利用骨骼肌组织块培养获得骨骼肌细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用骨骼肌组织块培养获得骨骼肌细胞的方法，包括采样、剪切、摆布、培养，它的步骤如下：（1）采集骨骼肌组织块，剪切，摆布于培养瓶的瓶底；（2）翻转培养，将培养瓶的瓶底朝上，盖好瓶塞，放入培养箱中，在体积浓度为5%CO2、37℃的条件下培养2～3小时，然后从培养箱中取出培养瓶，开塞，46度左右斜持培养瓶，瓶底向上，向瓶底角部注入培养基，翻转培养瓶，培养基覆盖培养瓶上的骨骼肌组织块，再将培养瓶盖好瓶塞，放入培养箱中，在体积浓度为5%CO2、37℃的条件下静置培养，3～4天换培养基，6～8天长出细胞后，本发明通过培养背最长肌组织块，组织块培养9~10d细胞融合度可达到80%，得到骨骼肌细胞，细胞融合度达80%时，可作为传代之用，以建立稳定的细胞系。
【专利说明】利用骨骼肌组织块培养获得骨骼肌细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种骨骼肌细胞的获得方法，尤其涉及一种以背最长肌组织块培养获得骨骼肌细胞的方法。
【背景技术】
[0002]我国作为猪肉产量和消费大国，消费者对质量的要求也在逐步增加，食用品质是其中的一个重要指标。肌内脂肪与肉感观品质紧密相关，是肉质细嫩多汁和口感好的物质基础，所以建立肌肉组织块培养方法，对研究和调控肌内脂肪的增殖和分化，提高肉的食用品质具有十分重要的意义。
[0003]组织培养常用的容器有凹玻片、培养皿、培养瓶、培养板、流动小室等。其方法是:将剪成的小组织团块接种于培养瓶(或皿)中，部分种类的组织细胞在小块贴壁24h后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5?7d后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，待融合度达80%时，可做传代之用，以建立稳定的细胞系。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于建立以猪背最长肌组织块培养获得骨骼肌细胞的方法，来研究和调控肌内脂肪的增殖和分化。
[0005]本发明的技术方案为:利用骨骼肌组织块培养获得骨骼肌细胞的方法，包括采样、剪切、摆布、培养，它的步骤如下:
(1)采集骨骼肌组织块，剪切，摆布于培养瓶的瓶底；
(2)翻转培养，将培养瓶的瓶底朝上，盖好瓶塞，放入培养箱中，在体积浓度为5%C02、37°C的条件下培养2?3小时，然后从培养箱中取出培养瓶，开塞，46度左右斜持培养瓶，瓶底向上，向瓶底角部注入培养基，所述培养基为含体积浓度为20%胎牛血清的DMEM/F12，翻转培养瓶，培养基覆盖培养瓶上的骨骼肌组织块，再将培养瓶盖好瓶塞，放入培养箱中，在体积浓度为5%C02、37°C的条件下静置培养，3?4天换培养基，6?8天长出细胞后，培养基为含体积浓度为10%FBS的DMEM/F12。
[0006]所述步骤(I)中采集骨骼肌组织块，放入生物安全柜中，冲洗骨骼肌组织块，清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织，切取Icm3的骨骼肌组织块，放入培养皿中。
[0007]所述步骤(I)中剪切步骤为将培养皿中的骨骼肌组织块剪切为1mm3，然后用吸管吸取HBSS液把附着在剪刀上的组织小块冲下，并补加3?5mL HBSS液后，去上清液，得到用于培养的骨骼肌组织块。
[0008]所述步骤(I)中摆布步骤为:用牙科探针将骨骼肌组织块均匀摆布于20?25 cm2的培养瓶的瓶底，每块骨骼肌组织块间距为0.4?0.6 cm。
