抗人her2和人igf-ir的双特异性抗体及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供一种抗人HER2和人IGF-IR的双特异性抗体，包含特异性结合HER2的第一抗原结合域和特异性结合IGF-IR的第二抗原结合域，第一和第二抗原结合域都由一对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)组成；第一抗原结合域为可与HER2特异性结合的抗体可变区结构域；第二抗原结合域为可与IGF-IR特异性结合的抗体可变区结构域。制备方法主要包括：合成编码所述抗体的cDNA序列；将cDNA序列插入工具载体，构建表达载体；将表达载体在宿主细胞中表达和分离纯化表达的双特异性抗体。本发明用于制备治疗人类癌症尤其是人类乳腺癌的药品。
【专利说明】抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药【技术领域】，具体涉及一种抗人类表皮生长因子受体2 (HER2)和人胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R或IFG-1R)的双特异性抗体及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]细胞表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)酪氨酸激酶受体家族共有四种受体，包括 erbBl (EGFR 或 HER1)、erbB2 (HER2/neu)、erbB3 (HER3)和 erbB4 (HER4)。这类受体是一种跨膜受体，其细胞外片段与配体结合后(除HER2以外)形成同源性二聚体或异源性二聚体而被激活，其细胞内片段具有酪氨酸激酶活性。细胞外片段有四个区域，I区和III区与配体结合，而富含半胱氨酸的II区与IV区参与受体的二聚化(Hynes NE & LaneHA.Nat Rev Cancer.2005 ；5(5):341-54.)。HER2的表达状况直接影响上皮细胞的增殖、分化和存活。已有的临床研究发现在正常乳腺组织中HER2呈低表达，但是约有20%~30%人类乳腺癌患者伴有HER2的过度表达。过度表达的HER2向细胞核发送很强的生长刺激信号，肿瘤中HER2越多，肿瘤的侵袭性越强。
[0003]赫赛汀(Herceptin, trastuzumab)是美国Genentech公司和UCLA联合研发的HER2蛋白的人源化单克隆抗体，1998年9月FDA批准上市用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌。Herc印tin能结合到HER2/neu受体的细胞外片段参与受体二聚化的第四区域，它通过与HER2特异性结合，阻断受体激活后的细胞信号传递，进而抑制依赖`HER2过度扩增的肿瘤细胞生长甚至使肿瘤消退(Nahta et al.Curr Pharmacogenomics Person Med.2009 ；7:263-274.)。Here印tin的早期临床研究显示，它能把晚期(转移性)乳腺癌的总体存活率从20.3个月增加到25.1个月。可是，虽然Herc印tin对HER2有很大的亲和性，而且Herc印tin毒性小可以大剂量使用，但是60-70 %的HER2阳性病人对单一 Herc印tin不起作用(Lu et al.J Natl Cancer Inst.2001 ；93 (24):1852-7.；Vogel et al.J ClinOncol.2002 ；20(3):719-26.)。事实上，几乎所有的乳腺癌病人在接受Herceptin治疗一年内都会对Herceptin产生耐药性，使得肿瘤极具侵袭性而且更可能在全身扩散(BaselgaJ.Eur J Cancer.2001 ；37 (Suppll):18-24.)。耐药的机理有多种，包括磷酸酶和张力蛋白同系物 PTEN (phosphatase and tension homo log)失活，或者存在变异的 HER2 (p95HER2,没有细胞外区域)，或者通过激活其他酪氨酸激酶受体，例如IGF-1R。
[0004]膜岛素样生长因子(insulin-likegrowth factor-1, IGF-1 或 IFG-1)信号途径不仅在乳腺的正常发育中起到一定作用，也能调节乳腺癌的发生、存活、发展和转移以及药物耐受性(Carboni et al.Cancer Res.2005 ；65 (9):3781-7 ;Dunn et al.CancerRes.1998 ；58 (15):3353-61 ;Nahta et al.Cancer Res.2005 ；65 (23):11118-28 ;Lu etal.J Natl Cancer Inst.2001 ;93 (24):1852-7.)。胰岛素样生长因子受体(IGF-1R 或IFG-1R)也是一种酪氨酸激酶受体，是一种由两条多肽链组成的四聚体受体，每条肽链由细胞外的α-亚基和跨膜的亚基组成，胞外的α-亚基与配体结合，而胞内部分的的β-亚基具有酪氨酸激酶功能，α-亚基之间以及α-亚基与β-亚基之间有二硫键连接(Ullrich et al.EMBO J.1986 ；5(10):2503-12.)。与其配体 IGF-1 结合后，IGF-1R 引起胰岛素受体底物I(IRS-1)磷酸化，从而介导激活多种下游的信号网络，包括促进细胞分裂的信号通路(Ras/Raf/MAPK)和抗细胞凋亡/生存通路(PI3K_Akt/mT0R)。