专利名称：一种耐重金属微生物菌剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及环境生物技术领域，具体涉及一种耐重金属微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
电镀、冶金、蓄电池、制革等行业废水含有Cr6+、Cu2+、Ni2+、Zn2+等重金属离子，生物毒性大，直接排放水体，会对环境造成极大的影响，历来为国内外环保监控的重点对象。微生物法处理重金属废水具有成本低的特点，是近年来重金属废水处理研究的热点。申请号为03821202.1的中国发明专利文献公开了一种用芽孢杆菌属KR1-02或其类似菌株、地衣芽孢杆菌以及葡萄球菌属KR1-04或其类似菌株的细菌经酸处理后得到的菌体的重金属吸附剂组合物，以及用其除去含有重金属的介质中的重金属的方法。申请号为96105506.5的中国发明专利文献公开了一种从曲霉属、青霉属、木霉属或小球菌属微生物制备聚氨基糖化物磷酸钠为重金属生物吸附剂。申请号为200710031098.7的中国发明专利文献公开了一种从剩余活性污泥收集菌泥作为重金属生物吸附剂的 制备方法和应用。CN201010587631.X公开了一种用斜卧青霉(Penicillium decumbens)制备微生物重金属吸附剂的方法。申请号为200710048472.4的中国发明专利文献公开了一种利用脱硫弧菌CB1.268 (Desulfovibrio Sp.)、脱硫肠状菌 CB 1.139 (DesulfotomaculumSp.)和脱硫杆菌CBl.168 (Desulfobacter Sp.)组成的复合菌,碱性条件下，厌氧或兼氧培养生产出纳米FeSx，在酸性条件下与重金属离子生成难溶的金属硫化物沉淀，达到去除废水中金属离子的目的。从已公开的专利看，当前，工程中运用微生物处理重金属废水主要是生物吸附法，该法主要用于电镀废水的原水处理，通过利用微生物细胞表面分泌的胞外多聚糖、糖蛋白可溶性氨基酸等聚合物质的吸附作用和氧化还原酶的异化还原作用来实现对金属离子的吸附、转运和沉淀，从而达到去除废水中的重金属的目的。其本质是一个物理化学作用，与传统的物化法效果相近，其结果虽然可去除大部分重金属，但有机物等非重金属指标非但没有得到改善反而有所上升，无法满足新的水质排放标准。国家在新的电镀行业废水排放标准(GB 21900-2008)中，除了对原有指标的排放标准作了相应的修订外，还增加了有机物、总憐、总氣、氣氣和排放量等新指标。
发明内容
本发明提供了一种耐重金属微生物菌剂及其制备方法和应用，本发明的微生物菌剂不仅可去除部分重金属离子，还可以去除大部分有机污染物。一种乙酸钙不动杆菌菌株，分类命名为乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)，株号为 HDD1，保藏号为 CGMCC N0.6820。该菌株于2012年11月12日保藏于位于北京市朝阳区大屯路的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。—种铜绿假单胞菌菌株,分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa),株号为HDD2，保藏号为CGMCC N0.6821。该菌株于2012年11月12日保藏于位于位于北京市朝阳区大屯路的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的乙酸I丐不动杆菌(Acinetobacter calcoacetcus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)其对各重金属离子的耐受浓度为:Ni2+1000mg/L, Pb2+400mg/L,Cr6+200mg/L, Cu2+1000mg/L, Zn2+8000mg/L。一种耐重金属微生物制剂的制备方法，包括:(I)将保藏号 为CGMCC N0.6820的乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoacetcus)和保藏号为 CGMCC N0.6821 的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)活化后分别在液体培养基中进行液体培养，得菌液A和菌液B ；所述液体培养基中含Ni2+50-500mg/L, Pb2+20_200mg/L，Cr6+10-200 mg/L,Cu2+10-500mg/L, Zn2+100-5000mg/L ；(2)将菌液A和菌液B混合后接种至固体发酵培养基上，28 38°C通风搅拌发酵24 48小时，真空干燥后得耐重金属微生物制剂。步骤(I)所述液体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基或LB液体培养基。步骤(I)中在液体培养基中的培养温度为25_30°C，培养时间为12_48h。步骤(2)中所述固体发酵培养基的组成以重量份计为:麸皮30-50份、玉米芯粉10-20份、豆柏5-15份、淀粉0.5-2份、尿素0.1-2份、谷氨酸钠0.5-2份、硫酸铵0.2-2份、KH2PO4 0.1-0.8份，然后加水调节固体发酵培养基中的水的重量百分比为45-65%，pH值为
