一种来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用。所述山梨醇脱氢酶基因采用人工方法合成，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO?1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ?ID?NO2所示。将该山梨醇脱氢酶基因采用农杆菌蘸花法转化拟南芥，结果发现该基因能成功的提高转基因拟南芥的耐盐功能，因此该基因能够广泛应用于植物耐受高盐胁迫中。
【专利说明】—种来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属植物基因工程领域，具体涉及一种来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用，特别是涉及所述基因在植物耐盐胁迫中的应用。
【背景技术】
[0002]山梨醇是一种糖醇，广泛分布于一些蔷薇科木本植物中。它是这些蔷薇科木本植物主要的光合产物、运输糖和贮藏物质，起着其它植物中蔗糖的作用。山梨醇还是一种小分子渗透物质，可以改变细胞渗透势，从而可以提高植物抗寒、抗旱、抗盐、抗硼亏缺等方面的能力。
[0003]山梨醇脱氧酶(sorbitoldehydrogenase,SDH)和山梨醇氧化酶(sorbitoloxidase, SOX)是参与山梨醇代谢的关键酶，其中SDH催化山梨醇转化成果糖与葡萄糖，SOX催化山梨醇氧化成葡萄糖。
[0004]在拟南芥中，韧皮部传送的主要碳水化合物是蔗糖以及少量的棉子糖，山梨醇在正常生长条件下并不会参与到拟南芥韧皮部糖类运输中。最近的研究表明，拟南芥SDH突变体经过干旱胁迫后，山梨醇含量有轻微的提升并且SDH的活性则会下降。鉴于山梨醇在植物抗逆胁迫中的重要作用，我们认为山梨醇脱氢酶可能能够对植物耐胁迫应用产生有利效果。
[0005]死海的含盐量极高，且越到湖底越甚。由于含盐量极高，水中只有细菌，没有其它动植物存在，人们称之为死海。嗜盐杆菌(Halobacterium)是生活在死海中的细菌之一，具有极强的耐盐能力。
【发明内容】
[0006]在本发明中，我们改造了一种来源于死海盐杆菌(Haloarcula marismortui)的山梨醇脱氢酶HmSDHI，并且利用基因攻城技术成功的将此基因转入到拟南芥中，并且经过一系列测试，为植物的耐盐胁迫提供一种解决的方案。
[0007]因此，本发明所要解决的技术问题之一，在于提供一种来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因。
[0008]本发明所要解决的技术问题之二，在于提供所述的来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因在植物耐盐胁迫中的应用，即将该来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因转入植物体内，并对该转基因植物进行功能验证，以证明它具有提高植物耐盐性的的功能。
[0009]为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。
[0010]所述的来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。该山梨醇脱氢酶基因长1170bp，含1170个碱基，编码氨基酸387个。
[0011] 所述的来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因，采用人工方法合成。即依照PTDS(PCR-based two-step DNA synthesis,PTDS)方法克隆源自死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因(SDH)，进行化学合成，在保持SDH基因的氨基酸序列不变的基础上，设计引物合成本发明的山梨醇脱氢酶基因(HmSDH I)。
[0012]通过农杆菌介导将本发明的山梨醇脱氢酶HmSDHI转入拟南芥，可应用于植物耐盐胁迫。具体包括如下步骤:
[0013]DHmSDH I农杆菌双元载体的构建
[0014]HmSDHI基因植物的双元载体是在pcAMBIA-1301载体的基础上构建而成的，在外源基因的表达单元内，我们在目的基因的两侧导入了 BamHI和Sacl酶切位点，便于外源基因的插入，外源基因的表达由CAMV35S启动子控制。
[0015]2)电击法转化农杆菌
[0016]参照MicroPulser? Electroporat1n Apparatus Operating Instruct1ns andApplicat1n Guide (B1-RAD公司)制备农杆菌GV3101感受态，并且将构建好的农杆菌双元载体经电击法转入到农杆菌中。
[0017]3)农杆菌介导转化拟南芥
