酶活性提高的甘露聚糖酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种酶活性提高的甘露聚糖酶，其氨基酸序列为将序列编号2第216位的酪氨酸改以色氨酸取代修饰的序列。
【专利说明】酶活性提高的甘露聚糖酶 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及一种甘露聚糖酶，尤指一种酶活性提高的甘露聚糖酶。 【背景技术】
[0002] 植物细胞壁主要由纤维素（cellulose)、半纤维素（hemicellulose)及木质 素（lignin)三种物质所组成，其中以纤维素含量最多，半纤维素次之。甘露聚糖为半 纤维素中的一个重要成份，甘露聚糖主要可分成四类：直链甘露聚糖（linear mannan)、 葡萄甘露聚糖（glucomannan)、半乳甘露聚糖（galactomannan)和半乳葡萄甘露聚糖 (galactoglucomannan)。这些多糖体主要是由甘露糖（mannose)为基本单位，以β -1，4-糖 苷键（glycosidic bond)键结成骨架。内切性甘露聚糖酶（end〇-0-mannanase)为分解 自然界中大量存在的聚甘露糖的主要酶之一，这类酶能对β -1，4-糖苷键（glycosidic bond)进行随机水解作用。此甘露聚糖酶常见于许多细菌以及真菌之中。
[0003] 近年来，随着自然界半纤维素资源的开发，甘露聚糖酶的工业利用价值也渐受重 视，并且被广泛地应用于不同工业上，如：造纸工业、食品及饲料工业等。在纸浆及造纸业 中，甘露聚糖酶可用来破坏半纤维素与木质素之间的键结，有利于木质素的去除，大幅降低 漂白剂及氯的用量。在食品应用上，可以当作果汁饮料的澄清剂及降低咖啡豆加工时的粘 度，减少蒸发浓缩的成本。而在动物饲料工业上可当做饲料添加剂，提高动物对饲料的转换 率。然而针对不同工业的应用，甘露聚糖酶也需有符合其不同的适用条件与范围，例如：高 耐热性、高活性及耐酸碱性等，如此在工业应用上才有其商业价值及竞争性。因此，找出符 合不同工业上所需的酶蛋白也是目前学术及产业界持续努力的目标。
[0004] 为了得到更符合需求的酶蛋白，目前大致上可分为两个方向去进行：其一是从自 然界中筛选合适的酶基因，例如目前已从嗜碱菌Bacillus sp. N16-5中分离出耐碱的甘露 聚糖酶，其最适pH值为ρΗ10· 0 ;而具耐酸性的酶，则由嗜酸菌Aspergillus sulphureus分 离出来。另一个途径就是将现有已产业化的酶蛋白再加以进行基因改造，以符合不同产业 的需求。
[0005] 而现今改造酶蛋白主要有两大策略：其一是随机突变（random mutagenesis)或 是将酶基因随机排列，再在特定的作用条件之下，筛选出更符合其作用条件的酶蛋白。举例 来说，有学者将Armillariella tabescens的MAN47基因采取随机突变的易错聚合酶连锁 反应（error-prone PCR)技术，将基因序列随意突变之后，送入Saccharomyces cerevisiae 系统表达。在筛选了 100多株突变株后，得到比野生株更具耐酸碱性及耐高温的甘露聚糖 酶。此策略的好处是无须深入研究酶的结构或作用机制，而是直接在特定的条件下随机去 找出更好的酶蛋白。然而，缺点即是需要大量的人力以及时间去进行大量的筛选，并且此方 法也需要有很好的大量筛选方法来配合。
