p66Shc重组腺病毒载体及构建和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种p66Shc重组腺病毒载体，是利用基因工程技术，将人p66Shc片段与pAdeno?X-CMV载体在体外同源重组后，转化感受态菌，筛选正确的重组腺病毒并将其线性化后转染HEK293A细胞，在HEK293A细胞内包装并大量扩增。本发明的p66Shc重组腺病毒载体感染人子宫颈癌细胞(Hela)后可使细胞的生长增殖受到明显抑制，而感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)则不发生明显的生长抑制效应。本发明的p66Shc重组腺病毒载体有望达到特异性抑制肿瘤细胞生长的作用。
【专利说明】p66Shc重组腺病毒载体及构建和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及p66Shc重组腺病毒的构建及应用，是利用分子克隆技术、包括PCR扩增基因、体外重组连接等，获得能够感染各种细胞的p66Shc重组腺病毒载体，探讨了此载体对人子宫颈癌细胞(Hela细胞系)和人脐静脉内皮细胞增殖的不同影响，为进一步研制可特异性抑制肿瘤细胞生长的腺病毒基因治疗制剂奠定了实验基础。
【背景技术】
[0002]p66Shc是调控哺乳动物细胞氧化应激及生命周期信号转导途径的关键蛋白，由原癌基因 ShcA 编码(B1chim B1phys Acta, 1797,952-960 (2010))。p66Shc 蛋白含有几个基本功能区:I) N末端磷酸化酪氨酸结合结构域(PTB)，在其36位氨基酸上有一个磷酸化丝氨酸残基及一个与线粒体细胞色素C结合区(CB)。它们是诱导线粒体细胞ROS产生的关键位点与区域，在调控细胞氧化应激及凋亡反应中起关键作用(Arch B1chem B1phys,486,73-80(2009)) ;2)C端Src同源2区(SH2) ；3)中央富含脯氨酸结构域(CHl) ;4)N，端富含脯氨酸结构域(CH2) (Trends B1chem Sci, 21, 257-261 (1996) ;J B1l Chem, 272,28042-28049 (1997) ；EMB0 J，16，706-716 (1997))。李西川等研究发现小细胞肺癌是肺癌中恶性程度最高的一种， 转移快，存活率低。他们发现ShcA家族中的成员p66Shc在小细胞肺癌细胞中表达缺失，将p66Shc基因导入p66Shc表达缺失的鼠肺癌细胞中并通过鼠尾静脉注射入小鼠体内，能够100%抑制肿瘤细胞的转移，说明p66Shc的缺失是小细胞肺癌细胞转移的主要原因。另有报道p66Shc是调节氧化应激下凋亡应答和衰老信号转导途径的重要基因，可通过引起线粒体中活性氧自由基产生导致细胞氧化损伤，敲除p66Shc可增强细胞对氧化应激的抵抗能力，如Menini等发现,p66Shc基因敲除鼠,可减少STZ诱导的I型糖尿病肾病肾组织的氧化损伤，保护肾脏组织结构和功能，降低蛋白尿，抑制NF-KB的活性，降低AGE的形成(Diabetes，55，1642-1650 (2006))。而p66Sh c的过表达则与机体内氧化应激的增加密切相关(Cell, 122,221-233(2005) ；Nature, 402, 309-313 (1999) ;PNAS，107，13420-13425(2010))。另外，高葡萄糖，血管紧张素II (Ang II)可诱导p66shc磷酸化，通过PKCβ-p66Shc-Plnl_CytC信号通路，导致小管细胞损伤(Am J Phys1l Renal Phys1l,299，F1014-1025(2010))。根据这些报道，目前认为p66Shc基因与细胞内活性氧水平密切相关，而对于p66Shc基因对于细胞增殖方面的作用还未见报道。
[0003]本发明利用分子克隆技术、包括PCR扩增基因、体外重组连接等，获得能够感染各种细胞的p66Shc重组腺病毒载体，探讨了此载体对人子宫颈癌细胞(Hela细胞系)和人脐静脉内皮细胞的增殖的不同影响，为进一步研制可特异性抑制肿瘤细胞生长的腺病毒基因治疗制剂奠定了实验基础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种p66Shc重组腺病毒载体，所述载体的核苷酸序列SEQ IDNO:1。
[0005]本发明的另一个目的是提供上述载体的构建方法，通过以下步骤获得:
[0006](I)获取目的基因
[0007]将含有质粒pcDNA3.1his p66shc的菌株涂布于抗生素平板，筛选阳性克隆，挑取单个克隆于LB培养基中振荡生长至0D_值0.8，离心收集菌体，用无内毒素质粒大提试剂盒(TIANGEN)提取质粒，以所提质粒为模板进行PCR扩增获得p66Shc，再用琼脂糖胶回收法纯化目的基因。获得的目的基因p66Shc的两侧分别含有与pAdeno X-CMV上重组位点两端同源的15bp碱基对。用于扩增的上下游引物(由Invitrogen合成)分别为:上游引物(SEQ ID NO:2):
[0008]5’ gtaactataacggtcatggatct cctgccc-3’ ；下游引物(SEQ ID NO:3):
[0009]5，-attacctctt tctcctcac agtttccgctcca-3’，用于扩增的聚合酶为 PrimeSTARHS DNA polymerase with GC Buffer (TaKaRa)?