[0009]本发明的有益效果为:通过培养背最长肌组织块，组织块培养9?10d细胞融合度可达到80%，得到骨骼肌细胞，细胞融合度达80%时，可作为传代之用，以建立稳定的细胞系O
【具体实施方式】
[0010]利用骨骼肌组织块培养获得骨骼肌细胞的方法，包括采样、剪切、摆布、培养，以猪背最长肌组织块为例，它的步骤如下:
(1)采集骨骼肌组织块，放入生物安全柜中，冲洗骨骼肌组织块，清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织，切取Icm3的骨骼肌组织块，放入培养皿中，将培养皿中的骨骼肌组织块剪切为1mm3，然后用吸管吸取HBSS液把附着在剪刀上的组织小块冲下，并补加3?5mLHBSS液后，去上清液，得到用于培养的骨骼肌组织块，然后用牙科探针将骨骼肌组织块均匀摆布于20?25 cm2的培养瓶的瓶底,每块骨骼肌组织块间距为0.4?0.6 cm ；
(2)翻转培养，将培养瓶的瓶底朝上，盖好瓶塞，放入培养箱中，在体积浓度为5%C02、37°C的条件下培养2?3小时，然后从培养箱中取出培养瓶，开塞，46度左右斜持培养瓶，瓶底向上，向瓶底角部注入培养基，所述培养基为含体积浓度为20%胎牛血清的DMEM/F12，翻转培养瓶，培养基覆盖培养瓶上的骨骼肌 组织块，再将培养瓶盖好瓶塞，放入培养箱中，在体积浓度为5%C02、37°C的条件下静置培养，3?4天换培养基，6?8天长出细胞后，培养基为含体积浓度为10%FBS的DMEM/F12 ；
(3 )于倒置显微镜下观察培养瓶内细胞形态和生长情况。
[0011]上述实施例中，DMEM/F12就是细胞培养中常用的商品化的基础培养基。
【权利要求】
1.利用骨骼肌组织块培养获得骨骼肌细胞的方法，包括采样、剪切、摆布、培养，其特征在于:它的步骤如下: (1)采集骨骼肌组织块，剪切，摆布于培养瓶的瓶底； (2)翻转培养，将培养瓶的瓶底朝上，盖好瓶塞，放入培养箱中，在体积浓度为5%C02、37°C的条件下培养2?3小时，然后从培养箱中取出培养瓶，开塞，46度左右斜持培养瓶，瓶底向上，向瓶底角部注入培养基，所述培养基为含体积浓度为20%胎牛血清的DMEM/F12，翻转培养瓶，培养基覆盖培养瓶上的骨骼肌组织块，再将培养瓶盖好瓶塞，放入培养箱中，在体积浓度为5%C02、37°C的条件下静置培养，3?4天换培养基，6?8天长出细胞后，培养基为含体积浓度为10%FBS的DMEM/F12。
2.根据权利要求1所述的以猪背最长肌组织块培养获得骨骼肌细胞的方法，其特征在于:所述步骤(I)中采集骨骼肌组织块，放入生物安全柜中，冲洗骨骼肌组织块，清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织，切取Icm3的骨骼肌组织块，放入培养皿中。
3.根据权利要求1所述的以猪背最长肌组织块培养获得骨骼肌细胞的方法，其特征在于:所述步骤(I)中剪切步骤为将培养皿中的骨骼肌组织块剪切为1mm3，然后用吸管吸取HBSS液把附着在剪刀上的组织小块冲下，并补加3?5mL HBSS液后，去上清液，得到用于培养的骨骼肌组织块。
4.根据权利要求1所述的以猪背最长肌组织块培养获得骨骼肌细胞的方法，其特征在于:所述步骤(I)中摆布步骤为:用牙科探针将骨骼肌组织块均匀摆布于20?25 cm2的培养瓶的瓶底，每块骨骼肌组织块间距为0.4?0.6 cm。
【文档编号】C12N5/071GK103436488SQ201310307976
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月22日 优先权日:2013年7月22日
【发明者】廉红霞, 高腾云, 史莹华, 傅彤, 李改英, 孙宇 申请人:河南农业大学