[0006] 另一种改造策略则是藉由研究酶的三维结构与作用机制，找出对于酶活性或特 性具有关键性的氨基酸，并针对这些特定氨基酸进行定点突变与测试，进而得到功能性 更强的改造酶蛋白。举例来说，Cartmell等人解出外切性甘露聚糖酶（exo-mannanase) CjMan26C蛋白立体结构后，发现其与内切性甘露聚糖酶CjMan26A在结构上有很高的相似 度。经由结构相互比对分析后，发现CjMan26C有四个氨基酸在空间上的位置与CjMan26A 有明显的不同，而此四个氨基酸皆位于靠近活性区的环状结构（loop)里。在经由突变了 CjMan26C这四个氨基酸后，成功的将CjMan26C活性反应模式由外切性甘露聚糖酶转变为 内切性甘露聚糖酶。由此可知，分析蛋白立体结构可提供许多有助于改造特性的信息，让研 发人员可以只针对这些特定氨基酸来进行改造，减少大量人力筛选的时间，来得到适合不 同工业产业应用的甘露聚糖酶。
[0007] 因此，本发明欲藉由研究甘露聚糖酶的三维结构，对一些特定的氨基酸进行基因 突变，进而有效提升甘露聚糖酶在工业上应用的产业价值。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于改造现有甘露聚糖酶，利用结构分析及定点突变技术，有效提 升甘露聚糖酶的作用活性，藉以增加甘露聚糖酶的工业应用价值。
[0009] 为达上述目的，本发明优选实施方式之一为提供一种甘露聚糖酶，其氨基酸序列 系为将序列编号2第216位的酪氨酸改以色氨酸取代修饰的序列。编码该序列编号2的基 因系筛选自黑曲霉（Aspergillus niger BK01)的甘露聚糖酶基因，该甘露聚糖酶系为耐热 性及耐酸性甘露聚糖酶，且其氨基酸序列系为序列编号4的氨基酸序列。又，该甘露聚糖酶 系应用于食品工业、饲料工业、以及造纸工业。 【专利附图】
【附图说明】
[〇〇1〇] 图1显示甘露聚糖酶ManBK的基因及氨基酸序列。
[0011] 图2显示甘露聚糖酶ManBK的蛋白立体结构图与瑞氏木霉菌（Trichoderma reesei)的甘露聚糖酶与甘露二糖（mannobiose)结合的复合体结构的重叠结构图。
[0012] 图3显示定点突变所采用的引物序列。
[0013] 图4显示甘露聚糖酶ManBK的Y216W突变型的基因及氨基酸序列。
[0014] 图5显示甘露聚糖酶的活性测试结果。
[0015] 图6显示甘露聚糖酶的酶动力学试验结果。 【具体实施方式】
[〇〇16] 体现本发明特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的 是本发明能够在不同的实施方式上具有各种的变化，然其皆不脱离本发明的范围，且其中 的说明及图式在本质上系当作说明之用，而非用以限制本发明。
[0017] 本发明系从黑曲霉（Aspergillus niger BK01)筛选出甘露聚糖酶（ManBK)基因， 其所表达的甘露聚糖酶蛋白具高耐热性及耐酸性，也因此具有潜在的工业应用价值。为了 增加此耐热性甘露聚糖酶的工业应用价值，本发明首先利用X-ray结晶学技术，将此酶蛋 白的三维立体结构解析出来。然后将此甘露聚糖酶结构与瑞氏木霉菌的甘露聚糖酶（57% 蛋白序列相似度）与甘露二糖结合的复合体结构作重叠比对。针对其活性区或具有关键性 特性的氨基酸来做修改，以增进此酶蛋白的作用活性。以下将详述本发明改造甘露聚糖酶 蛋白的方法及其所得到的改良甘露聚糖酶蛋白。
[0018] 首先，选择黑曲霉（Aspergillus niger BK01)的甘露聚糖酶（ManBK)基因作为 目标基因，如图1所不，ManBK基因的全长为1038个喊基（DNA序列以序列编号1标ττΟ以 及345个氨基酸（氨基酸序列以序列编号2标示）。将ManBK基因利用Xbal以及Ndel限 制酶切位构筑到pPICZaA载体中。构筑步骤当中，聚合酶连锁反应（polymerase chain reaction, PCR)所用的引物为 5' -GGTATTGAGGGTCGCGCGGCGGCGGCGGCGATGTCCTTCGCTTCCACT TCCG-3'（正向引物）及 5' -AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAGCGGAACCGATAGCAGC-3'（反向引物）。 再将该重组质粒转入感受态细胞（competent cell)中，形成野生型表达载体。