这些信号通路的激活具有促进细胞分裂、分化和防止细胞凋亡的作用，还能促进血管新生和肿瘤细胞的侵润，在多种癌症如乳腺癌、前列腺癌和肺癌的发病机理过程中起着很重要的作用。同时IGF-1R的抗细胞凋亡作用使得癌症细胞能抵抗化疗药物或者放疗的杀肿瘤细胞作用。在乳腺癌方面，IGF-1R的高表达发生在大约40%的病人中；当用了 EGFR抑制剂如erlotinib或者HER2抗体Herc印tin来抑制EGFR/HER2的信号通路以后，IGF-1R参与形成异源性二聚体，允许EGFR/HER2信号通路在存在EGFR/HER2抑制剂的情况下重新被激活，从而使肿瘤细胞对EGFR/HER2抑制剂产生抗药，这个过程被称之为HER和IGF-1R之间的串话(cross-talk)(Jin & Esteva.JMammary Gland Biol Neoplasia.2008 ; 13 (4):485-98.)。Lu 等利用两种人乳腺癌细胞系MCF-7/HER2-18和SKBR3，证明了 IGF-1R在Herc印tin耐药性中的重要作用。在共同过度表达HER2/neu受体和IGF-1R的MCF-7/HER2-18细胞上，Herc印tin只有在IGF-1R信号传导被抑制的情况下才有明显的抑制细胞生长作用。而在主要过度表达HER2/neu受体但很少表达IGF-1R的SKBR3细胞上，Herceptin的抑制细胞生长作用非常明显，且不受IGF-1浓度的影响。当SKBR3细胞的基因被改变而高表达IGF-1R，并且与IGF-1 —起培养时，Herc印tin则失去了抑制细胞生长的作用。培养液中加入IGF-结合蛋白_3后，Herceptin 又恢复了抑制作用(Lu et al.J Natl Cancer Inst.2001 ；93 (24):1852-7.)。因此IGF信号途径的抑制已逐渐成为乳腺癌治疗的一个重要靶点，这些药物可以直接用来治疗乳腺癌，也可以帮助逆转Herceptin的耐药性，如辉瑞研发的一种抗IGF-1R的单克隆抗体Figitumumab (也叫CP-751871)，被开发用于治疗多种癌症例如肾上腺皮质癌和非小细胞型肺癌(NSCLC) (Gualberto A & Karp DD.Clinical lung cancer 2009 ； 10 (4):273-80.),和 Amgen研发的 IGF-1R单克隆抗体 ganitumab (AMG479) (Tap et al.Journal ofClinical Oncology, 2012 ；30:1849-1856.)，目前也在临床试验中与 Herceptin 合用治疗HER2阳性的转移性乳腺癌；ImClone研发的Cixutumumab (IMC-A12)与Iapatinib在临床试验中联合使用用于治疗转移性乳腺癌；Merck研发的Dalotuzumab (MK-0646, h7C10)也是一个IGF-1R单克隆抗体,也在不同的临床试验中。所以可以用抗IGF-1R的抗体和Herceptin结合使用来克服Herceptin的耐药性。
[0005]同时靶向IGF-1R和HER2是一种很有希望的改善抗HER2药物用于治疗HER2阳性的晚期乳腺癌疗效的策略。⑴IGF-1R能与HER2相互作用并激活HER2，IGF-1R信号系统的增强与 Herceptin 的耐药性有关(Lu et al.J Natl Cancer Inst.2001 ；93 (24):1852-7.)。(2)在耐受trastuzumab和gef itinib的乳腺癌细胞上有IGF-1R和HER2的异源性二聚体的存在(Jones et al.Endocr Relat Cancer.2004 ；11 (4):793-814.；Nahta etal.Cancer Res.2005 ；65(23):11118-28.)。(3)抗 IGF-1R 药物如 TKI (AG538)能恢复耐受trastuzumab 细胞对 trastuzumab 的敏感性，并减少活力(Nahta et al.CancerRes.2005 ；65(23):11118-28.)。(4) IGF-结合蛋白 3 (IGFBP3)通过阻断 IGF-1 介导的 IGF-1R 的激活，而抑制耐受 trastuzumab 的细胞的生长(Lu et al.JNatl Cancer Inst.2001 ；93 (24):1852-7.), IGFBP3 也能恢复耐受 trastuzumab 的细胞对 trastuzumab 的敏感性(Jeromeet al.Cancer Res.2006 ；66 (14):7245-52.)。(5)联合使用 trastuzumab 和转染显性阴性IGF-1R能协同抑制MCF7/HER18细胞的生长，这种细胞同时高表达HER2和IGF-1R(Camirandet al.Med Sci Monit.2002 ；8(12):BR521_6.)。(6)抗 IGF-1R 单克隆抗体 alpha_IR3能破坏HER2/IGF-1R的相互作用，恢复耐受trastuzumab的细胞对trastuzumab的敏感性(Nahta et al.Cancer Res.2005 ；65(23):11118-28.)。