一株ba5641基因缺失的炭疽杆菌及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一株BA5641基因缺失的炭疽杆菌及其构建方法。本发明所提供BA5641基因缺失的炭疽杆菌是将炭疽杆菌基因组中的BA5641基因替换为抗性筛选标记物基因，得到的重组菌；所述BA5641基因的编码区序列为序列表中序列2；所述抗性筛选标记物基因为壮观霉素抗性基因；所述壮观霉素抗性基因的核苷酸序列为序列表中序列1的第1032-2161位；所述炭疽杆菌为炭疽杆菌A16R株。实验证明，与炭疽杆菌A16R株相比，该重组菌在L-丙氨酸单独诱导时、在L-丙氨酸和L-脯氨酸共同诱导时、在L-丙氨酸和L-色氨酸共同诱导时，以及在肌苷和L-色氨酸共同诱导时，其芽孢萌发速率均降低。本发明为研制安全性更强的炭疽疫苗提供了新的思路。
【专利说明】一株BA5641基因缺失的炭疸杆菌及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一株BA5641基因缺失的炭疽杆菌及其构建方法。【背景技术】
[0002]炭疽杆菌(Bacillus anthracis)是一种杆状、能形成芽胞的革兰氏阳性杆菌,能够引起人畜的炭疽病，如果不及时治疗，死亡率极高。炭疽是五大人畜共患病之一，危害性极强，对世界各地的人类健康及畜牧业都构成了严重威胁。炭疽杆菌的芽孢接触到皮肤伤口、消化道或呼吸道上皮后，将感染并会导致皮肤炭疽、肺炭疽、肠道炭疽等疾病。肺炭疽最为严重，将很快导致疾病和死亡。炭疽杆菌还被用作生物战剂和制造生物恐怖，对社会稳定构成威胁。故炭痕杆菌相关研究一直广受:关注。
[0003]炭疽杆菌疫苗的研发一直是各国关注的焦点。虽然在屠宰、解剖动物时，接触的主要是炭疽繁殖体，但炭疽感染多为芽孢被动摄入，通过皮肤、黏膜接触、呼吸道吸入和胃肠道摄入而感染。当芽孢进入机体接触血液、淋巴液后，可在20~40min内从休眠状态复苏，通过激活、发芽和长出3个连续阶段形成繁殖体而增殖。
[0004]减毒活芽孢苗采用无荚膜弱毒株，它是炭疽疫苗研制的重要途径。考虑到毒力恢复的潜在危险，只有俄罗斯和我国采用。我国采用杨叔雅等选育的A16R株，绵羊、兔、猴的保护结果显示其对炭疽强毒攻击保护率为75%~100%，人体接种安全，1961年投产使用至今。但因自然病例少，流行病学资料不够充分，接种采用皮上划痕，仍然存在接种剂量难以准确的不足。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种重组菌及其构建方法。本发明所提供的重组菌是BA5641基因缺失的炭痕杆菌。
[0006]本发明所提供的重组菌，是将炭疽杆菌基因组中的BA5641基因替换为含有抗性筛选标记物基因的DNA片段，得到的重组菌。
[0007]所述BA5641基因编码的蛋白为序列表中序列3所不的蛋白。
[0008]所述BA5641基因的编码区序列具体为序列表中序列2(GenBank:NC_003997的弟5126232-5126669 位)。
[0009]所述抗性筛选标记物基因可为壮观霉素抗性基因。
[0010]在本发明的一个实施例中，所述壮观霉素抗性基因的核苷酸序列具体为序列表中序列I的第1032-2161位。
[0011]在本发明的一个实施例中，所述含有抗性筛选标记物基因的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列I的第934-2257位。
[0012]在本发明中，所述炭疽杆菌具体为炭疽杆菌A16R株。
[0013]在基因水平上，更加具体的，本发明所提供的重组菌如下重组菌株:在所述炭疽杆菌A16R株的基因组序列中，将位于核苷酸序列为序列表中序列I的第1-933位所示的DNA片段(即上游同源臂，对应于GenBank号为NC_003997 “Up date:2012_9_27”的序列的第5125293-5126225位)和核苷酸序列为序列表中序列I的第2258-3218位所示的DNA片段(即下游同源臂，对应于GenBank号为NC_003997 “Up date:2012_9_27”的序列的第5126645-5127605位)之间的序列，替换为序列表中序列I的第934-2257位，得到的重组菌株。 [0014]本发明所提供的制备所述重组菌的方法，具体可包括如下步骤:
[0015](a)将如下核苷酸片段克隆至温度敏感型穿梭质粒中，得到重组载体；
[0016]所述核苷酸片度自5’端至3’端依次为:在所述炭疽杆菌的基因组序列中位于所述BA5641基因上游的DNA片段1，所述抗性筛选标记物基因，以及在所述炭疽杆菌的基因组序列中位于所述BA5641基因下游的DNA片段2 ；
