专利名称：一种用于禽肺病毒a亚群特异性检测的荧光定量rt-pcr试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测试剂盒，特别涉及一种用于禽肺病毒A亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用，属于病毒检测领域。
背景技术：
禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV)又称火鸡鼻气管炎病毒(turkyrhinotracheits virus, TRTV)。禽肺病毒属于副粘病毒科，肺病毒亚科，偏肺病毒亚属。禽肺病毒引起的疾病最早在火鸡上发现，该病毒引起火鸡的呼吸道疾病并导致产蛋量下降。在鸡上禽肺病毒是引起肿头综合征的重要因素，但APV的致死率不高(2% 5%)。自1978年南非首次报道APV，欧洲和中东多次报道APV，在世界的许多地方APV对火鸡和鸡造成严重的威胁。根据编码禽肺病毒G蛋白的基因不同将欧洲病毒株分为两个亚型，即A亚型APV (APV/A)(英国)和B亚型APV (APV/B)(欧洲大陆)。APV/A亚型与APV/B亚型相似，但G蛋白只有38%的相似率，这两个亚型在欧洲广泛流行。APV/A亚型在南非和英格兰首次分离到:在亚洲的日本、韩国、黎巴嫩和以色列等国家有针对于APV/A亚型的报道。我们对国内的鸡群进行了禽肺病毒血清学调查，结果显示APV普遍感染，发现有的祖代种鸡场的抗体阳性率有的高达100%，这应该引起中国养禽业的足够重视。但尚未知道是哪一种亚型的APV引起的，建立一种快速、灵敏的诊断方法且能快速分型对诊断和控制APV极为重要。尤其是APV/A亚群，中国临近国家如日本、韩国和以色列等已有APV/A亚群的流行的报道，极有可能对中国的养鸡业造成危害。在2008年已有报道在中国东南方的鸡市场检测到APV/A亚群。因此建立一种针对APV/A亚群的高效的诊断方法是当务之急。荧光定量PCR是近年来发展起来的新技术，具有快速、灵敏、特异性强等优点，非常适用于病毒感染的检测，尤其是感染的早期诊断，该方法不仅能精确定量，而且由于其具有探针与引物的双重特异性，从而减少了假阳性。目前，APV的实验室常规诊断方法主要是RT-PCR，但是该方法在用于APV检测时仍在敏感性、特异性和时效性等方面均存在不足，特别是在该病的早期诊断中体现得尤为明显。本研究为针对A亚群APV检测的荧光定量RT-PCR的检测试剂盒及其应用，本发明的检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性，方便快捷且同时能够区分亚群，为APV的早期、分型检测提供了强有力的诊断方法，同时为APV感染、增殖规律的研究提供了重要的检测技术手段，对APV的临床诊断和致病机理的研究具有一定应用价值。
发明内容
本发明 所要解决的技术问题是提供一种用于禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV)A亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR检测试剂盒。为达到以上目的，本发明采用的技术手段为:根据GenBank中，禽肺病毒A亚群序列设计I对针对G基因的引物和I条特异性TaqMan探针，建立了一种快速检测APV A亚群病毒载量的特异性TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并组装了试剂盒。通过对反应条件和反应体系的优化，使得使用本发明的试剂盒进行的荧光定量RT-PCR检测在IXlO3 IX IO9个拷贝.μ L—1范围内具有良好的线性关系，灵敏度达到IO2个拷贝.μ L_\是常规RT-PCR方法的100倍，而且与常规RT-PCR方法相比(BA YON-AUBOYER M, JESTIN V，TOQUIN D, et al Comparison of F-, G-and N-basedRT-PCR protocols with conventional virological procedures for the detectionand typing of turkey rhinotracheitis virus.Arch Virol，1999，144:1091—1109 ;或 DAR A Mj TUNE Kj MUNIR S，et al,PCR-based detection of an emerging avianpneumovirus in US turkey flocks, J Vet Diagn Invest，2001，13(3):201-205 ;或GHARAIBEHIS M，ALGHARAIBEHG Rj Serological and Molecular Detection of AvianPneumovirus in Chickens with Respiratory Disease in Jordan, Poultry science，2007，86 (6): 1677-1681)，使用本发明的试剂盒进行的荧光定量RT-PCR检测可对结果进行实时监控，无需进一步进行凝胶电泳分析。