(7)去甲二氢化愈创木酸(Nordihydroguaiaretic acid, NDGA),—种从石炭酸灌木中提取的强抗氧化剂，是一种IGF-1R 和 HER2 的双重抑制剂(Youngren et al.Breast Cancer Res Treat.2005 ；94 (I):37-46.)，NDGA能引起MCF_7/neo细胞和高表达HER2的MCF-7/HER2-18细胞的细胞周期停止，生长抑制和凋亡(Zavodovskaya et al.J Cell Biochem.2008 ; 103 (2):624-35.),也能引起对trastuzumab敏感的细胞和耐受trastuzumab的细胞的凋亡，同时使用NDGA和 trastuzumab 恢复耐受 trastuzumab 的细胞对 trastuzumab 的敏感性(Rowe et al.MolCancer Ther.2008 ；7 (7): 1900-8.)。[0006]所以把IGF-1R的单克隆抗体和HER2单克隆抗体Herc印tin结合，进行双抗体结合治疗，可以有效降低Herceptin耐药性,显著提高Herceptin对乳腺癌的疗效。新近(2012年6月)FDA批准的由罗氏制药公司开发的帕妥珠单抗(Perjeta)与曲妥珠单抗合用用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌，就是一个双抗体结合治疗成功的例子。但是双抗体结合治疗将会价格昂贵，也受限于两种抗体的供应和更为复杂、漫长和和代价大的审批过程，难以在临床上普及应用。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是:克服现有技术的不足，提供一种抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体，并提供其制备方法，以用于制备治疗人类癌症特别是人类治疗乳腺癌的药品。抗HER2和IGF-1R的双特异性抗体国内外未见报道。
[0008]本发明的技术方案是:本发明的抗HER2和IGF-1R的双特异性抗体，包含特异性结合HER2的第一抗原结合域和特异性结合IGF-1R的第二抗原结合域，其结构特点是:
[0009]上述第一抗原结合域和第二抗原结合域都由一对抗体重链可变结构域VH和抗体轻链可变结构域VL组成；
[0010]上述的第一抗原结合域为可与HER2特异性结合的抗体可变区结构域；第二抗原结合域为可与IGF-1R特异性结合的抗体可变区结构域。
[0011]进一步的方案是:上述的第一抗原结合域为序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的任一序列。
[0012]进一步的方案是:上述的第二抗原结合域为序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 以及 SEQ ID NO:10 中的任一序列。
[0013]进一步的方案是:上述的第一抗原结合域的序列为已经公开的其它任何可与HER2特异性结合的抗体的可变区结构域的序列，如CN200680029687.5中列出的序列；第二抗原结合域的序列为已经公开的其它任何可与IGF-1R特异性结合的抗体的可变区结构域的序列。
[0014]进一步的方案是:上述的第一抗原结合域和第二抗原结合域为通过将鼠来源的抗体人源化获得或完全人源获得。
[0015]进一步的方案还有:上述的抗体是二价的或多价的。
[0016]一种上述的抗HER2和IGF-1R的双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤:
[0017]①合成编码上述抗体的cDNA序列；
[0018]②将cDNA序列插入工具载体，构建可在宿主细胞中表达的表达载体；
[0019]③将上述的表达载体在宿主细胞中表达；
[0020]④分离纯化表达的双特异性抗体。
[0021]进一步的方案是:上述的步骤②中的工具载体为市售商业化载体或自行构建的可供表达的载体。
[0022]进一步的方案是:上述的步骤②和步骤③中的宿主细胞为如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞的常见表达宿主。
[0023]一种上述的抗HER2和IGF-1R的双特异性抗体，用于制备治疗人类癌症尤其是人类乳腺癌的药品。
[0024]本发明的积极效果:本发明与单一的抗HER2抗体或者抗IGF-1R抗体相比有以下优点:本发明将特异性识别HER2和IGF-1R的抗体可变区域构建在同一抗体分子中，使其具有能同时特异性结合两个抗原的特性，该双特异性抗体能同时阻断这两种抗原介导的细胞信号传递，抑制依赖HER2的肿瘤细胞生长，使肿瘤消退，同时消除IGF-1引发的耐药性，有效降低乳腺癌的侵袭性和全身扩 散；本发明的抗HER2和IGF-1R的双特异性抗体，可用于制备治疗人类癌症特别是治疗人类乳腺癌的药品。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1-1至图1-8为本发明的scFv结构类型的特异性识别HER2和IGF-1R的双特异性抗体的结构示意图，图中抗原I为HER2，相应地抗原2则为IGF-1R，其中:
[0026]图1-1:连接方式:VL1-接头-VHl-接头-VL2-接头-VH2 ；
[0027]图1-2:连接方式:VH1-接头-VLl-接头-VH2-接头-VL2 ；
[0028]图1-3:连接方式:VL2_接头-VH2-接头-VL1-接头-VHl ；
[0029]图1-4:连接方式:VH2_接头-VL2-接头VHl-接头-VLl ；