[0017](b)将步骤(a)中得到的所述重组载体导入到所述炭疽杆菌，并在所述穿梭质粒的非敏感温度下进行培养，得到重组菌中间体；
[0018](C)将步骤(b)中得到的重组菌中间体在所述穿梭质粒的敏感温度下进行培养，以去除所述重组载体，得到候选重组菌，从所述候选重组菌中获得所述重组菌。
[0019]在上述方法中，所述DNA片段I具体为序列表中序列I的第1-933位核苷酸所示的DNA片段，所述DNA片段2具体为序列表中序列I的第2258-3218位核苷酸所示的DNA片段；
[0020]更加具体的，所述核苷酸片段的序列为序列表中序列I。
[0021]所述温度敏感型穿梭质粒具体为pKSV7质粒；
[0022]步骤(b)中，所述的非敏感温度可为30°C ;步骤(C)中，所述敏感温度可为37-400C，在本发明的一个实施例中，具体为40°C。
[0023]所述方法中，在步骤(a)之前还包括将所述重组载体去甲基化的步骤。
[0024]将所述重组载体去甲基化的方法，具体可包括如下步骤:将所述重组载体导入甲基化酶缺陷的大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；从所述重组大肠杆菌中提取质粒，得到去甲基化的重组载体；
[0025]在本发明中，所述大肠杆菌具体为大肠杆菌SCSI 10。
[0026]上述方法中，步骤(C)中，从所述候选重组菌中获得所述重组菌的方法具体可包括如下步骤:将所述候选重组菌分别在仅含有所述抗性筛选标记物(如壮观霉素)的培养基和仅含有所述重组载体的抗性标记物I (如氯霉素)的培养基中培养，选取在仅含有所述抗性筛选标记物(如壮观霉素)的培养基生长，而在仅含有所述重组载体的抗性标记物I (如氯霉素)的培养基中不生长的菌株，即得到所述重组菌。
[0027]本发明的再一个目的是提供如下(I)或(2)的生物材料:
[0028](I) DNA分子，其核苷酸序列为序列表中序列I所示；
[0029](2)含有步骤(1)中所述DNA分子的重组载体、表达盒、重组细胞系或重组菌；
[0030]所述重组载体具体为将所述DNA分子插入到温度敏感型穿梭质粒中得到的重组质粒;
[0031]所述温度敏感型穿梭质粒具体为pKSV7质粒。
[0032]以上任一所述重组菌在制备炭疽疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。
[0033]本发明所提供的重组菌为炭疽杆菌A16R株的BA5641基因缺失株，实验证明，与炭疽杆菌A16R株相比，该重组菌在L-丙氨酸单独诱导时、在L-丙氨酸和L-脯氨酸共同诱导时、在L-丙氨酸和L-色氨酸共同诱导时，以及在肌苷和L-色氨酸共同诱导时，其芽孢萌发速率均降低。本发明为研制安全性更强的炭疽疫苗提供了新的思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为连接产物化转大肠杆菌DH5a后的菌落PCR鉴定结果。其中，泳道1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10为挑取的克隆(泳道10为阳性克隆)，泳道M为中科瑞泰公司的DNA MarkerIV，目的片段大小约为1K。
[0035]图2为连接产物化转大肠杆菌DH5a后提取质粒的酶切鉴定结果。其中，泳道I为Hind III和EcoR I双酶切的结果，泳道2为未经酶切的原质粒，泳道M为中科瑞泰公司的DNA Marker IV。
[0036]图3为重组载体pKBA5641USD电转大肠杆菌SCSllO后的菌落PCR鉴定结果。其中，泳道1、2、3、4、5、6为挑取的克隆(泳道1-6均为阳性克隆)，泳道M为中科瑞泰公司的DNAMarker IV，目的片段大小约为1K。
[0037]图4为重组载体pKBA5641USD电转大肠杆菌SCSllO后提取质粒的酶切鉴定结果。其中，泳道I为Hind III和EcoR I双酶切的结果，泳道2为未经酶切的原质粒，泳道M为中科瑞泰公司的DNA Marker IV。
[0038]图5为重组载体pKBA5641USD电转炭疽杆菌A16株后的菌落PCR鉴定结果。其中，泳道1、2、3、4、5、6、7、8为挑取的克隆(泳道1_8均为阳性克隆)，泳道9为阳性对照(以重组载体PKBA5641USD为模板)，泳道M为中科瑞泰公司的DNA Marker IV，目的片段大小约为 500bp。
