一种短芽孢杆菌及其应用及发酵产生短杆菌素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种短芽孢杆菌（Bacillus?brevis），其特征在于，所述短芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC?No.6284。还公开了该短芽孢杆菌在发酵产生短杆菌素中的应用。还公开了一种发酵产生短杆菌素的方法，其特征在于，所述方法包括在生成短杆菌素的条件下，将如上所述的短芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。本发明的短芽孢杆菌用于发酵产生短杆菌素，可提高短杆菌素的产量，缩短发酵周期，从而提高短杆菌素的生产能力。本发明的短芽孢杆菌及本发明的方法可为短杆菌素的规模化生产提供有效、可行的技术方案。
【专利说明】一种短芽孢杆菌及其应用及发酵产生短杆菌素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种短芽孢杆菌(Bacillus brevis)及该短芽孢杆菌在发酵产生短杆菌素中的应用，以及采用该短芽孢杆菌发酵产生短杆菌素的方法。
【背景技术】
[0002]短杆菌素(tyrothricin)又名混合短杆菌肽,分为直链短杆菌肽(gramicidin)以及环状短杆菌酪肽(tyrocidine)两类物质，它们都是从短芽孢杆菌的发酵液中提取出来的。
[0003]短杆菌素是一类重要的抗生素物质。对革兰氏阳性菌和一些革兰氏阴性菌来说，直链短杆菌肽和环状短杆菌酪肽都有着很好的杀伤效果，它们其所具有的抗菌性是由于它们能造成细菌细胞壁的渗透性增强，从而使细胞新陈代谢的活动不能正常进行，菌体受到抑制甚至死亡。利用短杆菌素的抗菌性，人们一般将其制成软膏类剂型，用于皮肤化脓性症疾的预防，因此它有离子抗生素之称。
[0004]短杆菌素一般采用短芽孢杆菌发酵产生，但由于产量低、发酵周期长，目前在国内还没有实现规模化生产。为了提高短杆菌素的生产能力，进行短芽孢杆菌的菌株改良，开发具有高产率的菌株是重点的研究方向。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了克服现有技术中短杆菌素产量低，发酵周期长的缺陷，提供一种新的短芽孢杆菌及其应用及发酵产生短杆菌素的方法。
[0006]为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)，其特征在于，所述短芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC N0.6284。
[0007]另一方面，本发明提供了如上所述的短芽孢杆菌在发酵产生短杆菌素中的应用。
[0008]第三方面，本发明提供了一种发酵产生短杆菌素的方法，其特征在于，所述方法包括在生成短杆菌素的条件下，将如上所述的短芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。
[0009]优选地，以每升发酵培养基为基准，短芽孢杆菌的接种量为1X107-9X101Q个孢子。
[0010]优选地，所述发酵的条件包括:温度为30-45°C，起始pH值为5-8，从开始发酵至发酵32-38h的时间段内，通气量为0.4-0.6体积:(体积?分钟)，发酵32_38h后通气量为0.1-0.3体积:(体积.分钟)。
[0011]优选地，所述发酵培养基的原料含有酪蛋白胨、NaCl、酵母浸粉和可溶性淀粉，进一步优选地，以发酵培养基为基准，酪蛋白胨的用量为7-13g/L，NaCl的用量为3_6g/L，酵母浸粉的用量为10_13g/L，可溶性 淀粉的用量为5-15g/L。
[0012]本发明的短芽孢杆菌用于发酵产生短杆菌素，可提高短杆菌素的产量，缩短发酵周期，从而提高短杆菌素的生产能力。采用本发明优选的发酵条件，可进一步提高短杆菌素的产量，进一步缩短发酵周期。采用本发明优选的发酵培养基，可进一步提高短杆菌素的产量。本发明的短芽孢杆菌及本发明的方法可为短杆菌素的规模化生产提供有效、可行的理论基础。
[0013]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0014]生物保藏
[0015]本发明的菌株被命名为短芽孢杆菌(Bacillus brevis),并于2012年6月25日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为 CGMCC N0.6284。
【具体实施方式】
[0016]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0017]一方面，本发明提供了一种短芽孢杆菌(Bacillus brevis)，该短芽孢杆菌的保藏编号为 CGMCC N0.6284。