[0030]图1-5:连接方式:VL1-接头-VH2-接头-VL2-接头-VHl ；
[0031 ] 图1-6:连接方式:VH1-接头-VL2-接头-VH2-接头-VLl ；
[0032]图1-7:连接方式:VL2_接头-VHl-接头-VL1-接头-VH2 ；
[0033]图1-8:连接方式:VH2_接头-VL1-接头-VHl-接头-VL2 ；
[0034]图2-1至图2-4为本发明的scFab结构类型的特异性识别HER2和IGF-1R的双特异性抗体的结构示意图，图中抗原I为HER2，相应地抗原2则为IGF-1R，其中:
[0035]图2-1: [VL-CL-接头-VH-CH1]抗原 1-接头-[VL-CL-接头-VH-CH1]抗原 2 ；
[0036]图2-2: [VH-CHl-接头-VL-CL]抗原 1-接头-[VH-CH1-接头-VL-CL]抗原 2 ；
[0037]图2-3: [VL-CL-接头-VH-CH1]抗原 2_ 接头-[VL-CL-接头-VH-CH1]抗原 I ;
[0038]图2-4: [VH-CHl-接头-VL-CL]抗原 2_ 接头-[VH-CH1-接头-VL-CL]抗原 I ;
[0039]图3-1至图3-4为本发明的具全长抗体并含有额外的scFv的四价的特异性识别HER2和IGF-1R的双特异性抗体 的结构示意图，图中抗原I为HER2，相应地抗原2则为IGF-1R，其中:[0040]图3-1:结合IGF-1R的scFv连接到全长抗HER2抗体的轻链C端；
[0041]图3-2:结合IGF-1R的scFv连接到全长抗HER2抗体的Fe的C端；
[0042]图3-3:结合HER2的scFv连接到全长抗IGF-1R抗体的轻链的C端；
[0043]图3-4:结合HER2的scFv连接到全长抗IGF-1R抗体的Fe的C端；
[0044]图4-1至图4-4为本发明的具全长抗体并含有额外的scFab的四价的特异性识别HER2和IGF-1R的双特异性抗体的结构示意图，图中抗原I为HER2，相应地抗原2则为IGF-1R，其中:
[0045]图4-1:结合IGF-1R的scFab连接到全长抗HER2抗体的轻链的C端；
[0046]图4-2:结合IGF-1R的scFab连接到全长抗HER2抗体的Fe的C端；
[0047]图4-3:结合HER2的scFab连接到全长抗IGF-1R抗体的轻链的C端；
[0048]图4-4:结合HER2的scFab连接到全长抗IGF-1R抗体的Fe的C端。
[0049]氨基酸序列描述
[0050]SEQ ID NO:1针对HER2的抗体结合可变区域I
[0051]SEQ ID NO:2针对HER2的抗体结合可变区域2
[0052]SEQ ID NO:3针对IGF-1R的抗体结合可变区域I
[0053]SEQ ID NO:4针对IGF-1R的抗体结合可变区域2
[0054]SEQ ID NO:5针对IGF-1R的抗体结合可变区域3
[0055]SEQ ID NO:6针对IGF-1R的抗体结合可变区域4
[0056]SEQ ID NO:7针对IGF-1R的抗体结合可变区域5
[0057]SEQ ID NO:8针对IGF-1R的抗体结合可变区域6
[0058]SEQ ID NO:9针对IGF-1R的抗体结合可变区域7
[0059]SEQ ID NO:10针对IGF-1R的抗体结合可变区域8
[0060]SEQ ID NO:11针对IGF-1R的抗体结合可变区域9
[0061]SEQ ID NO:12针对IGF-1R的抗体结合可变区域10。
【具体实施方式】
[0062]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的描述。
[0063](实施例1)
[0064]见图1-1至图4-4，本实施例的抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体，至少包含结合人HER2的第一抗原结合域和结合人IGF-1R的第二抗原结合域，前述每个抗原结合域又包含一对功能性的抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。
[0065]前述针对人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体分子组成包含但不限于结合HER2的第一抗原结合域和结合IGF-1R的第二抗原结合域，还包括有助于前述双特异性抗体维持空间结构以实现正常功能或增强抗体功能的其它肽段或分子。
[0066]术语“价”指结合位点在抗体分子上存在的具体数量。比如:术语“二价”，“四价”，和“六价”指在抗体分子上分别存在两个结合位点，四个结合位点，六个结合位点。根据本实施例的双特异性抗体至少是“二价”的，并且可以是“多价”的(例如“三价”，“四价”等)。优选地，本实施例的双特异性抗体是二价的，四价的。对于具有超过两个抗原结合域的抗体，有些结合域可以是相同的，只要前述抗体至少具有对于两种抗原J1ER2和IGF-IR的两个 特异性结合域。
[0067]优选地，本实施例的双价的双特异性抗体结构类型包括scFv型和scFab型。scFv 是由抗体重链可变结构域（VH)和抗体轻链可变结构域（VL)和肽段接头组成的多肽。具体 的，前述scFv型双特异性抗体（如附图1所示）具有从N端到C端方向的下列顺序之一：
[0068](1) VLHEE2-接头 ~VHER2_ 接头 VL