[0039]图6为目的菌株外部引物及内部引物的位置信息及其PCR鉴定结果。其中，A为两对外部引物及一对内部引物的位置信息为两对外部引物及一对内部引物的PCR鉴定结果，I是以A16R菌株的基因组为模板，2是以A16R Δ BA5641:: spc菌株的基因组为模板。
[0040]图7为炭疽杆菌A16R株和A16R Λ ΒΑ5641:: spc突变株芽孢蛋白的双向电泳图。图中所示的点G002、G005、G008和GOll为BA5641蛋白点。
[0041]图8为炭疽杆菌A16R株和A16RABA5641::spc突变株的生长曲线。
[0042]图9为炭疽杆菌A16R株和A16R Δ BA5641:: spc突变株的生理生化鉴定结果。
[0043]图10为高浓度的L-丙氨酸(IOOmM的L-丙氨酸)单独诱导炭疽杆菌A16R株和A16R Δ BA5641:: spc突变株芽孢萌发的萌发曲线。其中的BA5641即表示A16R Δ BA5641:: spc 突变株。
[0044]图11为L-丙氨酸和L-脯氨酸(ImM的L-丙氨酸和IOmM的L-脯氨酸)共同诱导炭疽杆菌A16R株和A16R Δ BA5641::spc突变株芽孢萌发的萌发曲线。其中的BA5641即表不 A16R Δ BA5641:: spc 突变株。
[0045]图12为L-丙氨酸和L-色氨酸(ImM的L-丙氨酸和IOOmM的L-色氨酸)共同诱导炭疽杆菌A16R株和A16R Δ BA5641:: spc突变株芽孢萌发的萌发曲线。其中的BA5641即表示A16R Δ BA5641:: spc突变株。 [0046]图13为肌苷和L-色氨酸(ImM的肌苷和IOOmM的L-色氨酸)共同诱导炭疽杆菌A16R株和A16RA BA5641::spc突变株芽孢萌发的萌发曲线。其中的BA5641即表示A16R Δ ΒΑ5641:: spc 突变株。
[0047]图14为肌苷(ImM的肌苷)诱导炭疽杆菌A16R株和A16R Δ BA5641:: spc突变株芽孢萌发的萌发曲线。其中的BA5641即表示么161?厶845641::8?(3突变株。
【具体实施方式】
[0048]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0049]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0050]pKSV7 质粒:记载在“Smith K, Youngman P.Use of a new integrational vectorto investigate compartment-specific expression of the Bacillus subtilis spoIIMgene[J].Biochimie, 1992，74:705-711.” 一文中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。
[0051]pT-loxp:: spc质粒:记载在“王艳春，姜娜，展德文等.Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除[J].生物化学与生物物理进展，2009, 36(7):934-940.” 一文中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。
[0052]炭疽芽孢杆菌A16R (即炭疽杆菌A16R):记载在“高美琴，刘先凯，冯尔玲等.炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因 缺失突变株构建[J].微生物学报，2009, 49 (I): 23-31.”一文中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。
[0053]实施例1、BA5641基因缺失的炭疽杆菌A16R Δ BA5641:: spc的构建
[0054]一、重组载体pKBA5641USD的构建及其去甲基化
[0055]1、重组载体pKBA5641USD的构建
[0056](I)温敏型质粒线性化
[0057]将温度敏感型穿梭质粒pKSV7 (6.9Kb)用限制性内切酶Hind III和EcoR I酶切线性化，之后0.6%琼脂糖凝胶电泳分离，从凝胶上切下目标条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收线性化载体片段，操作步骤按照说明书进行，得到线性化PKSV7质粒。
[0058](2)目标基因(BA5641)上下游同源臂的获取