6.0_7.2 ο步骤⑵中所述菌液A和菌液B按体积比为1:1混合。一种如所述制备方法制备得到的耐重金属微生物制剂。一种如所述的耐重金属微生物制剂在处理重金属污染废水中的应用，包括:将所述耐重金属微生物制剂溶解在5-10倍量的无菌水中，曝气活化12-48h后流加到废水处理的生化系统中。所述微生物菌剂的添加量为所述生化系统的总有效容积的0.0001-0.01 %。所述重金属污染废水为电镀废水、冶金废水或制革废水。所述生化系统为活性污泥法或生物膜法污水处理的生化系统。与现有技术相比本发明的有益效果:本项目利用筛选、驯化、培养获得耐重金属菌群强化生化处理，可抗中低浓度重金属废水冲击，不仅可去除部分重金属离子，还可以去除大部分有机污染物，结合重金属废水的前处理技术，可以解决重金属废水无法全因子达标的难题，技术具有成本低、效率高特点。
具体实施例方式实施例1采集电镀厂附近不同地点受重金属污染表层下3-lOcm 土壤样3个，在富集培养基中进行分别摇瓶富集培养3d，转接培养3次后，在分离培养基中稀释涂板培养，经多次分离后获得2株单菌落。利用全自动细菌鉴定系统-细胞脂肪酸图谱鉴定系统(MIDI)对2株菌进行鉴定，经鉴定两株菌分别为乙酸钙不动杆菌和铜绿假单胞菌，于2012年11月12日保藏于位于北京市朝阳区大屯路的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。乙酸I丐不动杆菌命名为乙酸I丐不动杆菌(Acinetobacter calcoacetcus) HDDl,保藏号为CGMCC N0.6820 ;铜绿假单胞菌命名为铜绿假单胞菌(Peudomonas aeruginosa)HDD2，保藏号为 CGMCC N0.6821。其中，富集培养基:牛肉膏蛋白胨培养基或LB液体培养基，内含Ni2+、Pb2+、Cr6+、Cu2+、Zn2+各50mg/L ;分离培养基:牛肉膏蛋白胨培养基或LB液体培养基，内含Ni2+、Cr6+、Cu2+、Zn2+各 100mg/L。实施例2采用牛肉膏蛋白胨培养基，配方为牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水lOOOmL，pH7.4 7.6,培养基内含 Ni2+50mg/L, Pb2+20mg/L, Cr6+10mg/L, Cu2+10mg/L, Zn2+500mg/L。将保藏号为CGMCC N0.6820的乙酸I丐不动杆菌(Acinetobacter calcoacetcus)和保藏号为CGMCC N0.6821的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分别经28°C下斜面培养活化12h，然后在500ml三角烧瓶摇床单独培养，培养时间48h，各获得菌液3L ;将上面培养好的6L菌液混合液接种到20L固体发酵罐内，接种量30%，固体培养基成分为麸皮50份，玉米芯粉10份，豆柏15份，淀粉2份，尿素2份，谷氨酸钠0.5份，硫酸铵2份，KH2PO4 0.8份，然后加水调节培养基的含水重量百分比为45%，调节PH 7.2，经温度28°C通风搅拌发酵24小时后，再经真空干燥后制成固体菌剂；经普通琼脂涂板培养检测活体细菌数为101(lCFU/g。实施例3采用牛肉膏蛋白胨培养基，配方为牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g，水lOOOmL，pH7.4 7.6,培养基内含 Ni2+50mg/L, Pb2+20mg/L, Cr6+10mg/L, Cu2+10mg/L, Zn2+100mg/L。将将保藏号为CGMCC N0.6820的乙酸I丐不动杆菌(Acinetobacter calcoacetcus)和保藏号为CGMCC N0.6821的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分别经28°C下斜面培养活化12h，然后在500ml三角烧瓶摇床单独培养，培养时间48h，各获得菌液3L ;将上面培养好的6L菌混合液接种到20L固体发酵罐内，接种量30%，固体培养基成分以重量份为:麸皮50份，玉米芯粉10份，豆柏15份，淀粉2份，尿素2份，谷氨酸钠0.5份，硫酸铵2份，KH2PO40.8份，然后加水调节培养基的含水重量百分比为45%，调节PH 7.2，经温度36°C通风搅拌发酵48小时后，再经真空干燥后制成固体菌剂；经普通琼脂涂板培养检测活体细菌数为 1012CFU/g。