一种寡养单胞菌及其在降解啶虫脒中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种寡养单胞菌及其在降解啶虫脒中的应用，该菌菌名为寡养单胞菌Stenotrophomonas?sp.XP，已于2010年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC?NO：M?2010375；所述寡养单胞菌Stenotrophomonas?sp.XP能在含酵母粉和啶虫脒的无机盐培养基中培养，并将有毒的啶虫脒降解为无毒的化合物，从而保护了环境，且使用方法简单、经济、无二次污染。
【专利说明】一种寡养单胞菌及其在降解啶虫脒中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种寡养单胞菌，尤其涉及一种能降解啶虫脒的寡养单胞菌。
【背景技术】
[0002]唳虫脒(Acetamiprid)属于氯化烟酰亚胺类新型高效杀虫剂,于1996年由日本曹达株式会社开发并商品化，是继吡虫啉、烯啶虫胺之后的第三个新烟碱类杀虫剂。啶虫脒是一种新型甲基乙酰胺类杀虫剂，具有触杀、胃毒、渗透和内吸等杀虫作用，高效、安全、广谱，对半翅目、鳞翅目、鞘翅目等有效，具有活性高、持效期长、用量少、内吸性强等优点。啶虫脒作为一种神经性杀虫剂，是烟酸乙酰胆碱酯酶受体的作用体，能选择性抑制昆虫神经系统中乙酰胆碱酯酶的受体，表现出与这一受体的极高竞争性结合能力，可抑制烟酸乙酰胆碱的传递，干扰害虫的神经系统化学信号的传递，破坏昆虫中枢神经的正常传导，从而导致昆虫麻痹并最终死亡。
[0003]随着对该杀虫剂研究的不断展开，该杀虫剂的毒性日益显现。Hassani等在其研究中指出，唳虫脒低浓度下会影响蜜蜂对刺激的灵敏度以及损伤蜜蜂的长期记忆。Kocaman等报道指出，体外实验中啶虫脒显示出了对人体外周血淋巴细胞的基因毒性以及细胞毒性:25-40 μ g/ml浓度的啶虫脒处理24及48小时，会显著诱发人体外周血淋巴细胞的姐妹染色单体交换以及染色体畸变，同时使用30-40 μ g/ml啶虫脒会显著诱导细胞微核的产生，表明了啶虫脒会诱发DNA损伤。因而有必要研究该杀虫剂高效降解和转化方法，减少其在环境中残留，降低对益虫及人类危害的目的。
[0004]微生物转化是利用微生物代谢过程中产生的酶系对底物的某一特定部位进行有机反应，在微生物体内或体外促进天然的和人工合成的化学分子的诸多转化反应，反应条件温和、专一性强、高效环保。由于微生物种类繁多、繁殖速度快、代谢能力强等优点，可以考虑使用微生物转化技术降低农残中啶虫脒的含量，并转化获得高值新型农药，减少对益虫及人类的潜在危害。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种能高效降解啶虫脒的寡养单胞菌及其在降解啶虫脒中的应用，所述寡养单胞菌能将有毒的啶虫脒降解为无毒的化合物，保护了环境，且使用方法简单、经济、无二次污染。
[0006]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]一种寡养单胞菌,菌名为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.) XP,已于2010年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏登记号为CCTCC NO:M2010375o中国典型培养物保减中心地址:中国，武汉,武汉大学；邮编:430072。
[0008]所述寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP,来源于生产唳虫脒农药厂的上壤样品、排污口水样，经富集培养、分离得到。
[0009]所述寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP,菌落成半透明乳白色或乳白色,菌落湿润、边缘整齐，多为规则圆形菌落，该菌为一株革兰氏阴性菌，具有极生鞭毛，菌体为短杆状，长约为I μ m,宽约为0.5 μ m,结果见图1。使用16S rDNA基因序列分析,结果显示该菌与假单胞菌属(Pseudomonas sp.)及寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)细菌相似性最高，同时进化树分析结果指出，该菌与寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)进化距离更进，结果见图2。之后针对假单胞菌与寡养单胞菌氧化酶反应实验的不同设计实验，结果指出，该菌为氧化酶反应阴性，与寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)反应结果一致。
[0010]本发明所述的高效降解唳虫脒寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP,在添加.lg/L酵母粉的无机盐培养基中，菌体初始浓度0D600nm为0.04，能够在26小时的培养过程中将lg/L啶虫脒降解完全，结果见图3。
[0011]较佳的，所述无机盐培养基的配方为:每1000ml去离子水中含有.13.3gK2HP04.3H20，4g KH2PO4,0.2gMgS04.7H20，5ml微量金属盐溶液。其中的微量金属盐溶液配方为 1000mL 0.1M 盐酸溶液中含有 0.05g CaCl2.2Η20，0.05g CuCl2.2Η20，0.008gMnSO4.H2O, 0.004g FeSO4.7Η20，0.Ig ZnSO4,0.1g NaMoO4.2Η20，0.05g NaffO4.2Η20。
[0012]较佳的，所述寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP的培养温度为30°C,培养摇床转速为200转/分钟。