IGF-IE_
接头-VH
IGF-IR，
[0069](2) VHHEE2-接头接头 VHIGF—IR_ 接头-VL
IGF-IR，
[0070](3) VLigf_ie-接头-VHicf_ik-接头-VLhek_2_ 接头 _VHhek_2,
[0071 ]⑷ VHigf_ir_ 接头 _vligf_ir-接头 VHher_2_ 接头 _VLhf_2,
[0072](5) VLhek_2_ 接头-VHkf_ik_ 接头-VLrcF_IK_ 接头 _VHhek_2，
[0073](6)VHhek_2-接头-VL
IGF-IR-
接头_VH
IGF-IR- 接头-VL
HER-2，
[0074](7) VLigf_ie-接头-VHhek_2_ 接头-VLhek_2_ 接头 _VHrcF_IK，或
[0075]⑶VHkf_ik_ 接头-VLhek_2_ 接头-VHhek_2_ 接头 _VLrcF_IK。
[0076]scFab是由抗体重链可变结构域（VH),抗体重链恒定结构域1 (CH1),抗体轻链可 变结构域（VL)和抗体轻链恒定区（CL)和肽段接头组成的多肽，前述scFab型双特异性抗 体（如附图2所示）具有从N端到C端方向的下列顺序之一：
[0077](1) [VL-CL-接头-VH-CH1]臓-接头-[VL-CL-接头-VH-CH1] IGF_IK，
[0078](2) [VH-CH1-接头-VL-CL]麗_2_ 接头-[VH-CH1-接头-VL-CL] IGF_IK，
[0079](3) [VL-CL-接头-VH-CH1] IGF_IK_ 接头-[VL-CL-接头-VH_CH1]hek_2，或
[0080](4) [VH-CH1-接头-VL_CL]igf_ik-接头-[VH-CH1-接头-VL-CL]臓_2，
[0081]本实施例的采用scFv结构的双特异性抗体中，第一和第二抗原结合域之间以及 每个抗原结合域内部的VH和VL之间的肽段接头为（Gly4Ser) n，n应满足最大程度保证抗体 分子的正确装配以实现结合抗原的功能，优选地，n在1-6之间。本实施例的采用scFab结 构的双特异性抗体中，第一和第二抗原结合域之间以及每个抗原结合域内部的重链和轻链 之间均由肽段接头（Gly4Ser)n* (Gly4Ser)nGm连接，n和m应满足最大程度保证抗体分子 的正确装配以实现抗原结合的功能，优选地，n在1-6之间，m在1-4之间。
[0082]优选地，本实施例的四价的双特异性抗体结构包括在抗HER2全长抗体的两个轻 链C端各自连接一个抗IGF-IR的scFv或scFab结构域（如附图3_1、附图4_1所示），或 者在抗IGF-IR全长抗体的两个轻链C端各自连接一个抗HER2的scFv或者scFab结构域 (如附图3-3、附图4-3所示）；还包括在抗HER2全长抗体Fc部分的两个C末端各自连接 一个抗IGF-IR的scFv或scFab结构域（如附图3_2、附图4_2所示），或者在抗IGF-IR全 长抗体Fc部分的两个C末端各自连接一个抗HER2的scFv或scFab结构域（如附图3_4、 附图4-4所示）。因此前述的四价的双特异性抗体均包含两个HER2特异性结合域和两个 IGF-IR特异性结合域。
[0083]本实施例的四价的双特异性抗体结构中，全长抗体和Fab之间以及Fab内部重链 和轻链之间也采用肽段接头（Gly4Ser)n* (Gly4Ser)nGm连接，n和m应满足最大程度保证 抗体分子的正确装配以实现抗原结合的功能，优选地，n在1-6之间，m在1-4之间。
[0084]本实施例的四价的双特异性抗体，因具有人类来源的IgG，优选地IgGl亚类的恒 定区域，因而除可封闭HER2和IGF-IR介导的信号传递之外，还可激发抗体依赖性的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。
[0085]本实施例的各种结构类型的抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体的设计与制备如下述。
[0086]1、scFv结构类型的识别HER2和IGF-1R的双特异性抗体如(VLhek2-L inker 1-VHkf-1E-Linker2-VLIGF_IE-linker3-VHHEE2)的设计与制备:
[0087]①抗HER2和IGF-1R的双特异性抗体的核酸序列设计与合成:
[0088]获得分别特异性结合HER2和IGF-1R的抗体的氨基酸序列，截取VL和VH序列，按照 VLHEK2-Linkerl-VHICF_IK-Linker2-VLreF_IK-linker3-VHHEK2[如图 1-5,按 N 端至 C 端方向排列，其中Iinkerl和linker3序列都为(Gly4Ser)1, linker2序列为(Gly4Ser)3]方式连接，为便于纯化在N端引入6XHis标签，并在6XHis标签和抗体分子之间插入肠激酶切割位点(DDDDK)，得到分子A。然后将分子A融合到人IgGl信号肽C端，得到分子B，再在分子B编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点EcoR I和Xba I，得到分子C，将分子C的序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列，并合成。
[0089]②表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选:
[0090]将测序正确的序列通过双酶切EcoR I和Xba I双酶切连接到pCIneo载体中，经 DNA测序分析,与设计完全一致。然后按照Invitrogen操作手册的方法转染CH0-DG44贴壁细胞。添加G418加压，并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过Western方法筛选到产量较高的细胞，产量> 5mg/L。
[0091]③双特异性抗体的分离与纯化:
[0092]收集培养液上清，按顺序用两次N1-NTA亲和层析和一次DEAE-S印harose FF (GE产品)离子交换层析进行分离。具体的说，将培养基上清800g离心lOmin，留上清。然后上样到用溶液I (20mM磷酸盐缓冲液+200mM NaCl，pH8.0)预平衡的N1-NTA亲和层析柱，以溶液I洗涤5-10个柱体积，然后以溶液II (20mM磷酸盐缓冲液+200mM NaCl+200mM咪唑，pH8.0)梯度洗脱，收集洗脱峰。按肠激酶说明书方法将洗脱液采用肠激酶酶切以去除组氨酸标签，切割后样品以溶液I稀释10倍后上N1-NTA层析柱，肠激酶因和未被切割的抗体分子结合到层析柱上，而被切除组氨酸标签的抗体分子直接流穿。然后收集流穿部分，将其以上样至溶液III (50mM磷酸盐缓冲液，pH 8.0)预处理过的DEAE-S印harose FF层析柱，再用溶液IV (500mM NaCl+50mM磷酸盐缓冲液，pH 8.0)梯度洗脱，收集目的流出峰。BCA方法进行定量。SDS-PAGE检测纯度> 95%。
[0093]2、scFab结构类型的识别人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体如(LHEK2_L inker 1-HHEE2-Linker2-LIGF_IE-linker3-HIGF_IE)的设计与制备:
[0094]①获得分别特异性结合HER2和IGF-1R的抗体的氨基酸序列，截取Fab区序列，按照 LHEK2_Linker 1-HHEK2-Linker2-LIGF_IK-1 inker3-HIGF_IK [按 N 端至 C 端方向排列，其中 I inker I和linker3序列都为(Gly4Ser)6GG, linker2序列为(Gly4Ser)1]方式连接,为便于纯化在N端引入6XHis标签，并在组氨酸标签和抗体分子之间插入肠激酶切割位点(DDDDK)，得到分子D。然后将分子D融合到人IgGl信号肽C端，得到分子E，再在分子E编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点EcoR I和Xba I，得到分子F，将分子F的序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列，并合成。
[0095]②表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选:[0096]将测序正确的序列通过双酶切EcoR I和Xba I双酶切连接到pCIneo载体中，经DNA测序分析,与设计完全一致。然后按照Invitrogen操作手册的方法转染CH0-DG44贴壁细胞。添加G418加压，并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过Western方法筛选到产量较高的株细胞，产量> 3mg/L。
[0097]③双特异性抗体的分离与纯化:
[0098]收集培养液上清，按顺序用两次N1-NTA亲和层析和一次DEAE-S印harose FF (GE产品)离子交换层析进行分离。具体的说，将培养基上清800g离心lOmin，留上清。然后上样到用溶液A(20mM Tris-Cl+200mM NaCl，pH 8.5)预平衡的N1-NTA亲和层析柱，以溶液A洗涤5-10个柱体积，然后以溶液B (20mM Tris-Cl+200mM NaCl+200mM咪唑，pH 8.5)洗脱，收集洗脱峰。按肠激酶说明书方法将洗脱液采用肠激酶酶切以去除组氨酸标签，切割后样品以溶液A稀释20倍后上N1-NTA，肠激酶因和未被切割的抗体分子结合到层析柱上，而被切割的抗体分子直接流穿。然后收集流穿部分，将其以上样至溶液C(50mM Tr1-Cl,pH8.5)预处理过的DEAE-S印harose FF层析柱，以溶液C洗涤5_10个柱体积，再用溶液D (600mMNaCl+50mM Tris_Cl，pH 8.5)梯度洗脱，收集目的流出峰。BCA方法进行定量。SDS-PAGE检测纯度> 95%。
[0099]3、四价结构类型的识别IGF-1R的全长抗体重链C端连接识别HER2的scFv的双特异性抗体:
[0100]①获得分别特异性结合HER2和IGF-1R的抗体的氨基酸序列，设计结合HER2的单价scFv分子VLhek2-Linker 1-VHhek2 [按N端至C端方向排列，其中I inker I序列为(Gly4Ser) 3]，将其N端通过(Gly4Ser) 3连接到IGF-1R全长抗体的重链的C端，然后将其融合到人IgGl信号肽C端，再在所得融合蛋白编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点EcoRI和Xba I，将所设计分子的序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列，并合成。