[0018]利用蘸花法将构建好的农杆菌转入拟南芥体内。首先将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约3~5秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22°C培养室，低光强度下生长24小时，即可正常培养。生长约两个月后，收集种子，4°C冰箱贮存待用。
[0019]4)拟南芥转化植株种子的筛选
[0020] 对上述得到的种子进行筛选，包括GUS组织化学染色分析和转基因阳性植株的PCR检测，即得到转入HmSDHI基因的拟南芥。
[0021]5)转基因拟南芥耐盐胁迫
[0022]将得到的转HmSDHI基因的拟南芥与野生型拟南芥共同栽培到含有高浓度NaCl的水溶液中，经过一周生长，观察拟南芥的生长状态，并且测定相关抗盐的生理表型。测定表明=RHmSDHI的拟南芥比野生型更加耐受NaCl，并且相关生理指标(组织含水量，可溶性糖含量，MDA含量)的测定也证明转HmSDHI的拟南芥比野生型对NaCl的耐受性更好。
[0023]由此说明:本发明的源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因(HmSDHI)成功的使转基因拟南芥提闻了耐盐的能力，这使得此基因用于提闻植物耐盐性成为了可能。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为转HmSDHI基因拟南芥的DNA检测电泳图，其中6为marker，1-5为转HmSDHI
基因的拟南芥。
[0025]图2为获得的转HmSDHI基因拟南芥的GUS染色图，其中的2个试管均为染色阳性的转基因拟南芥。
[0026]图3为转HmSDHI基因拟南芥与野生型在NaCl处理后的表型图，其中WT代表野生型，HmSDHI代表为转基因植株。
[0027]图4为转HmSDHI基因拟南芥与野生型在NaCl处理后的丙二醛含量的指标示意图，其中CK是野生型，SDH-1、SDH-8、SNH-9分别代表转基因拟南芥的三个株系。
[0028]图5为转HmSDHI基因拟南芥与野生型在NaCl处理后的水含量的指标示意图，其中CK是野生型，SDH-1、SDH-8、SNH-9分别代表转基因拟南芥的三个株系。
[0029]图6为转HmSDHI基因拟南芥与野生型在NaCl处理后的可溶性糖含量的指标示意图，其中CK是野生型，SDH-1、SDH-8、SNH-9分别代表转基因拟南芥的三个株系。
【具体实施方式】
[0030]以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
[0031]本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛一奥德里奇(Sigma — Aldrich)公司。
[0032]本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社)。
[0033]实施例1山梨醇脱氢酶基因HmSDHI的人工合成
[0034]依照PTDS (PCR-based two-step DNA synthesis, PTDS)方法克隆源自死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因，进行化学合成，在保持山梨醇脱氢酶基因的氨基酸序列不变的基础上，设计引物合成本发明的山梨醇脱氢酶基因(HmSDHI)。设计的引物如下:
[0035]1.HMSDH1-1: Tm=54, 60mer
[0036]GGA, TCC, ATG, AGA, CCA, TCT, GCT, TCT, GTT, GGT, CAG, AGA, CCA, GAA, GAG, AGA, CTC, AAT, CCA, CAG
[0037]2.HMSDH1-2: Tm=54, 60mer
[0038]TGA, CAC, CAA, TGA, CTT, TCA, TGC, CTG, GAA, GAG, AGT, GAG, AGC, ACT, GTG, GAT, TGA, GTC, TCT, CTT
[0039]3.HMSDH1-3: Tm=54, 60mer
[0040]CAT, GAA, AGT, CAT, TGG, TGT, CAC, CAG, AGA, TGA, TGA, TGG, TCC, ACA, ACT, CTT, GGA, GAG, AGA, GAG
[0041 ] 4.HMSDH1-4: Tm=54, 60mer
[0042]GAG, GGT, TCT, GAC, AAG, GGC, TTC, ACC, TGG, ATC, TGG, AGA, TGG, TCT, CTC, TCT, CTC, CAA, GAG, TTG
[0043]5.HMSDH1-5: Tm=54, 60mer