[0013]本发明的优点是:所述寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP在高效降解唳虫脒的同时，可以将其转化为C7H9N2Cl,该产物为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP脱去啶虫脒药效基团氰基所得，结果见图5，保护了环境。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP的电镜照片。
[0015]图2为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP16S rDNA基因序列分析比对结果。
[0016]图3为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.) XP生长及降解曲线。.:寡养单胞菌菌株生长曲线；.:菌株降解曲线。
[0017]图4为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP降解及代谢产物鉴定。
[0018]图5为代谢产物质谱鉴定结果。
【具体实施方式】
[0019]下面对发明的实施例作详细说明，本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护不限于下属的实施例。
[0020]实施例1:寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.) XP的分离筛选及鉴定
[0021]1、分离及筛选
[0022]筛菌使用土样分别从上海东风农药厂以及江苏克胜集团厂区采集了土样、排污口水样以及曝气池水样。密封保存后，及时带回实验室进行实验。上样及水样悬浮处理，洗掉砂石后转接入含有一定浓度啶虫脒的选择性培养基与LB培养基(pH 7.0)中(富集培养)中，30°C、200转/分钟震荡培养，菌液长浓后，再次转接入新的含有啶虫脒的选择性培养基中。按照上述操作，反复转接三次，每轮转接后菌液_80°C保存，后续做DGGE分析菌落变化情况。同时从第三轮筛选过程中挑菌液平板划线，挑选出长势较好的单菌落分别培养这些单一菌株，进行农药降解实验，HPLC检测农药降解情况从中筛选出3-4株较好菌株进行后续的生理生化鉴定，以及代谢途径的研究。
[0023]选择性培养基如下:唯一碳源培养基(g1):13.3g K2HPO4 *3H20,4g KH2PO4,0.2gMgSO4.7H20, 5ml无机盐混合液，啶虫脒0.5g，加蒸馏水至1000ml。待以上培养基混匀后，使用已灭菌微孔滤膜过滤除菌至已灭菌的300ml三角瓶中，每瓶装入50ml。无机盐混合液配方为:0.05g CaCl2.2Η20，0.05gCuCl2.2Η20，0.008g MnSO4.H2O,, 0.004g FeSO4.7Η20,0.1g ZnSO4,0.1g NaMoO4.2Η20，和 0.05g NaffO4.2Η20，溶于 1000mL 0.1M 盐酸溶液中。
[0024]2、菌株的鉴定
[0025]如图2所示，使用16S rDNA基因序列分析，结果显示该菌与假单胞菌属(Pseudomonas sp.)及寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)细菌相似性最高，同时进化树分析结果指出，该菌与寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)进化距离更近。之后针对假单胞菌与寡养单胞菌氧化酶反应实验的不同设计实验，结果指出，该菌为氧化酶反应阴性，与寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)反应结果一致。该菌株脂肪酸分析的结果同上述一致。该菌株为革兰氏阴性菌，具有极生鞭毛，菌体为短杆状，长约为I μ m,宽约为0.5 μ m，参考图1。
[0026]该菌株已于2010年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏登记号为 CCTCC NO:M 2010375。
[0027]实施例2:寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.) XP对唳虫脒农药的降解
[0028]在添加lg/L酵母 粉的无机盐培养基(pH 7.0)中，啶虫脒浓度lg/L，30°C，200转/分钟培养情况下，4%的接种量接种，菌体初始浓度0D600nm为0.04，该菌在10小时左右进入对数生长期，通过液相色谱鉴定，26小时啶虫脒可以完全降解。在生长体系中，随着啶虫脒的不断降解、减少，其降解产物也随之生成。啶虫脒在HPLC中出峰时间在5.5分钟左右，降解产物出峰时间为4.25分钟左右，该降解产物为终产物，参考图3和图4。
[0029]无机盐培养基的配方为:每1000rnl去离子水中含有13.3g K2HPO4.3Η20，4gKH2P04，0.2gMgS04 *7H20,5ml微量金属盐溶液。其中的微量金属盐溶液配方为1000mL 0.1M盐酸溶液中含有 0.05g CaCl2.2Η20，0.05g CuCl2.2Η20，0.008g MnSO4.H20,0.004g FeSO4.7H20,0.1g ZnSO4,0.1g NaMoO4.2Η20，0.05g NaffO4.2H20。
[0030]实施例3:寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.) XP对唳虫脒农药降解产物鉴定