试验表明，使用本发明的试剂盒进行的荧光定量RT-PCR检测与其他禽病病毒无交叉反应，且A亚群的荧光定量RT-PCR与其他亚群的RNA标准品不反应，说明本发明试剂盒具有良好的敏感性和特异性。将备检样品提取RNA后，不用反转录，直接进行荧光定量RT-PCR反应，利用所建立的荧光定量RT-PCR检测试剂盒可以在2h内快速准确地对APV A亚群进行检测，既能进行定性检测，又能准确定量，而且能够将阳性样品的亚群进行准确的判断。本发明的一种用于禽肺病毒A亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于包括特异性扩增禽肺病毒A亚群G基因的特异性引物对和探针，其中所述的引物对中两条引物的核苷酸序列分别如下所示:上游引物:5’GGTACATATTGGCTATAGTC3’(SEQID N0.1 所示)下游引物:5’CTCCTCCATTGTAGTTTCTGCACTCC3’(SEQID N0.2 所示)所述的探针序列如下所示:5’FAM-GTTAGCGTCATAGTTGAACAGTCAGTGTTAG-TAMRA3’ (SEQ ID N0.3 所示)。在本发明中，所述的试剂盒中还可包括反应混合液，T7RNA聚合酶以及不含RNase的双蒸水。其中，反应混合液中包含有PCR扩增所需要的成分:25mmol/L MgCl2以及IOmmol/L dNTPs。所述的反应混合液可为 2XQuantiTect Probe RT-PCR Master Mix,购自 Qiagen公司。进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备禽肺病毒A亚群检测试剂中的应用。及所述的试剂盒在制备以禽肺病毒G基因为靶点区分禽肺病毒亚群试剂中的应用。
图1为荧光定量RT-PCR的动力学曲线；图2为荧光定量 RT-PCR的标准曲线；图3为常规RT-PCR的敏感性试验；图4为使用荧光定量RT-PCR对APV的A、B和C亚群的G基因以及B亚群病毒进行扩增的动力学曲线。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1本发明试剂盒中探针及引物序列的设计和合成根据GenBank中APV的A亚群的G基因序列(GenBank登录号为GA:AY640317.1)设计I对分别针对目的基因的上下游引物:上游引物GAF: 5’ GGTACATATTGGCTATAGTC3’下游引物GAR: 5’ CTCCTCCATTGTAGTTTCTGCACTCC3’及I条特异性Taqman探针: 探针GA: 5，FAM-GTTAGCGTCATAGTTGAACAGTCAGTGTTAG-TAMRA3，。引物由北京六合华大基因公司合成，探针由TaKaRa公司合成。实施例2本发明试剂盒在检测禽肺病毒(APV) A亚群病毒中的应用I材料与方法1.1菌株与质粒E.coli DH5a由本实验室保存，APV的四个亚群的G基因(GenBank登录号分别为Ga:AY640317.1，Gb:AB548428.1，GC:AY590688.1，GD:AJ251085.1)由哈尔滨博仕生物合成并克隆到 pBluescript IIKS ( + )载体上，分别命名为 PBL_Ga，PBL-Gb, PBL-Gc, PBL-Gd 由本实
验室保存。1.2仪器与试剂LightCycler480荧光定量PCR仪购自Roche公司，紫外分光光度计购自GE公司；质粒提取试剂盒购自AxyGen公司；0neStep RT-PCR试剂盒和QuantiTectw Probe RT-PCR试剂盒购自Qiagen公司，T7RNA polymerase购自Pragma公司。1.3探针的设计与合成按照实施例1方法制备。1.4阳性RNA标准品的制备以合成的PBL-Ga, PBL-Gb, PBL-Gc, PBL-Gd质粒为模板，利用T7RNA聚合酶试剂盒分别生成RNA，测其浓度后，换算成拷贝数，并稀释至IOltl个拷贝.yL'-SCTC保存，用前稀释作为阳性RNA标准品。1.5荧光定量RT-PCR反应条件的优化以阳性RNA标准品为模板，在不同退火温度下进行常规RT-PCR反应，扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，确定最佳的引物退火温度。应用矩阵法对荧光定量RT-PCR的引物和探针浓度进行优化，以得到最佳的反应体系和反应条件。1.6荧光定量RT-PCR标准曲线的建立将阳性标准品10倍梯度稀释至浓度范围为IXlO3 IXlO9个拷贝.μΓ1。以稀释的RNA标准品为模板，每个稀释度设3个重复，进行荧光定量RT-PCR检测，绘制标准曲线。1.7敏感性试验将阳性RNAlO倍梯度稀释至最低浓度为10个拷贝.μ L—1，每个梯度做3个重复，进行荧光定量RT-PCR反应，确定检测的敏感性。同时以等量的RNA为模板，进行常规RT-PCR反应，具体引物(Ga/Gx)和退火温度参照文献(BAYON-AUBOYER M, JESTIN V，TOQUIND, et al Comparison of F-,G-and N-based RT-PCR protocols with conventionalvirological procedures for the detection and typing of turkey rhinotracheitisvirus.Arch Virol, 1999，144:1091-1109)。