[0044]AAG, CCC, TTG, TCA, GAA, CCC, TCA, GAG, TTG, GTG, TTG, ATG, GCA, CTG, ACC, ATG, AGG, TCC, TGA, ATG
[0045]6.HMSDH1-6: Tm=54, 60mer
[0046]ATC, ATG, TGA, TCA, GCA, CCA, TCT, GGA, AAG, CCA, CCA, TGA, GAA, CCA, TTC, AGG, ACC, TCA, TGG, TCA
[0047]7.HMSDH1-7: Tm=54, 60mer
[0048]GAT, GGT, GCT, GAT, CAC, ATG, ATC, CTT, GGT, CAT, GAA, GCT, GTT, GGT, GTC, GTC, GAG, GAG, CCT, AAC
[0049]8.HMSDH1-8: Tm=54, 60mer
[0050]CAG, TTG, GAG, CAA, CGA, CTT, GAC, CAG, CTT, CAA, GAC, CAG, TAC, CGT, TAG, GCT, CCT, CI I 1117 1---7--117 Il--7--117--117----17 1---7 1117 Il--7---17 1117----17---17 1---7 1117---17--
AG, CCA, TGA
1--1005S 13.HMSDH1-13: Tm=54, 60mer
1--10060U IPOMP β OCA, AAG, TCT, GTC, GCT, GAG, TAT, GGC, TTC, CTC, GTT, GAA, OCA, CTC, Tco
〔0061U 14.HMSDH1-14: Tm=54, 60mer
1--10062U 3P目PH>pooj ?0.0>5 OGT, TAG, CCT, TCT, CAG, TGA, TGG, AGA, GTG, GTT, OAA, CGA, 00>
1--10063I——Isg§HH-15: Tm=54, 60mer
1--10064U >o>Sp 1>000.J>pOAG, AGA, GCC, ATT, CGA, CTG, GAG, ACC, AGA, CTC, TGC, TTG, TGT, TCT, TGG
1--10065I——Is.sgoH1-16" H 曰 Nal^60mer 〔0066〕 ATC, AAG, CAT, CCA, CAG, AGT, CAG, CAG, ACC, AAG, AGA, ACC, ATT, GCC, AAG, AAC, ACA, AGp AGA, GTC
1--10067I——Isg§HH-17: Tm=54, 60mer
〔0068〕 TGA, CTC, TGT, GGA, TGC, TTG, ATC, AAG, AGT, ACG, ACA, GAA, CCT, ACT, GTG, TTG, GTA, GAA, GAG, ACA
〔00691——1s.1svs" J3N54、60mer
1--10070U 0>p OOP >,pp ,POA, TCG, ATG, ATG, TCA, ACA, GTT, GGA, TCT, GGT, CTG, TCT, CTT, CTA, OCA, ACA, CAG
〔0071U s.1svs" J3N54、60mer
〔0072〕 ATC, ATC, GAT, GAG, ATC, GGC, TCT, ACC, TAT, GTT, GAT, TCC, AGA, GAG, ACT, CCA, GTT, GAT, GAA, CTT
1--10073I——Ig.sg§JI20: Tm=54, 60mer
〔0074〕 TAG, CTT, CAT, AGA, TGT, AGT, CCA, TAG, CTT, CAT, AGG, CAC, CTG, GAA, GTT, CAT, CAA, OTG, GAG, TCT
1--10075I——I2rHMSDH1-21:Tm=54, 60mer
〔0076〕 GGA, CTA, CAT, CTA, TGA, AGC, TAC, TGG, CTT, TGC, TCC, ACA, TGC, CTT, CCA, GAP TGT, C
6AA, AGC, TCT
[0077]22.HMSDH1-22: Tm=54, 60mer
[0078]TTC, TGG, AAT, GCC, AAG, CAA, GAC, ACC, AAC, ACC, GTT, CTG, ATC, AAG, AGC, TTT, GAC, AGT, CTG, GAA
[0079]23.HMSDH1-23: Tm=54, 60mer
[0080]TCT, TGC, TTG, GCA, TTC, CAG, AAC, CTT, GGG, AGT, TCG, AAG, TTG, ATG, GTG, GCT, CTC, TCC, ACA, ACG
[0081 ] 24.HMSDH1-24: Tm=54, 60mer