[0010](2)克隆 pAdeno X_p66Shc
[0011]100ngp66Shc (两端分别连接了 15bp的同源臂)与200ng pAdenoX-CMV混合,加入In-Fus1n HD Enzyme (Clontech)，50°C孵育 15min,体外同源重组原理见图1。取 1.5 μ I 反应液加入一管感受态菌(100 μ I)中进行转化。转化过程:冰上孵育30min，42°C热激90s，冰上孵育2min后立即加入900 μ I SOC培养基，37°C振荡培养Ih后取100 μ I均匀涂布于氨苄青霉素平板，37°C培养过夜后挑取单个克隆。
[0012](3) pAdeno X-p66Shc 质粒的鉴定
[0013]挑取的单个克隆取少量作为模板进行菌落PCR，筛选引物分别为:上游引物(SEQ ID NO:4):5，-tagtgtggcggaagtg tgatgttgc-3，；下游引物(SEQ ID NO:5):5’ -taccgtagctgagcttctag-3’，选取能扩增出3.7kb左右片段的的单个菌落于LB培养基中振荡生长至OD6tltl值0.8,离心收集菌体用NucleoBond Xtra Midi (Macherey-Nagel)提取重组腺病毒质粒，质粒经Xho I限制性内切酶酶切，琼脂糖电泳分析后进行测序(Invitrogen)。
[0014](4)异丙醇沉淀回收线性化pAdenoX_p66Shc质粒
[0015]10 μ g pAdeno X_p66Shc质粒经Pac I酶切暴露其倒置终端重复序列。线性化的质粒经异丙醇沉淀纯化回收:酶切反应液10y I与70μ I异丙醇混合，4°C，13000g离心30min,弃取上清加入lml70 %乙醇洗漆,室温，13000g离心1min,弃去上清后置于超净台中干燥十分钟，加入10 μ I无菌去离子水溶解质粒DNA。
[0016](5)人p66Shc腺病毒颗粒的产生
[0017]0.8 μ g 线性化 pAdeno X_p66 质粒与 2 μ I lipofectamine2000 混合溶于 100 μ I无血清无双抗MEM培养基(HyClone)中，室温孵育20min，加入一孔单层ΗΕΚ293Α细胞中(24孔板培养，前一天传代使转染时细胞达到90-95%汇合)，370C，CO2孵箱温育，4h后更换新鲜的5%小牛血清DMEM培养基，24h后1: 10传代，继续培养。每天于倒置显微镜(Olympus CKX31)下观察细胞状态，1d后吹打离心收集细胞，反复冻融3次裂解细胞，简单离心沉淀细胞碎片，取上清细胞裂解液感染正常HEK293A细胞获取高滴度病毒。
[0018]本发明的再一个目的是提供所述的载体可在大部分细胞中大量表达p66Shc蛋白，并可特异性抑制肿瘤细胞生长而对正常细胞生长无明显抑制作用，通过以下实验证明:
[0019](I)感染人p66Shc缺陷型重组腺病毒的Hela细胞和人脐静脉内皮细胞中p66Shc蛋白的表达:将收集的含人p66Shc腺病毒颗粒的细胞裂解液分别感染Hela细胞和人脐静脉内皮细胞48小时后收集细胞提取蛋白，采用Western Blot检测其中p66Shc蛋白的表达水平。
[0020](2)感染人p66Shc缺陷型重组腺病毒对Hela细胞生长曲线的影响:将Hela细胞传代，计数，加入12孔板中，2X105/孔，分为实验组(加入含p66Shc缺陷型重组腺病毒的细胞裂解液0.01 μ 1/103细胞)和对照组(加入含有绿色荧光蛋白的缺陷型重组腺病毒处理)，每天每组分别计数三个孔的细胞数，取平均值，连续计数六天后，绘制生长曲线图。
[0021](3)感染人p66Shc缺陷型重组腺病毒对人脐静脉内皮细胞生长曲线的影响:将人脐静脉内皮细胞传代，计数，加入24孔板中，1.5 X 15/孔，分为实验组(加入含有p66Shc缺陷型重组腺病毒的细胞裂解液0.06μ 1/103细胞)和对照组(加入含有绿色荧光蛋白的缺陷型重组腺病毒处理)，每天每组分别计数三个孔的细胞数，取平均值，连续计数六天后，绘制生长曲线图。