[0019] 为了利用X-ray结晶学技术解出ManBK的蛋白结构，首先利用Hampton公司的 商业化筛选（screen kit)，其中配置了许多不同的养晶条件，大致包含了盐类，如：氯化钠 (NaCl)、硫酸铵（Ammonium Sulfate)等；缓冲液，如：Tris、HEPES等；以及沉淀剂，如：聚 乙二醇（PEG)等。以10mg/ml浓度以上的蛋白质，在各个不同的养晶条件中，藉由蒸气扩 散法（vapor diffusion method),在室温下以座滴式（sitting drop method)进行养晶。 找出适当的养晶条件后，再进而从其条件进行调整修正，例如：调整不同的盐类及沉淀剂浓 度，以找到最佳的养晶条件后，利用X-ray获得绕射图谱，最后利用分子置换法（molecular replacement method)，并经由计算机运算之后解出ManBK蛋白立体结构。
[0020] 图2即显示本发明利用X-ray结晶学技术解出的ManBK蛋白立体结构图与瑞氏 木霉菌的甘露聚糖酶的重叠结构图，其中瑞氏木霉菌的甘露聚糖酶结构是与甘露二糖结合 的复合体结构。ManBK蛋白立体结构属于（β/a )8barrel折叠（fold)，其结构内部由8个 β-sheet形成桶状构造，外部则被8个a-helix围绕着。藉由研究甘露聚糖酶结构，本发 明针对其活性区或具有关键性特性的三十多个氨基酸来做修改。根据蛋白结构重叠比对的 结果，ManBK蛋白序列第216位的酪氨酸（Y216)位于蛋白立体结构中的活性区内，故被选择 作为进行定点突变的位置之一，且发现针对Y216来进行定点突变能提升甘露聚糖酶活性。 其它的突变没有增强活性的效果，在此即不再赘述。以下即说明本发明定点突变、蛋白表达 及活性测试方法。
[0021] 本发明系利用定点突变技术（site-directed mutagenesis)以野生甘露聚糖酶 基因做为模版进行聚合酶连锁反应步骤，当中所用的突变引物如图3所示，该突变引物系 设计为可将甘露聚糖酶第216位的氨基酸由酪氨酸突变成色氨酸。接着加入Dpnl限制 酶于37°C下作用，将原始模板去除，再把突变质粒送入大肠杆菌感受态细胞中以抗生素 (Ampicillin)作初步筛选，并藉由DNA定序步骤确认成功突变基因。因此，本发明构筑了一 个突变株Y216W，Y216W意指为甘露聚糖酶第216位的氨基酸由酪氨酸突变成色氨酸，而此 突变株的序列列于图4中，其中突变株Y216W的DNA序列以序列编号3标示，氨基酸序列则 以序列编号4标示。
[0022] 接着在毕赤酵母中表达重组甘露聚糖酶基因，其系将甘露聚糖酶的野生型及突变 型的重组基因利用Pmel把DNA质粒进行线性化之后，藉由电转步骤将DNA送入毕赤酵母 内。接着将菌液涂于含有l〇〇yg/ml Zeocin抗生素的YH)培养基于30°C下进行培养两天。 再挑选菌落并接种到5ml YPD于30°C下培养，再次接种到50ml BMGY中于30°C下培养至隔 天。接着，将培养基换成含有〇. 5%甲醇的20ml BMMY以诱导蛋白表达，同样培养于30°C下。 每隔24小时取样并补充0. 5%甲醇。在经过4天的蛋白质诱导表达之后，将菌液以3500rpm 转离心并收集上清液用以准备下一步的纯化。
[0023] 藉由快速蛋白质液相层析仪（fast protein liquid chromatography, FPLC)纯化 收集好的野生型及突变型甘露聚糖酶上清液。依序利用镍离子层析管柱以及DEAE阴离子 交换管柱分离出蛋白纯度达95%以上的野生型及突变型甘露聚糖酶蛋白，并以5mg/ml浓度 在25mM Tris ;150mM NaCl ;pH7. 5条件下保存于-80°C。DEAE阴离子交换管柱分离出蛋白 纯度达95%以上的野生型及突变型甘露聚糖酶蛋白，并以5mg/ml浓度在25mM Tris ;150mM NaCl ;pH7. 5条件下保存于-80°C。