实施例4采用LB液体培养基，配方为蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，培养基内含 Ni2+200mg/L，Pb2+100mg/L, Cr6+100mg/L, Cu2+200mg/L, Zn2+2000mg/L。将将保藏号为 CGMCC N0.6820 的乙酸I丐不动杆菌(Acinetobacter calcoacetcus)和保藏号为 CGMCCN0.6821的铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa)分别经28°C下斜面培养活化12h,然后在500ml三角烧瓶摇床单独培养，培养时间24h，各获得菌液3L ;将上面培养好的6L菌混合液接种到20L固体发酵罐内，接种量30%，固体培养基成分按重量份计为:麸皮30份，玉米芯粉20份，豆柏5份，淀粉0.5份，尿素0.1份，谷氨酸钠2份，硫酸铵0.2份，KH2PO40.1份，然后加水调节培养基的含水重量百分比为65%，调节PH 6.0，经温度28°C通风搅拌发酵48小时后，再经真空干燥后制成固体菌剂；经普通琼脂涂板培养检测活体细菌数为1012CFU/g。实施例5采用LB液体培养基，配方为蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，培养基内含 Ni2+500mg/L，Pb2+200mg/L, Cr6+100mg/L, Cu2+500mg/L, Zn2+5000mg/L。将将保藏号为 CGMCC N0.6820 的乙酸I丐不动杆菌(Acinetobacter calcoacetcus)和保藏号为 CGMCCN0.6821的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分别经28°C下斜面培养活化12h,然后在500ml三角烧瓶摇床单独培养，培养时间24h，各获得菌液3L ;将上面培养好的6L菌混合液接种到20L固体发酵罐内，接种量30%，固体培养基成分以重量份计为；麸皮30份，玉米芯粉20份，豆柏5份，淀粉0.5份，尿素0.1份，谷氨酸钠2份，硫酸铵0.2份，KH2P04
0.1份，然后加水调节培养基的含水重量百分比为65%，调节PH 6.0，经温度28°C通风搅拌发酵24小时后，再经真空干燥后制成固体菌剂；经普通琼脂涂板培养检测活体细菌数为108CFU/g。实施例6采用生物强化技术对电镀废水综合出水进行生化处理，采用缺氧/厌氧/好氧(A/A/0)膜法工艺，综合出水水质平均 COD 140mg/L, Ni2+L 8mg/L, Pb2+2.2mg/L, Cr6+L lmg/L,Cu2+4.3mg/L, NH3-N 32mg/L, TP 2.5mg/L，水量 0.5 万 t/d,总水力停留时间 14h。处理单元进水后，添加耐重金属微生物菌剂(由实施例2-5任一实施例制备得到的固体菌剂)进行强化挂膜，菌剂添加`量为总有效容积的0.01 %。闷曝驯化3d后可连续进水。控制水力停留时间从24h缩短到14h。在此期间，生化系统的负荷逐步提高，连续运行半个月后，出水水质趋于稳定。平均出水水质 COD 58mg/L, Ni2+0.67mg/L, Pb2+0.92mg/L, Cr6+0.34mg/L, Cu2+0.85mg/L, NH3-N12mg/L, TP 0.75mg/L,出水主要指标达到电镀污染物最新排放标准(GB21900-2008)，实现各主要重金属离子和有机污染物同步去除。实施例7采用生物强化技术对经过预处理的冶金废水综合出水做进一步生化处理，采用缺氧/好氧(A/0)膜法工艺，综合出水水质平均COD 90mg/L, Zn2+15.5mg/L, Pb2+3.5mg/L,Fe2+0.9mg/L, Cu2+5.4mg/L, As2+L 7mg/L, NH3-N 15mg/L, TP 1.3mg/L,挥发酌.21mg/L,水量
1.0万t/d，总水力停留时间14h。处理单元进水后，添加耐重金属微生物菌剂(由实施例2-5任一实施例制备得到的固体菌剂)进行强化挂膜，菌剂添加量为总有效容积的0.005%。闷曝驯化3d后可连续进水。控制水力停留时间从24h缩短到14h。在此期间，生化系统的负荷逐步提高，连续运行半个月后，出水水质趋于稳定。平均出水水质 COD 26mg/L, Zn2+L 8mg/L, Pb2+0.9mg/L, Fe2+0.44mg/L, Cu2+L lmg/L, As2+0.68mg/L，NH3-N 4.5mg/L, TP 0.2mg/L，挥发酚5mg/L，出水主要指标基本达到废水综合排放标准(GB8978-1996)中的一级B标准，实现各主要重金属离子和有机污染物同步去除。