[0101]另将IGF-1R抗体轻链部分融合到人IgGl信号肽3’端，再在5’和3’端分别引入酶切位点EcoR I和Xba I，将设计的分子的编码序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列，并合成。
[0102]②表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选:
[0103]将测序正确的两段序列通过双酶切EcoR I和Xba I双酶切各自连接到pCIneo载体中，经DNA测序分析，与设计完全一致。然后按照Invitrogen操作手册的方法，将两个载体按1:1比例共转染CH0-DG44贴壁细胞。添加G418加压，并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过Western方法筛选到产量较高的株细胞，产量> 5.5mg/L。
[0104]③双特异性抗体的分离与纯化:
[0105]收集培养液上清，按顺序用Protein A亲和层析和S-200 (GE产品)排阻层析进行分离。具体的说，将培养基上清800g离心lOmin，留上清。然后上样到用平衡溶液(20mMTris-Cl+250mM NaCl, pH 8.0)预平衡的Protein A亲和层析柱，以平衡溶液洗漆5-10个柱体积，然后以洗脱液(0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH 2.8)洗脱，将包含蛋白的收集液用IMTris-Cl,pH 8.0中和。用Millipore超滤装置(截留分子量30kD)将其浓缩，并上样到用平衡液(20mM组氨酸，150mM NaCl,pH 6.0)平衡的S-200层析柱。将双特异性抗体部分收集。BCA方法进行定量。SDS-PAGE检测纯度> 95%。[0106]4、四价结构类型的识别IGF-1R的全长抗体重链C端连接识别HER2的scFab的双特异性抗体:
[0107]①获得分别特异性结合HER2和IGF-1R的抗体的氨基酸序列，设计结合HER2的单价scFab分子VLHEK2-CL-Linkerl-VHHEK2-CH1 [按N端至C端方向排列,其中Iinkerl序列为(Gly4Ser)6GG],将其N端通过(Gly4Ser) 3连接到IGF-1R全长抗体的重链的C端，然后将其融合到人IgGl信号肽C端，再在所得融合蛋白编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点EcoR I和Xba I，将所设计分子的序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列，并合成。
[0108]另将IGF-1R抗体轻链部分融合到人IgGl信号肽3’端，再在5’和3’端分别引入酶切位点EcoR I和Xba I，将设计的分子的编码序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列，并合成。
[0109]②表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选:
[0110]将测序正确的两段序列通过双酶切EcoR I和Xba I双酶切各自连接到pCIneo载体中，经DNA测序分析，与设计完全一致。然后按照Invitrogen操作手册的方法，将两个载体按1:1比例共转染CH0-DG44贴壁细胞。添加G418加压，并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过Western方法筛选到产量较高的株细胞，产量> 2.8mg/L。
[0111]③双特异性抗体的分离与纯化:
[0112]收集培养液上清，按顺序用Protein A亲和层析和S-200 (GE产品)排阻层析进行分离。具体的说，将培养基上清800g离心lOmin，留上清。然后上样到用平衡溶液(20mMTris-Cl+250mM NaCl, pH 8.0)预平衡的Protein A亲和层析柱，以平衡溶液洗漆5-10个柱体积，然后以洗脱液(0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH 2.8)洗脱，将包含蛋白的收集液用IMTris-Cl,pH 8.0中和。用Millipore超滤装置(截留分子量30kD)将其浓缩，并上样到用平衡液(20mM组氨酸，150mM NaCl,pH 6.0)平衡的S-200层析柱。将双特异性抗体部分收集。BCA方法进行定量。SDS-PAGE检测纯度> 96%。
[0113]本实施例的识别HER2和IGF-1R双特异性抗体的初步活性检测:
[0114]分别用前述4种方法所获得的4种结构的双特异性抗体与HER2阳性细胞系、IGF-1R阳性细胞系和HER2/IGF-1R双阳性细胞，以及HER2/IGF-1R双阴性细胞系进行相互作用分析，结果表明上述三种HER2/IGF-1R双特异性抗体都能与HER2阳性细胞系，IGF-1R阳性细胞系和HER2/IGF-1R双阳性细胞结合，而不与HER2/IGF-1R双阴性细胞系结合，说明HER2/IGF-1R双特异性抗体具有与HER2和IGF-1R特异性结合的能力。