[0018]另一方面，本发明提供了如上所述的短芽孢杆菌在发酵产生短杆菌素中的应用。
[0019]第三方面，本发明提供了一种发酵产生短杆菌素的方法，该方法包括在生成短杆菌素的条件下，将如上所述的短芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。
[0020]发酵过程就其本质来说是由微生物参与的生物化学反应过程，因此微生物细胞的数量、状态、代谢情况对产物的生物合成有着重要的影响。菌体浓度的大小对发酵产物的产率有着重要的影响。理论上菌体浓度越大，产物的产量也越大，但是菌体浓度过高会产生其他影响，如营养物质消耗过快，发酵液中的营养成分发生明显的改变，如有毒物质的积累等，这些可能改变菌体的代谢途径。因此，本发明中，以每升发酵培养基为基准，短芽孢杆菌的接种量优选为IXlO7到9 X 101°个孢子，进一步优选为3 X IO8到9 X 101°个孢子。
[0021]孢子的数量可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数。
[0022]由于本发明提供的发酵产生短杆菌素的方法相对于现有技术的改进主要在于使用本发明的短芽孢杆菌作为发酵菌种，因此，只要采用本发明的短芽孢杆菌，即可实现本发明的目的，即提高短杆菌素的产量，缩短发酵周期。对于发酵条件和工艺无特殊要求，可以采用本领域常用的发酵条件和工艺，例如，在温度为30-45°C，起始pH值为5-8，通气量为
0.2-0.8体积:(体积.分钟)的条件下进行发酵，一般在恒定的通气量条件下进行发酵。
[0023]本发明的发明人在研究中意外发现，在发酵过程中，从开始发酵至发酵32_38h的时间段内，通气量为0.4-0.6体积:(体积?分钟)，发酵32-38h后通气量为0.1-0.3体积:(体积.分钟)，可进一步提高短杆菌素的产量，进一步缩短发酵周期。因此，优选情况下，发酵的条件包括:温度为30-45°C，起始pH值为5-8，从开始发酵至发酵32_38h的时间段内，通气量为0.4-0.6体积:(体积?分钟)，发酵32-38h后通气量为0.1-0.3体积:(体积?分钟)。
[0024]本发明中，术语“通气量” 一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来 表示(V / V.min)，例如通气比为1:0.1_1，简称通气量为0.1_1体积:(体积.分钟)。[0025]本发明中，发酵周期是指从在发酵培养基中接种开始至发酵液中短杆菌素的含量开始不再变化的这段时间。
[0026]本发明中，发酵培养基为本领域技术人员公知的概念，指微生物发酵所需的供微生物生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。发酵液也为本领域技术人员公知的概念，指接入微生物菌株的液体培养基(该液体培养基也即本发明中所称发酵培养基)，经过一段时间的培养后所得产物。
[0027]根据本发明，对发酵培养基没有特别的要求，只要可以用于短芽孢杆菌发酵的发酵培养基即可。例如可以利用胰蛋白胨、NaCl、酵母浸粉以及可溶性淀粉配制发酵培养基，其中，以发酵培养基为基准，胰蛋白胨的用量为7-13g/L，NaCl的用量为2_8g/L，酵母浸粉的用量为10_13g/L，可溶性淀粉的用量为5-15g/L。
[0028]本发明的发明人在研究中意外发现，发酵培养基的原料含有酪蛋白胨、NaCl、酵母浸粉和可溶性淀粉，可提高短杆菌素的产量，调整酪蛋白胨、NaCl、酵母浸粉和可溶性淀粉的用量，以发酵培养基为基准，酪蛋白胨的用量为7-13g/L，NaCl的用量为3_6g/L，酵母浸粉的用量为10_13g/L，可溶性淀粉的用量为5-15g/L，可进一步提高短杆菌素的产量。因此，本发明优选的发酵培养基含有:酪蛋白胨7-13g/L，NaC13-6g/L，酵母浸粉10_13g/L，可溶性淀粉5-15g/L。
[0029]短芽孢杆菌可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至发酵培养基中之前，将短芽孢杆菌经过种子培养，之后将得到的种子液加入到发酵培养基中。
[0030]本发明中，对于种子培养的方法无特殊要求，可以采用本领域常规的方法进行培养，此为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。种子培养时，以每升种子培养基为基准，短芽孢杆菌的接种量可以为3X 108-9X 101°个孢子。
[0031]根据本发明，对于短芽孢杆菌的种子培养基没有特别的限制，可以采用本领域常规的种子培养基。例如，种子培养基含有牛肉膏、蛋白胨、NaCl,以种子培养基为基准，牛肉膏的用量为4-6g/L，蛋白胨的用量为8-12g/L，NaCl的用量为4_6g/L。
[0032]根据本发明，短芽孢杆菌的种子培养的条件可以在很大范围内改变，例如可以包括:温度为25-45°C，起始pH值为4-8 ;通气量为0.1-2体积:(体积?分钟)，时间65_75h。
