂洗去除杂蛋白后，再以低pH(2.7-3.0)甘氨酸(0.1M)液洗脱被吸附的PV19抗体蛋白。洗脱液以lmol/L Tris (pH
8.5-9.0)调节pH至7.0，再对10倍体积的PBS液透析12~16后(期间换液2_3次)，透析后的样品再经0.45 μ m滤膜过滤后即获得纯化的PV19抗体。
[0071]将纯化的PV19抗体按常规方法在DTT还原及未还原条件下进行经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)(分离胶为10%，浓缩胶5%)。图2为该电泳分析结果图谱，其中泳道I为DTT还原的PV19抗体，泳道2为未还原的PV19抗体。如图2所示:与未还原的PV19抗体样品相比后，DTT还原的PV19抗体分离为2条主带，其中处于上面的条带为PV19抗体重链，处于下面的条带为PV19抗体轻链。
[0072]实施例3鼠源PV19单克隆抗体生物活性测定:竞争性ELISA法检测鉴定鼠源PV19单克隆抗体体外阻断VEGF与其受体的结合
[0073]鼠源PV19单克隆抗体的生物活性测定方法之一是竞争性ELISA法检测鉴定抗体体外阻断VEGF与其受体的结合。该竞争性ELISA法的基本原理与过程是先将生物素标记的人VEGF165蛋白与不同溶度的单克隆抗体混合，之后再将混合物转入预先包被有重组可溶性VEGF受体蛋白(如可溶性VEGFRl蛋白)的96-孔板，经孵育及洗脱后，加入酶标记的Avidin (如辣根过氧化物酶标记的Avidin)。再经孵育及洗脱后，加入底物显示并测定OD值。
[0074]检测具体步骤如下:
[0075]1)用重组可溶性人VEGFRl蛋白(美国R&D公司产品)包被96-孔板(2yg/ml，50y I/孔)，4°C过夜；
[0076]2)经PBS液漂洗及2%BSA(稀释在PBS_0.l%tween20液中)室温封闭后，分别加入固定溶度的生物素标记的VEGF165单克隆抗体(Bio-VEGF，1:1000)与不同溶度的PV19抗体，或非相关的抗体(W10)，37°C孵育2h ；
[0077]3)经PBS-T洗脱后，加入辣根过氧化物酶标记的Avidin (1:5000)，37°C孵育1h ；
[0078]4)经PBS-T洗脱后，加入显色液(邻苯二胺)-3%双氧水，室温10min至显色；
[0079]5)加入HCL终止反应，以酶联免疫仪测定492nm波长处各孔的吸光值。
[0080]图3为竞争性ELISA结果的代表性示意图。如图3所示:在PV19抗体(mPV19&Biotin-VEGF)组中，其OD值与抗体蛋白量成反比关系:即加入的PV19抗体的量越高，其OD值越低。而非相关的抗体(WlO&Biotin-VEGF)组，各孔OD值不受加入的抗体蛋白量影响。此结果表明PV19抗体体外可阻断VEGF与其受体(VEGFRl)的结合。
[0081]实施例4.编码鼠源PV19抗体可变区基因的克隆
[0082]取纯化的鼠源PV19抗体，在DTT还原条件下经SDS-PAGE分离重链和轻链，然后将电泳条带转印至PVDF膜，用考马斯亮蓝R250显色后，分别剪取PV19抗体重链和轻链蛋白条带，用Edman降解法进行N-端氨基酸测序，获得该抗体轻链的N-端氨基酸序列。抗体重链由于N-端封闭，常规氨基酸N-端测序未获结果。
[0083]1).PV19抗体轻链可变区基因的克隆
[0084]步骤1、采用试剂盒(江苏海门碧云天公司产品)从小鼠PV19杂交瘤细胞中提取出总 RNA ；
[0085]步骤2、采用逆转录PCR(RT-PCR)方法在印pendorf管获得cDNA模板。其中用于逆转录 PCR 引物(mlg-kappa)序列为:TGTCGTTCACTGCCATCAAT (SEQ ID N0.:15);
[0086]其中RT-PCR反应体系如下:
[0087]
【权利要求】
1.一种拮抗抑制血管内皮生长因子与其受体结合的鼠源单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述抗体的DNA分子或基因，其特征在于，其轻链可变区具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
3.一种拮抗抑制血管内皮生长因子与其受体结合的人源化单克隆抗体，其特征在于，将权利要求1所述的重链可变区和轻链可变区基因进行人源化改造，包括框架区和抗原结合区域/互补决定区的氨基酸置换；所述人源化单克隆抗体的轻链可变区具有SEQ IDN0:5所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列。
4.一种编码权利要求3所述人源化单克隆抗体的DNA分子或基因，其特征在于，其轻链可变区具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
5.一种如权利要求3所述的人源化单克隆抗体的衍生体，其特征在于，所述衍生体的轻链抗原互补决定区具有SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10及SEQ ID NO: 11的氨基酸序列；其重链抗原互补决定区具有SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的DNA分子序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
7.—种重组宿主细胞，其特征在于，它由权利要求6所述的表达载体转化而成。
8.根据权利要求7所述的重组宿主细胞或其子代细胞，其中所述重组宿主细胞或其子代细胞表达权利要求3的人源化单克隆抗体。
9.一种药物组合物，其特征在于，它含有药学上有效量的权利要求3所述的人源化单克隆抗体或权利要求5所述的人源化单克隆抗体的衍生体以及药学上可接受的载体。`
10.权利要求9所述的药物组合物在制备治疗与血管增生相关的疾病的药物制剂中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述疾病包括结肠癌、乳腺癌、横纹肌肉瘤。
12.—种制备权利要求3所述的人源化单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: a)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求4所述的DNA分子序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列； b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞； c)在适合所述人源化单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞:和 d)采用亲合层析从宿主细胞培养液中分离纯化获得所述人源化单克隆抗体。
【文档编号】C12N15/13GK103864932SQ201210543652
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月14日 优先权日:2012年12月14日
【发明者】罗师平, 胡红群, 陈蕞, 蔡明文, 孙亚男, 刘海云, 周建鹰, 宋晓琦, 平小芽, 陈思宇, 石东红, 徐一清, 周群敏 申请人:苏州思坦维生物技术有限责任公司