取扩增产物5 μ L，用2%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，比较二者敏感性的差异。1.8特异性试验鸡传染性支气管炎病毒(IBV)，禽流感病毒(AIV H5，AIV H7，AIV H9)，鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)，新城 疫病毒(NDV)，鸡病毒性关节炎病毒(ARV)和网状内皮增生症病毒(REV)等病毒的RNA，利用建立的荧光定量RT-PCR方法对其进行检测，同时利用建立的荧光定量RT-PCR检测APV其他3个亚群的RNA标准品，同时设阴性和阳性对照。2 结果2.1荧光定量RT-PCR反应条件的优化A亚群荧光定量RT-PCR反应体系共为20 μ L，含10 μ L2 X QuantiTect ProbeRT-PCR Master Mix，6.75 μ L 水，0.25 μ L Enzyme，0.125 μ L 探针 GA (20ηΜ)，0.1875 μ L上游引物GAF (40ηΜ)，0.1875 μ L下游引物GAR (40nM),阳性RNA标准品2.5 μ L。反应条件为:48°C 30min,95°C IOmin ；95°C 15sec,60°C lmin，40 个循环。2.2标准曲线的建立通过荧光定量RT-PCR反应条件进行优化，获得了检测APV A亚群的动力学曲线(见图1)和标准曲线(见图2)。标准品浓度从IX IO3 IX IO9个拷贝.μΓ1具有良好的线性关系(Error均小于0.2, LightCycler480分析软件计算得到的Error值为用于拟合线性回归时的单个数据点的平均方差，它代表定量结果的准确性，可以接受的误差值应小于
0.2)。图1x轴为循环阈值，y轴为荧光强度。图2x轴为RNA标准品拷贝数的对数值，y轴为循环阈值。2.3敏感性试验荧光定量RT-PCR能检出的模板最低浓度为IO2个拷贝.μ L_\而常规RT-PCR能检出的模板最低浓度为IO4个拷贝.μ Γ1 (见图3)，表明所建立的荧光定量RT-PCR的敏感性是常规RT-PCR的100倍。2.4特异性试验用荧光定量RT-PCR 对 IBV，AIV Η5，AIV Η7，AIV Η9, IBDV, NDV, ARV 和 REV 进行检测，检测结果均为阴性，这些病毒的扩增曲线均为水平线，未达到检出阈值，而RNA标准品(Ga:AY640317.1)，有良好的扩增。用荧光定量RT-PCR对APV的A、B和C亚群的G基因(GenBank登录号分别为Ga:AY640317.1、Gb:AB548428.1 和 GC:AY590688.1)和 B 亚群病毒 RNA 进行检测，结果只有 A亚群的为阳性，其他两个亚群均为阴性(见图4)。图4x轴为循环阈值，y轴为荧光强度。以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种用于禽肺病毒A亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于包括特异性扩增禽肺病毒A亚群G基因的特异性引物对和探针，其中所述的引物对中两条引物的核苷酸序列分别如下所示: 上游引物:5’ GGTACATATTGGCTATAGTC3’ 下游引物:5’ CTCCTCCATTGTAGTTTCTGCACTCC3’ 所述的探针序列如下所示:5’ FAM-GTTAGCGTCATAGTTGAACAGTCAGTGTTAG-TAMRA3’。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中还包括反应混合液，T7RNA聚合酶以及不含RNase的双蒸水。
3.权利要求1或2所述的试剂盒在制备禽肺病毒A亚群检测试剂中的应用。
4.权利要求1或2所述的试剂盒在制备以禽肺病毒G基因为靶点区分禽肺病毒亚群试剂中的应用。`
全文摘要
本发明公开了一种用于禽肺病毒A亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于包括特异性扩增禽肺病毒A亚群G基因的特异性引物对和探针，其中所述的引物对中两条引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、2所示，所述的探针序列如SEQ ID NO.3所示。使用本发明的试剂盒能够实现对禽肺病毒A亚群病毒的检测，本发明的试剂盒在1×103～1×109个拷贝·μL-1范围内具有良好的线性关系，灵敏度达到102个拷贝·μL-1，是普通RT-PCR方法的100倍，且与其他禽病病毒无交叉反应。结果表明，本发明的试剂盒具有良好的敏感性和特异性，可用于禽肺病毒A亚群的定量检测。
文档编号C12Q1/68GK103103290SQ20131001445
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者高玉龙, 王笑梅, 秦立廷, 王永强, 祁小乐, 高宏雷 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所