[0033]按照本发明方法产生的短杆菌素可以用常规的方法分离并精制，例如，将发酵结束后的发酵液加入1-3重量％的三氯乙酸中，在3-5°C条件下静置过夜，通过离心收获菌体，并用蒸馏水洗涤两次。洗涤后的菌体用乙醇进行两次浸提，再将乙醇提取液合并后，通过酸性氧化铝介质进行减压过滤。过滤后的醇提液使用旋转蒸发仪浓缩，浓缩液注射到NaCl溶液中。将析出的白色物质用超纯水洗涤两次，沉淀经过真空冷冻干燥后即为短杆菌素粗品。
[0034]以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0035]另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0036]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
[0037]实施例
[0038]以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
[0039]在以下实施例和对比例中:
[0040]发酵液中短杆菌素产量的测定方法:
[0041]将5mL发酵结束后的发酵液加入100μ I的三氯乙酸中，4°C静置过夜。以4500rpm，IOmin离心，弃置上清，再用蒸馏水洗涤菌体2次。菌体用2mL乙醇提取6h，离心后将上清醇液取出，再加入ImL乙醇提取2h。将两次乙醇提取液合并后，加入0.5g酸性氧化铝粉末进行脱色。通过在280nm处测定乙醇提取液的吸光值，和短杆菌素标准曲线进行比对，得到发酵液中短杆菌素产量。
[0042]短杆菌素标准曲线的制备:精确称取20mg短杆菌素标准品，用无水乙醇定容到IOOmL容量瓶中，其浓度为200 μ g/mL ;再用无水乙醇将其稀释成160 μ g/mL, 140 μ g/mL,120 μ g/mL, 100 μ g/mL, 80 μ g/mL, 60 μ g/mL, 40 μ g/mL, 20 μ g/mL 不同浓度的稀释液。以短杆菌素标准液的浓度作为横坐标，以280nm处测定的吸光值作为纵坐标，绘制标准曲线。
[0043]以下实施例使用的短芽孢杆菌A均为本发明的上述短芽孢杆菌(该菌株于2012年6月25日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为 CGMCC N0.6284)。
[0044]实施例1
[0045]本实施例用于说明本发明发酵产生短杆菌素的方法。
[0046](I)种子培养基的配制:将牛肉膏、蛋白胨、NaCl混合后定容，以种子培养基为基准，牛肉膏的用量为5g/L，蛋白胨的用量为10g/L，NaCl的用量为5g/L。将IOOmL种子培养基装入300mL三角瓶中，在121°C下在灭菌锅中灭菌0.5h后降温至35°C后待用。
[0047](2)种子培养:将短芽孢杆菌A接入步骤(1)的种子培养基中，以每升种子培养基为基准，短芽孢杆菌的接种量为9 X IO9个孢子。然后在35°C，起始pH值6.0，通气量0.4体积:(体积?分钟)的条件下进行种子培养。培养72h后停止培养，得到种子液。
[0048](3)发酵培养基的配制:将酪蛋白胨、NaCl、酵母浸粉、可溶性淀粉混合后定容，以发酵培养基为基准，酪蛋白胨的用量为9g/L，NaCl的用量为4g/L，酵母浸粉的用量为Ilg/L、可溶性淀粉10g/L。将35mL发酵培养基装入IOOmL三角瓶中，在121 °C下在灭菌锅中灭囷0.5h后降温至38 C后待用。
[0049](4)发酵:将步骤(2)的种子液接入步骤(3)的发酵培养基中，以发酵培养基为基准，短芽孢杆菌的接种量为6 X IO9个孢子，在38°C，起始pH值6的条件下进行发酵，从开始发酵至发酵35h的时间段内，通气量为0.5体积:(体积?分钟)，发酵35h后，通气量为0.2体积:(体积?分钟)，当发酵液中短杆菌素的含量开始不再变化时，停止发酵。统计发酵周期，并测定短杆菌素的产量见表1。
[0050]实施例2
[0051]本实施例用于说明本发明发酵产生短杆菌素的方法。
[0052](I)种子培养基的配制:将牛肉膏、蛋白胨、NaCl混合后定容，以种子培养基为基准，牛肉膏的用量为4g/L ，蛋白胨的用量为12g/L，NaCl的用量为4g/L。将IOOmL种子培养基装入300mL三角瓶中，在121°C下在灭菌锅中灭菌0.5h后降温至30°C后待用。
[0053](2)种子培养:将短芽孢杆菌A接入步骤(1)的种子培养基中，以每升种子培养基为基准，短芽孢杆菌的接种量为6 X IO8个孢子。然后在30°C，起始pH值6.6，通气量1.0体积:(体积?分钟)的条件下进行种子培养。培养65h后停止培养，得到种子液。
[0054](3) 发酵培养基的配制:将酪蛋白胨、NaCl、酵母浸粉、可溶性淀粉混合后定容，以发酵培养基为基准，酪蛋白胨的用量为7g/L, NaCl的用量为3g/L，酵母浸粉的用量为13g/L、可溶性淀粉的用量为15g/L。将35mL发酵培养基装入IOOmL三角瓶中，在121°C下在灭菌锅中灭菌0.5h后降温至35 °C后待用。