[0024] 为了验证野生型与突变型甘露聚糖酶的差异，我们进一步测量其酶活性及酶动力 学试验。甘露聚糖酶的活性测试方式主要是将0.3%刺槐豆胶（locust bean gum)与适当 浓度的酶蛋白，其缓冲液为〇. 05M pH5. 3的柠檬酸溶液，以9 :1比例混合一起，在50°C下反 应5分钟。接着加入1. 5倍体积的1%DNS于100°C沸水中作用5分钟，以停止反应且呈色。 在0D540波长测定吸光值，再换算成酶活性单位（unit)。其中酶活性的标准曲线是由甘露 糖标准溶液0-14 μ mol/ml之间制定，而lunit的定义为每分钟释放1 μ mole产物所需的酶 蛋白量。
[0025] 图5显示甘露聚糖酶的活性测试结果。由结果得知，将Y216突变成色氨酸的突变 型Y216W其比活性为784unit/mg，高于野生型甘露聚糖酶的646unit/mg，与野生型酶相比 其比活增加了 19%。
[0026] 在酶动力学试验方面先以1%刺槐豆胶当做底物来与不同浓度的酶反应，找出最 适的酶反应浓度。再以此最适的酶浓度与不同浓度的刺槐豆胶（〇. 5-10mg/ml)在最适条件 下测定酶活性，之后以底物浓度对酶反应速率做图，最后再以Michaelis-Menten model及 曲线分析实验数据求得Km及kMt值。
[0027] 图6显示甘露聚糖酶的酶动力学试验结果。结果显示突变型Y216W的酶转换速率 (k Mt)明显高于野生型，其Km值虽然略高于野生型显示其与底物的亲和力较低，但另一方面 也代表其释放底物的速率较快。因此，一般工业应用在底物浓度很充足的条件下，突变型 Y216W酶活性高于野生型甘露聚糖酶。
[0028] 综上所述，为了提升甘露聚糖酶的活性，本发明系将甘露聚糖酶ManBK的三维立 体结构解析出来，并针对位于蛋白立体结构活性区内的Y216进行定点突变，将其由酪氨酸 突变成色氨酸，而此Y216W突变型可有效增进酶之活性，故在工业应用上能降低其生产成 本并增加其应用在产业上的竞争力。此外，由于此甘露聚糖酶具高耐热性，可应用在许多具 高温制程的工业上，一旦酶活性被提升，就相对使得成本下降及利润提高。因此，本发明利 用基因改造的方式成功地增加甘露聚糖酶的酶活性，也相对地减少了制程成本，进而有效 提升高耐热性甘露聚糖酶在工业上应用的产业价值。由于上述优点系为现有技术无法获得 的，故本发明的酶活性提高的甘露聚糖极具产业价值，依法提出申请。
[0029] 本发明得由本领域技术人员能力范围内而为诸般修饰，然皆不脱离后附权利要求 书的保护范围。
[0001]
[0002]
[0003]
【权利要求】
1. 一种甘露聚糖酶，其氨基酸序列是将序列编号2第216位的酪氨酸改以色氨酸取代 修饰的序列。
2. 如权利要求1所述的甘露聚糖酶，其中编码所述序列编号2的基因是筛选自黑曲霉 (Aspergillus niger BK01)的甘露聚糖酶基因。
3. 如权利要求1所述的甘露聚糖酶，其中所述甘露聚糖酶是耐热性及耐酸性甘露聚糖 酶。
4. 如权利要求1所述的甘露聚糖酶，其中所述甘露聚糖酶的氨基酸序列系是序列编号 4的氨基酸序列。
5. -种编码权利要求1所述的甘露聚糖酶的核酸分子。
6. -种重组质粒，其包含权利要求5所述的核酸分子。
7. 权利要求1-4中任一项所述的甘露聚糖酶在工业中的应用，其中所述工业选自食品 工业、饲料工业、以及造纸工业。
【文档编号】C12N15/56GK104109661SQ201310135208
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年4月17日 优先权日:2013年4月17日
【发明者】郭瑞庭, 黄建文, 郑雅珊, 吴姿慧, 赖惠琳, 林正言, 黄婷沅 申请人:东莞泛亚太生物科技有限公司