[0022](4) Hel a细胞感染人p66Shc缺陷型重组腺病毒48小时后的MTT实验:将Hela细胞传代，计数，加入96孔板中，4X 13/孔，分为5个剂量组(最低剂量组加入含有p66Shc缺陷型重组腺病毒的细胞裂解液0.0025 μ 1/103细胞，之后每组剂量2倍递增)和对照组(加入含有绿色荧光蛋白的缺陷型重组腺病毒处理)，每组5个平均孔，处理48小时后，每孔加入ΜΤΤ20μ 1，避光37°C孵育4小时，然后弃去培养基，加入二甲基亚砜150μ I/孔，置摇床上振荡10分钟使结晶物充分溶解，选择490nm波长在酶联免疫检测仪上检测各孔吸光度值，用t检验比较各组间的差异。
[0023](5)人脐静脉内皮细胞感染人p66Shc缺陷型重组腺病毒48小时后的MTT实验:将人脐静脉内皮细胞传代，计数，加入96孔板中，8X 13/孔，分为5个剂量组(最低剂量组加入含有p66Shc缺陷型重组腺病毒的细胞裂解液0.02 μ 1/103细胞，之后每组剂量2倍递增)和对照组(加入含有绿色荧光蛋白的缺陷型重组腺病毒处理)，每组5个平均孔，处理48小时后，每孔加入ΜΤΤ20 μ 1，避光37°C孵育4小时，然后弃去培养基，加入二甲基亚砜150 μ I/孔，置摇床上振荡10分钟使结晶物充分溶解，选择490nm波长在酶联免疫检测仪上检测各孔吸光度值，用t检验比较各组间的差异。
[0024]本发明的优点在于:⑴利用基因工程技术，将人p66Shc基因片段与pAdenoX-CMV进行体外同源重组后，转化感受态菌，筛选正确的重组腺病毒质粒并将其线性化后转染HEK293A细胞，在HEK293A细胞内包装并大量扩增。(2)为制备理想的肿瘤基因治疗制剂奠定了实验基础，可应用于抑制肿瘤细胞生长，首次证明该基因在细胞中的表达与肿瘤细胞的生长抑制相关。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为重组腺病毒载体构建示意图。
[0026]图2显示参考例I中感染了人p66Shc缺陷型重组腺病毒48小时后的Hela细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中p66Shc蛋白的表达情况，对照组用含有绿色荧光蛋白的缺陷型重组腺病毒处理，实验组用含有人p66Shc缺陷型重组腺病毒的细胞裂解液处理。
[0027]图3显示参考例2中感染了人p66Shc缺陷型重组腺病毒的Hela细胞和对照组细胞的生长曲线。
[0028]图4显示参考例3中感染了人p66Shc缺陷型重组腺病毒的人脐静脉内皮细胞和对照组细胞的生长曲线。
[0029]图5显示参考例4中感染了不同剂量人p66Shc缺陷型重组腺病毒的Hela细胞和对照组细胞的48小时MTT结果比较。IX的剂量为0.0025 μ 1/103细胞。
[0030]图6显示参考例5中感染了不同剂量人p66Shc缺陷型重组腺病毒的人脐静脉内皮细胞和对照组细胞的48小时MTT结果比较。IX的剂量为0.02μ 1/103细胞。
【具体实施方式】
[0031]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0032]实施例lp66Shc重组腺病毒载体的构建与表达
[0033](I) pAdenoX-p66Shc 的克隆
[0034]pAdenoX-p66Shc 重组质粒经 Xho I 酶切，电泳分析共包含 1445，2466，3320，5629，8046,五个条带,条带大小均与重组质粒上酶切位点的数量与分布一致。经过进一步测序验证确认pAdenoX-CMV的重组克隆位点已准确连接了目的基因p66Shc的开放阅读框。
[0035](2)人p66Shc腺病毒颗粒的产生
[0036]将经Pac I酶切线性化后的pAdeno X_p66Shc重组质粒转染HEK293A细胞后第10天在倒置显微镜下可观察到特征性细胞病变效应(CPE)，即细胞变圆，折光性增强，并开始出现明显噬斑甚至细胞脱落，收集的细胞裂解液(初代腺病毒)感染HEK293A细胞48h后，感染组细胞95%以上变圆飘起呈串珠状。