[0055](4)发酵:将步骤(2)的种子液接入步骤(3)的发酵培养基中，以发酵培养基为基准，短芽孢杆菌的接种量为3 X IO8个孢子，在35°C，起始pH值6.5的条件下进行发酵，从开始发酵至发酵32h的时间段内，通气量为0.4体积:(体积.分钟)，发酵32h后，通气量为0.1体积:(体积?分钟)，当发酵液中短杆菌素的含量开始不再变化时，停止发酵。统计发酵周期，并测定短杆菌素的产量见表1。
[0056]实施例3
[0057]本实施例用于说明本发明发酵产生短杆菌素的方法。
[0058](I)种子培养基的配制:将牛肉膏、蛋白胨、NaCl混合后定容，以种子培养基为基准，牛肉膏的用量为6g/L，蛋白胨的用量为8g/L，NaCl的用量为6g/L。将IOOmL种子培养基装入300mL三角瓶中，在121°C下在灭菌锅中灭菌0.5h后降温至40°C后待用。
[0059](2)种子培养:将短芽孢杆菌A接入步骤(1)的种子培养基中，以每升种子培养基为基准，短芽孢杆菌的接种量为9 X 101°个孢子。然后在40°C，起始pH值6.8，通气量1.5体积:(体积.分钟)的条件下进行种子培养。培养75h后停止培养，得到种子液。
[0060](3)发酵培养基的配制:将酪蛋白胨、NaCl、酵母浸粉、可溶性淀粉混合后定容，以发酵培养基为基准，酪蛋白胨的用量为13g/L，NaCl的用量为6g/L，酵母浸粉的用量为IOg/L、可溶性淀粉5g/L。将35mL发酵培养基装入IOOmL三角瓶中，在121°C下在灭菌锅中灭菌0.5h后降温至40 C后待用。
[0061](4)发酵:将步骤(2)的种子液接入步骤(3)的发酵培养基中，以发酵培养基为基准，短芽孢杆菌的接种量为9 X 101°个孢子，在40°C，起始pH值7的条件下进行发酵，从开始发酵至发酵38h的时间段内，通气量为0.6体积:(体积.分钟)，发酵38h后，通气量为0.3体积:(体积.分钟)，当发酵液中短杆菌素的含量开始不再变化时，停止发酵。统计发酵周期，并测定短杆菌素的产量见表1。
[0062]实施例4
[0063]本实施例用于说明本发明发酵产生短杆菌素的方法。
[0064]按照实施例1的方法发酵产生短杆菌素，不同的是，发酵培养基采用如下配方:胰蛋白胨的用量为9g/L，NaCl的用量为4g/L，酵母浸粉的用量为llg/L、可溶性淀粉的用量为10g/L。统计发酵周期，并测定短杆菌素的产量见表1。
[0065]实施例5
[0066]本实施例用于说明本发明发酵产生短杆菌素的方法。
[0067]按照实施例1的方法发酵产生短杆菌素，不同的是，在38°C、起始pH值6，通气量为0.4体积:(体积.分钟)的条件下进行发酵。统计发酵周期，并测定短杆菌素的产量见表1。
[0068]对比例1
[0069]按照实施例5的方法发酵产生短杆菌素，不同的是，采用的短芽孢杆菌购于上海北诺生物科技有限公司。统计发酵周期，并测定短杆菌素的产量见表1。
[0070]表1
[0071]
【权利要求】
1.一种短芽孢杆菌(Bacillus brevis)，其特征在于，所述短芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC N0.6284。
2.一种如权利要求1所述的短芽孢杆菌在发酵产生短杆菌素中的应用。
3.一种发酵产生短杆菌素的方法，其特征在于，所述方法包括在生成短杆菌素的条件下，将如权利要求1所述的短芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，以每升发酵培养基为基准，短芽孢杆菌的接种量为IXlO7到9X 101°个孢子。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述发酵的条件包括:温度为30-45°C，起始pH值为5-8，从开始发酵至发酵32-38h的时间段内，通气量为0.4-0.6体积:(体积.分钟)，发酵32-38h后通气量为0.1-0.3体积:(体积.分钟)。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述发酵培养基的原料含有酪蛋白胨、NaCl、酵母浸粉和可溶性淀粉。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，以发酵培养基为基准，酪蛋白胨的用量为7-13g/L，NaCl的用量为3-6g/L，酵母浸粉的用量为10_13g/L，可溶性淀粉的用量为5_15g/L。
【文档编号】C12N1/20GK103897999SQ201210573015
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月25日 优先权日:2012年12月25日
【发明者】郭慧媛, 任发政, 姜鹭, 张宇光 申请人:中国农业大学