[0082]TTG, ACA, GTG, CCA, ATG, AGA, CAC, TTG, TTG, TGC, AGG, ACG, ATT, TCG, TTG, TGG, AGA, GAG, CCA, CCA
[0083]25.HMSDH1-25: Tm=54, 60mer
[0084]TGT, CTC, ATT, GGC, ACT, GTC, AAC, TCT, CAC, GTC, TCT, CAC, TTC, GAA, GAT, GCT, GTT, GAG, ACC, TTG
[0085]26.HMSDH1-26: Tm=54, 60mer
[0086]TAG, TGA, CCA, AGT, CAT, CAA, GAA, GCC, AAG, CTG, GCA, GTT, CTT, GCA, AGG, TCT, CAA, CAG, CAT, CTT
[0087]27.HMSDH1-27: Tm=54, 60mer
[0088]TCT, TGA, TGA, CTT, GGT, CAC, TAC, TGT, CAC, TGA, TCC, TGA, ACA, CGT, CGA, AGC, TGC, TTT, CGA, AGA
[0089]28.HMSDH1-28:Tm=54, 60mer
[0090]AGA, GTC, GAA, CTC, GAC, GAC, AGC, TTT, GAT, CTG, ATC, GTC, ACC, ATC, TTC, GAA, AGC, AGC, TTC, GAC
[0091 ] 29.HMSDH1-29: Tm=54, 50mer
[0092] GAG, CTC, TTA, ATG, GTG, ATG, GTG, ATG, GTG, CAG, AGA, GTC, GAA, CTC, GAC, GAC, AG
[0093]利用PCR进行HmSDHI基因扩增，在100 μ I反应体系中，Hmsdhi_2至Hmsdhi_28共27个引物的添加量为2ng，外侧引物Hmsdh1-1和Hmsdh1-29添加量为30ng，扩增条件为:94°C预热 Imin ;94°C 30s，50°C 30s，72°C 2min，使用的 Taq DNA 聚合酶为 KOD FX taq 酶(Toyobo公司，日本),共25个循环。
[0094]PCR结束后，1%琼脂糖胶回收，取10 μ I直接与Τ/Α克隆载体相连(大连宝生物公司)。41:连接过夜，高效转化DH5ci感受态中，获得阳性克隆经过上海桑尼公司测序和分析，所得序列即为本发明的山梨醇脱氢酶基因(HMSDHI)，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。该山梨醇脱氢酶基因长1170bp，含1170个碱基，编码氨基酸387个。
[0095]实施例2 HMSDHI农杆菌双元载体的构建
[0096]将上述人工合成的HMSDHI基因的ORF经PCR扩增后头尾分别加入Bam HI和SacI切点，经Bam HI和Sac I双酶切，回收DNA片段与相应酶切的载体相连，经酶切鉴定和测序后得到正确的双元载体PYM6854。
[0097]实施例3电击法转化农杆菌
[0098]I)制备农杆菌 GV3101 感受态，方法参照 MicroPulser? Electroporat1nApparatus Operating Instruct1ns and Applicat1n Guide (B1-RAD 公司)(Raineriet al., 1990)。
[0099]2)取50 μ L GV3101感受态细胞，加入IyL DNA，转入0.2cm电击杯转化(400 Ω，
2.5KV，25y f)。加入ImL含有1%甘露醇的LB培养基恢复培养2小时(28°C，250rpm)。分别取10 μ L、100 μ L涂LB平板(利福平50 μ g/mL,庆大霉素50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/mL)。
[0100]3)从步骤2中LB板上生长的菌中挑取几个克隆，碱法抽提农杆菌质粒，酶切鉴定，PCR检测。
[0101]实施例4农杆菌介导转化拟南芥
[0102]A拟南芥的培养
[0103]I)拟南芥种子在4°C进行2-3天的春化处理，目的是有利于种子的一致萌发和花期的提前。
[0104]2)将基质蛭石、黑土、珍珠岩按9:3:0.5 (v/v)的比例拌匀，经高温灭菌后装于1cm的塑料小盆，以营养液PNS浸湿待用。
[0105]3)以牙签将拟南芥种子点播于湿润的基质上，保鲜膜封口。放置于22°C暗培养
2- 3天，待种子萌发后，揭开保鲜膜，置于22°C培养室中进行16小时光照培养。
[0106]4)拟南芥抽苔后及抽苔后两周以及转化后需再以PNS营养液浸湿一次。中途可视情况适当浇水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生长，当次生苔长至2 — 1cm(少数已经开花)可用于转化。