[0037](3)感染人p66Shc缺陷型重组腺病毒的Hela细胞和人脐静脉内皮细胞中p66Shc蛋白的表达
[0038]将收集的含人p66Shc腺病毒颗粒的细胞裂解液分别感染Hela细胞和人脐静脉内皮细胞48h后收集细胞提取蛋白，采用Western Blot检测其中p66Shc蛋白的表达水平，均观察到相对分子质量55-72KDa间特征条带，其大小与p66Shc蛋白基本吻合，且其含量较对照组细胞明显增高(图2)。
[0039]实施例2p66Shc重组腺病毒载体抑制肿瘤细胞生长作用
[0040]本发明构建的p66Shc重组腺病毒载体感染人子宫颈癌细胞(Hela细胞)，发挥抑制Hela细胞增殖的作用。
[0041](I)Hela细胞感染p66Shc重组腺病毒后增殖速度明显减低:从Hela细胞的生长曲线可以看出，感染p66Shc重组腺病毒24h后，Hela细胞的增殖速度持续降低，与对照组(以感染绿色荧光蛋白重组腺病毒载体(Ad-GFP)的Hela细胞作为阴性对照)相比有统计学意义(第2、3天,P < 0.05 ;第4、5、6天，p < 0.01)(图3)。Hela细胞感染人p66Shc缺陷型重组腺病毒48h后的MTT实验显示，当加入的含有p66Shc缺陷型重组腺病毒的细胞裂解液量达到0.02 μ 1/103细胞后开始对Hela细胞的增殖产生明显影响，与对照组相比有统计学意义(P < 0.05)(图5)。
[0042](2)人脐静脉内皮细胞(HUVECs)感染p66Shc重组腺病毒后增殖速度无明显改变:从HUVEC的生长曲线可以看出，感染p66Shc后连续6天，HUVEC细胞数与对照组相比无统计学意义(图4)。人脐静脉内皮细胞感染人p66Shc缺陷型重组腺病毒48h后的MTT实验显示，高于Hela细胞最高感染剂量8倍的p66Shc缺陷型重组腺病毒感染对人脐静脉内皮细胞的增殖仍无明显影响(图6)。
【权利要求】
1.一种p66Shc重组腺病毒载体,所述载体中插入的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所不。
2.根据权利要求1所述的一种p66Shc重组腺病毒载体的构建方法,其特征在于,通过以下步骤实现: (1)设计上游引物SEQ ID NO:2:5’ -gtaactataacggtc atggatctcctgccc-3’ ；下游引物 SEQ ID NO:2:5，_attacctctttctcc tcacagtttccgctcca-3’，上下游引物 5’端分别包含与pAdeno X-CMV载体上重组位点两端同源的15bp碱基对； (2)p66Shc基因PCR纯化物与pAdenoX-CMV载体在体外重组酶(In-Fus1nHD Enzyme)的作用下进行同源重组连接； (3)阳性重组腺病毒质粒的鉴定，片段在34kb左右者做测序鉴定。
3.根据权利要求1所述的一种p66Shc重组腺病毒载体具备可特异性抑制肿瘤细胞生长而对正常细胞生长无明显抑制作用的特点。
4.根据3的p66Shc重组腺病毒载体，其中肿瘤细胞选取人子宫颈癌肿瘤细胞系，正常细胞选取人脐静脉内皮细胞。
5.根据3或4的p66Shc重组腺病毒载体，其中人脐静脉内皮细胞细胞是原代细胞。
6.根据3到5任何一项的p66Shc重组腺病毒载体存在于细胞裂解液中。
7.根据6的细胞裂解液，其中细胞是HEK293A细胞系。
8.根据6或7的细胞裂解液，其裂解前的细胞数是3X 106。
9.根据6至8的细胞裂解液，其加入细胞培养基的量至少0.01 μ 1/103细胞。
【文档编号】C12N15/861GK104073517SQ201310120623
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年3月28日 优先权日:2013年3月28日
【发明者】胡刚, 林雅军, 徐蓉, 魏洁, 程建华 申请人:卫生部北京医院