[0115]本实施例的各种结构类型的抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体通过药学可接受的载体用于人类，合适的药物载体为本领域熟知，包括但不限于生理盐水、磷酸缓冲液、水、脂质体、纳米载体等。含有此类载体的双特异性抗体或抗体组合物通过众所周知的常规方法制备。
[0116]本实施例的各种结构类型的抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体可以通过各种给药途径用于人类，给药途径包括但不限于静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、皮下注射、口月艮、舌下给药、喷雾等。`
[0117]本实施例的各种结构类型的抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体可以应用上述的药物载体，通过上述的给药途径单独使用或者与其它药物合用或者与其它药物偶联后用于人类。所述的药物包括但不限于细胞毒素、放射性同位素、脂质体、抗体等。
[0118]综上，本实施例将特异性识别人HER2和人IGF-1R的抗体可变区域构建在同一抗体分子中，使其具有能同时特异性结合两个抗原的特性，该双特异性抗体能同时阻断这两种抗原介导的细胞信号传递，抑制依赖HER2的肿瘤细胞生长，使肿瘤消退，同时消除IGF-1弓丨发的耐药性，有效降低乳腺癌的侵袭性和全身扩散；本实施例的抗HER2和IGF-1R的双特异性抗体，可用于制备治疗人类癌症特别是治疗人类乳腺癌的药品。
[0119]以上实施例是对本发明的【具体实施方式】的说明，而非对本发明的限制，有关【技术领域】的技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变换和变化而得到相对应的等同的技术方案， 因此所有等同的技术方案均应该归入本发明的专利保护范围。
【权利要求】
1.一种抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体，包含特异性结合HER2的第一抗原结合域和特异性结合IGF-1R的第二抗原结合域，其特征在于: 所述第一抗原结合域和第二抗原结合域都由一对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)组成； 所述的第一抗原结合域为可与HER2特异性结合的抗体可变区结构域；第二抗原结合域为可与IGF-1R特异性结合的抗体可变区结构域。
2.根据权利要求1所述的抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体，其特征在于:所述的第一抗原结合域为序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的任一序列。
3.根据权利要求1所述的抗HER2和IGF-1R的双特异性抗体，其特征在于:所述的第二抗原结合域为序列 SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 以及 SEQ ID NO:10 中的任一序列。
4.根据权利要求1所述的抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体，其特征在于:所述的第一抗原结合域的序列为已经公开的其它任何可与HER2特异性结合的抗体的可变区结构域的序列；所述的第二抗原结合域的序列为已经公开的其它任何可与IGF-1R特异性结合的抗体的可变区结构域的序列。
5.权利要求1所述的抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体，其特征在于:所述的第一抗原结合域和第二抗原结合域为通过将鼠来源的抗体人源化获得或完全人源获得。
6.根据权利要求1~5任一项所述的抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体，其特征在于:所述的抗体是二价的或多价的。
7.一种权利要求1~5任一项所述的抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤: ①合成编码所述抗体的cDNA序列； ②将cDNA序列插入工具载体，构建可在宿主细胞中表达的表达载体； ③将所述的表达载体在宿主细胞中表达； ④分离纯化表达的双特异性抗体。
8.根据权利要求7所述的抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体的制备方法，其特征在于:所述的步骤②中的工具载体为市售商业化载体或自行构建的可供表达的载体。
9.根据权利要求7所述的抗人HER2和人IGF-1R的双特异性抗体的制备方法，其特征在于:所述的步骤②和步骤③中的宿主细胞为如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞的常见表达宿主。
10.一种权利要求1~5任一项所述的抗人HER2和人IGF-1的双特异性抗体，其特征在于:用于制备治疗人类癌症尤其是人类乳腺癌的药品。
【文档编号】C12N15/63GK103509117SQ201310160996
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年5月6日 优先权日:2013年5月6日
【发明者】包建新, 楼亚平, 邓洪渊, 姜有为 申请人:江苏匡亚生物医药科技有限公司