[0031]按照实施例2中的培养方法,培养菌株寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP约1L，5500转/分钟离心7分钟，取上清，使用SHB-3循环水多用真空泵真空抽滤后，滤液使用RE52-2旋转蒸发器，减压55°C蒸发浓缩上述液体至约100ml。液体浓缩后为极粘稠液体，然后倒入约100ml氯仿，摇振萃取，以使浓缩后液体中啶虫脒代谢物最大程度溶于氯仿中。之后，取氯仿相(分层后下层)，氮吹浓缩。浓缩后氯仿溶解的代谢产物使用TLC薄层层析分离，紫外灯下画出代谢产物出现的区域，然后使用手术刀将硅胶板上有代谢产物的区域割下。加入适量的TLC展层剂(约IOml)，然后使用KQ-100E型超声波清洗器超声处理30分钟，以使硅胶吸附的代谢产物尽可能多的溶解到展层剂中。取超声后液体上清，做TLC检测，以确定代谢产物已溶解到展层剂中。之后N2吹吹干，干后粉末使用l_2ml氯仿溶解，使用0.22 μ m滤膜过滤，滤液用于气相、气质联用及核磁共振检测。
[0032]结合啶虫脒GC-MS标准品谱图及啶虫脒分子结构图，由于知道啶虫脒的分子量为222.68Da，可以看出质谱图右侧的222Da处峰应为分子离子峰，221Da处的峰应为啶虫脒分子被打掉一个氢原子的结果，参考图5。
[0033]各主要离子峰对应的啶虫脒集团为:
[0034]Mw = 222.0Da处，为啶虫脒分子离子峰位置(CltlH11ClN4)，即[M]+ ；
[0035]Mw = 221.0Da处，为啶虫脒分子打掉一个H原子结果，即[M]+_H+ ；
[0036]Mw = 207.0Da处，为啶虫脒分子打掉一个甲基后结果，即[M]+_CH3 ；
[0037]Mw = 181.0Da处，为啶虫脒分子打掉CH3-CNH之后的结果，即[M]+-CH3-CNH
[0038]Mw = 166.0Da 处，为[Cl-C5H3N-CH2-N-CN] + [0039]Mw = 152.0Da 处，为[Cl-C5H3N-CH2-N-C] +
[0040]Mw = 141.0Da 处，为[Cl-C5H3N-CH2-N]+H+
[0041]Mw = 126.0Da 处，为[Cl-C5H3N-CH2] +
[0042]Mw = 112.0Da 处，为[Cl-C5H3N] +
[0043]Mw = 67.0Da 处，为[CH3-C = N-C = N] +
[0044]Mw = 42.0Da 处，为[N-C = N] +2H+
[0045]由分子离子峰155Da左右可以推断，该降解产物的分子式为Cl-C5H3N-CH2-NH-CH3,即啶虫脒结构除掉最右端[CH3-C = N-C = N]结构后的产物。
[0046]核磁波谱分析其各主要裂分峰如下:
[0047]分子离子峰:[M+]° = 156，(符合N规则)，CL37的同位素峰为158，基本符合3: I的同位素分布。
[0048][M+] -H = 155，126 为[M+]_30，即[Cl-C5H3N-CH2]+，113 为 Cl-C5H4N, 78 为 C5H4N, 44为-CH2-NH-CH3。
[0049]从H谱的各峰归属:H谱的溶剂峰不知是哪一种，目前把无法确定的4.6~4.9的峰暂时划归溶剂H.(可能是CH3OD)。其中8.3，IH为6-位；7.8，IH为3-位；7.4，IH为4-位；3.73，2H 为-CH2 ；3.05，IH 为-NH ; 1.9，3H 为-CH3 ;其他可能为 H2O 的氢峰。
[0050]从C谱来看:150可归属为2-位C ; 139归属为6-位C ; 134归属为5-位C ; 130归属为4-位C ；124归属为3-位；34归属为-CH3的C ；47左右可能为溶剂峰(推测可能是CD3OD) ；48 为-CH2 的峰。
[0051]综合以上GC-MS以及核磁共振的结果，可以确定ACE-6-8降解啶虫脒的产物结构的分子式为 Cl-C5H3N-CH2-NH-CH3O
【权利要求】
1.一种寡养单胞菌，其特征在于:其菌名为寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.XP,已于2010年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC NO:M2010375。
2.—种权利要求1所述寡养单胞菌在降解啶虫脒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其中所述寡养单胞菌Stenotrophomonassp.XP在添加酵母粉和啶虫脒的无机盐培养基中培养。
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述无机盐培养基的配方为:每1000ml去离子水中含有 13.3g K2HPO4.3H20、4g KH2P04、0.2gMgS04.7H20 和 5ml 微量金属盐溶液；所述微量金属盐溶液的配方为=1000mL 0.1M盐酸溶液中含有0.05gCaCl2.2H20、0.05gCuCl2.2Η20、0.008g MnSO4.H2O,0.004g FeSO4.7Η20、0.lgZnS04、0.1g NaMoO4.2H20 和0.05g NaffO4.2H20。
5.根据权利要求3所述的应用，其中所述无机盐培养基中啶虫脒的浓度为Ig/ L0
6.根据权利要求3所述的应用，其中所述寡养单胞菌Stenotrophomonassp.XP的培养温度为30°C。
7.根据权利要求3所述的应用，其中所述寡养单胞菌Stenotrophomonassp.XP的培养摇床转速为200转/分钟。
8.根据权利要求3所述的应用，其中所述酵母粉的浓度为1g/L。
【文档编号】C12R1/01GK103571769SQ201310121725
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年4月9日 优先权日:2012年4月17日
【发明者】许平, 唐鸿志, 胡海洋, 李健, 陶飞 申请人:上海交通大学