实施例8 采用生物强化技术对制革废水综合废水进行生化处理，采用缺氧/厌氧/好氧(A/A/0)活性污泥法工艺，综合废水平均COD 3000mg/L, Cr6+L lmg/L, NH3-N 200mg/L，水量1.5万t/d，总水力停留时间28h。处理单元进水后，添加耐重金属微生物菌剂(由实施例2-5任一实施例制备得到的固体菌剂)进行强化，菌剂添加量为总有效容积的0.0001%。闷曝驯化5d后可连续进水。控制水力停留时间从48h缩短到28h。在此期间，生化系统的负荷逐步提高，连续运行半个月后，出水水质趋于稳定。平均出水水质COD 210mg/L, Cr6+0.05mg/L, NH3-N 22mg/L,出水主要指标达到废水综合排放标准(GB8978-1996)中的二级标准，实现各主要重金属离子和有机污染物同步去除·。
权利要求
1.一种乙酸钙不动杆菌菌株，其特征在于，命名为乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoacetcus) HDDl，保藏号为 CGMCC N0.6820。
2.一种铜绿假单胞菌菌株，其特征在于，命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) HDD2，保藏号为 CGMCC N0.6821。
3.一种耐重金属微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括: (1)将保藏号为CGMCC N0.6820 的乙酸I丐不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)和保藏号为CGMCC N0.6821的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)活化后分别在液体培养基中进行液体培养，得菌液A和菌液B ；所述液体培养基中含 Ni2+50-500mg/L, Pb2+20-200mg/L, Cr6+10-200mg/L, Cu2+10-500mg/L, Zn2+100-5000mg/L ； (2)将菌液A和菌液B混合后接种至固体发酵培养基上，28 38°C通风搅拌发酵24 48小时，真空干燥后得耐重金属微生物制剂。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)中在液体培养基中的培养温度为25-30°C，培养时间为12-48h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述固体发酵培养基的组成以重量份计为:麸皮30- 50份、玉米芯粉10-20份、豆柏5-15份、淀粉0.5-2份、尿素0.1-2份、谷氨酸钠0.5-2份、硫酸铵0.2-2份、KH2PO40.1_0.8份，然后加水调节固体发酵培养基中的水的重量百分比为45-65%，pH值为6.0-7.2。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述菌液A和菌液B按体积比为1:1混合。
7.一种如权利要求3或4或5所述制备方法制备得到的耐重金属微生物制剂。
8.按权利要求6所述的耐重金属微生物制剂在处理重金属污染废水中的应用，其特征在于，包括:将所述耐重金属微生物制剂溶解在5-10倍量的无菌水中，曝气活化12-48h后流加到废水处理的生化系统中。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述微生物菌剂的添加量为所述生化系统的总有效容积的0.0001-0.01%。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重金属污染废水为电镀废水、冶金废水或制革废水。
11.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述生化系统为活性污泥法或生物膜法污水处理的生化系统。
全文摘要
本发明公开了一种耐重金属微生物菌剂及其制备方法和应用，菌剂的制备方法包括(1)将保藏号为CGMCC No.6820的醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoacetcus)和保藏号为CGMCC No.6821的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)活化后分别在液体培养基中进行液体培养，得菌液A和菌液B；(2)将菌液A和菌液B混合后接种至固体发酵培养基上，28～38℃通风搅拌发酵24～48小时，真空干燥后得耐重金属微生物制剂。本发明的微生物菌剂不仅可去除部分重金属离子，还可以去除大部分有机污染物。
文档编号C12R1/385GK103087945SQ201210563108
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者李明智, 张刚, 梅荣武, 韦彦斐, 王慧荣, 沈浙萍, 李欲如, 王付超, 蒋涛 申请人:浙江省环境保护科学设计研究院