[0107]B农杆菌的准备
[0108]I)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/mL)中，28°C，250rpm 培养 20 小时。
[0109]2)取ImL菌液转接入20_30mL LB液体培养基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/mL)中，28°C，250rpm 培养约 12 小时，测 OD6tltl ^ 1.5。
[0110]3) 8000rpm，4°C，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5%蔗糖，
0.05%Silwet L-77)并稀释至 OD600 ~0.8。
[0111]C蘸花法转化拟南芥
[0112]I)将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约3~5秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22°C培养室低光强度下生长24小时，即可正常培养。
[0113]2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以在花发育的不同时期进行转化，提高转化效率。
[0114]3)生长约两个月后，收集种子，4°C冰箱贮存待用。
[0115]实施例5拟南芥转化植株种子的筛选
[0116]I)称25_30mg 种子放入1.5mL离心管。
[0117]2) lmL75%乙醇消毒Imin (不停摇晃振荡)，8000rpm离心5秒，去上清。
[0118]3)加入ImL过滤后的漂白粉消毒15min (不停摇晃振荡,充分消毒),8000rpm离心
5秒,去上清。
[0119]4)无菌水洗涤3 — 4次。
[0120]5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板(Hyg50y g/mL)上，Parafilm膜封口，4°C冰箱放置两天，22°C，16小时光照培养6天。
[0121]6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(Tl)继续培养，并收集种子进行T2代和T3代筛选。
[0122]实施例6转基因阳性植株的检测
[0123]I)⑶S组织化学染色分析
[0124]按Jefferson (1978)的方法，将待测拟南芥叶片样品与X-Gluc染色反应液(50mmol/L NaH2PO4, pH7.0 ；0.5m mol/L K4 [Fe (CN) 6], 0.l%Triton X-100，20% 甲醇，0.5mg/mLX-Gluc [X-glucuronide])于37°C保温2_4小时后，用75%乙醇脱色观察(参看图2)。
[0125]2 )转基因阳性植株的PCR检测
[0126]A拟南芥总DNA的提取
[0127]I)取0.1-0.2g拟南芥叶片液氮研磨，转移至1.5mL离心管中。
[0128]2)加入800 μ L抽提缓冲液，Vortex剧烈振荡，充分裂解细胞，60°C水浴I小时，每隔10分钟颠倒一次。
[0129]3) IlOOOrpm,4°C,20min离心，取上清,加入等体积异丙醇及1/3体积的10mol/LNH4Ac,室温放置15分钟。
[0130]4) IlOOOrpm,4°C,20min离心,弃上清,沉淀以70%乙醇洗漆,稍晾干,加入100 μ L
TE溶解(若不易溶解，可放于65°C助溶，不可用移液器吹吸)。
[0131]5)用酚、氯仿抽提一次，提高纯度，异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤，溶于50 μ L TE中，-20 V保存，用于PCR检测。
[0132]B PCR 扩增
[0133]正向引物:5’ -GCACGCCCATTTCCTCC-3，
[0134]反向引物:5’ -CAGCTTGATCATCTGCGATGAC-3 ’
[0135]PCR反应体系:
[0136]
【权利要求】
1.一种来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。
2.根据权利要求1所述的来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.权利要求1或2所述的来源于死海盐杆菌的山梨醇脱氢酶基因在植物耐盐胁迫中的应用。
【文档编号】C12N9/04GK104178500SQ201310195514
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月23日 优先权日:2013年5月23日
【发明者】高建杰, 姚泉洪, 彭日荷, 付晓燕, 田永生, 赵伟, 韩红娟, 王波, 王丽娟, 韩静 申请人:上海市农业科学院