[0059]使用Primer premier5.0软件,根据炭疽杆菌Ames株染色体上BA5641基因(序列2，GenBank:NC_003997的第5126232-5126669位，编码序列表中序列3所示的蛋白)上下游序列，设计BA5641基因上下游同源臂序列的引物(TBA5641U_F和TBA5641U_R，以及丁8八56410_?和 TBA5641D_R，如表 I 所示)。
[0060]表1研究中使用的引物
[0061]
【权利要求】
1.重组菌，是将炭疽杆菌基因组中的BA5641基因替换为含有抗性筛选标记物基因的DNA片段，得到的重组菌。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于:所述BA5641基因的编码区序列为序列表中序列2。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于:所述抗性筛选标记物基因为壮观霉素抗性基因； 所述壮观霉素抗性基因的核苷酸序列具体为序列表中序列I的第1032-2161位；或 所述含有抗性筛选标记物基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列I的第934-2257 位。
4.根据权利要求1-3中任一所述的重组菌，其特征在于:所述炭疽杆菌为炭疽杆菌A16R 株。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于:所述重组菌为如下重组菌株:在所述炭疽杆菌A16R株的基因组序列中，将位于核苷酸序列为序列表中序列I的第1-933位所示的DNA片段和核苷酸序列为序列表中序列I的第2258-3218位所示的DNA片段之间的序列，替换为序列表中序列I的第934-2257位，得到的重组菌株。
6.制备权利要求1-5中任一所述重组菌的方法，包括如下步骤: Ca)将如下核苷酸片段克隆至温度敏感型穿梭质粒中，得到重组载体； 所述核苷酸片段自5’端至3’端依次为:在权利要求1-5任一中所述炭疽杆菌的基因组序列中位于所述BA5641基因上游的DNA片段1，权利要求1_5任一中所述抗性筛选标记物基因，以及在权利要求1-5任一中所述炭疽杆菌的基因组序列中位于所述BA5641基因下游的DNA片段2 ； (b)将步骤(a)中得到的所述重组载体导入到权利要求1-5任一中所述的炭疽杆菌，并在所述穿梭质粒的非敏感温度下进行培养，得到重组菌中间体； (C)将步骤(b)中得到的重组菌中间体在所述穿梭质粒的敏感温度下进行培养，以去除所述重组载体，获得所述重组菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述DNA片段I为序列表中序列I的第1-933位核苷酸所示的DNA片段，所述DNA片段2为序列表中序列I的第2258-3218位核苷酸所示的DNA片段；或 所述核苷酸片段的序列为序列表中序列I ;和/或 所述温度敏感型穿梭质粒为PKSV7质粒；和/或 所述非敏感温度为30°C，所述敏感温度为37°C -40°C。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述方法中，在步骤(a)之前还包括将所述重组载体去甲基化的步骤； 所述将所述重组载体去甲基化的方法，具体包括如下步骤:将所述重组载体导入甲基化酶缺陷的大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；从所述重组大肠杆菌中提取质粒，得到去甲基化的重组载体； 所述大肠杆菌具 体为大肠杆菌SCS110。
9.如下(I)或(2)的生物材料: (I)DNA分子，其核苷酸序列如序列表中序列I所示；(2)含有步骤(1)中所述DNA分子的重组载体、表达盒、重组细胞系或重组菌；所述重组载体具体为将所述DNA分子插入到温度敏感型穿梭质粒中得到的重组质粒；所述温度敏感型穿梭质粒具体为PKSV7质粒。
10.权利要求1-5中任一所述重 组菌在制备炭疽疫苗中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK104004696SQ201310062204
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年2月27日 优先权日:2013年2月27日
【发明者】王恒樑, 刘先凯, 高飞, 朱力, 冯尔玲 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所