裂开型核酸适配体探针及其在肿瘤细胞检测、捕获与释放中的应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种裂开型核酸适配体探针及其在肿瘤细胞检测、捕获与释放中的应用方法，该探针包括将完整的核酸适配体序列在适当位点分裂后形成的片段a和片段b，二者与靶肿瘤细胞会发生特异性结合。检测方法包括在片段a和片段b分别连接荧光供体和荧光受体，通过检测供受体对的荧光共振能量转移信号强度来判断肿瘤细胞存在与否。捕获与释放方法包括将插入有连接片段的片段a修饰于捕获容器底部并向捕获容器中加入待捕获样品和片段b，在温度调控下实现对靶肿瘤细胞的捕获与释放。本发明的探针对靶肿瘤细胞具有特异响应性和温度敏感性，对肿瘤细胞的检测、捕获与释放方法简单、快速、灵敏、特异性强，有重要的科学价值和广阔的市场前景。
【专利说明】裂开型核酸适配体探针及其在肿瘤细胞检测、捕获与释放中的应用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于核酸探针【技术领域】，具体涉及一种裂开型核酸适配体探针的设计及其在肿瘤细胞检测、捕获与释放中的应用方法。
【背景技术】[0002]灵敏而特异的分子探针设计与构建一直是肿瘤诊断学面临的重要挑战之一。在过去几十年间，以“抗原-抗体”反应为基础的免疫分型技术对肿瘤诊断及治疗相关研究的发展做出了巨大贡献。然而，传统的抗体制备过程主要依赖于动物或细胞，使其在应用时往往表现出筛选周期长、成本高、存在批间差、保存和反应条件适应性差等不足。近年来，作为新型“化学抗体”出现的核酸适配体(aptamer)探针，由于具有一系列蛋白质抗体所不具备的优越特性，在肿瘤医学研究领域受到了重要关注，为肿瘤诊断分型技术的发展带来了新契机。
[0003]从本质上来说，核酸适配体是指从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲和性和高特异性地与靶标分子结合的单链寡核苷酸，通过指数富集配体的系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)技术筛选而获得(Tuerk C, Gold L.Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNAligands to bacteriophage T4DNA polymerase.Sciencel990，249，505-510.EllingtonADj Szostak JW.1n vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.Naturel990，346，818-822.)。它不仅具有类似抗体对靶标的高亲和力和高特异性结合性能，更在许多方面优于抗体，如:靶标种类丰富、合成方法简单且重复性好、修饰灵活以及便于长期贮存和常温运输等。尤其是近几年以全细胞为靶标并引入对相近细胞系反筛过程的cell-SELEX技术的出现，由于其具有富集快速、操作简便、无需了解复杂靶标的详细信息并可同时筛选一组探针等一系列优点，使得aptamer作为分子识别探针在区分不同肿瘤细胞类型甚至亚型方面的能力得到了极大增强(Shangguan D, Li Y，Tang Z, etal.Aptamers evolved from live cells as effective molecular probes for cancerstudy.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica2006，103，11838-11843.)。目前，基于cell-SELEX技术已有包括血液瘤和实体瘤在内的多种肿瘤细胞特异性aptamer被筛选出来，并被广泛应用于肿瘤分型、诊断和治疗石开究中(Fang X，Tan W.Aptamers generated from cell-SELEX for molecular medicine:achemical biology approach.Accounts of Chemical Research2010，43，48-57.)。
[0004]但是，现有基于aptamer的肿瘤诊断研究大多釆用“always on”信号模式，即利用具有信号发射特性的分子或纳米材料标记肿瘤特异性aptamer构建肿瘤检测探针，通过探针对祀标和非祀标的亲和力差异实现肿瘤诊断(Hicke BJj Stephens AWj Gould T, etal.Tumor targeting by an aptamer.Journal of Nuclear Medicine2006，47，668-678.Hwang DWj Ko HY，Lee JHj et al.A nucIeoI in-targeted multimodal nanoparticleimaging probe for tracking cancer cells using an aptamer.Journal of NuclearMedicine2010，51，98-105.Shi H，Tang Z，Kim Y，et al.1n vivo fluorescence imagingof tumors using molecular aptamers generated by cell-SELEX.Chemistry-An AsianJournal2010，5，2209-2213.)。由于这类探针的信号始终存在，在体外应用中，需要借助繁琐的洗涤步骤以除去多余探针的信号干扰；而用于活体成像时，未与肿瘤结合的探针长时间存留于血液循环系统和非靶组织中，造成极高的背景信号，只有当未结合探针代谢出体外后，肿瘤部位的荧光信号才能凸显出来。因此，“always on”模式往往表现出诊断时间长、成像对比度不高、灵敏度有限等缺点，难以适应肿瘤早期诊断的需要，并限制了 aptamer在临床实际体系的肿瘤检测与治疗等方面的应用。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有靶肿瘤细胞特异响应性构型激活性能的裂开型核酸适配体探针，并在此基础上提供一种简单、快速、免洗、灵敏而特异的肿瘤细胞检测方法和一种简单、快速、细胞亲和性好的肿瘤细胞捕获与释放方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种裂开型核酸适配体探针(Splited Aptamer Probe, SAP),所述探针包括将完整的核酸适配体序列在适当位点分裂后形成的两条核酸片段，设 为片段a和片段b ;所述完整的核酸适配体序列具有对靶肿瘤细胞的特异性识别能力，在与靶肿瘤细胞结合时会形成特定的构型；所述适当位点是指在该位点(一个或一个以上的位点)对完整的核酸适配体序列进行分裂后的核酸片段仍能保持对靶肿瘤细胞的特异性识别能力；所述片段a和片段b在没有靶肿瘤细胞存在时不会发生相互作用，当体系中引入靶肿瘤细胞时，片段a和片段b与靶肿瘤细胞发生特异性结合，形成与完整的核酸适配体序列类似的识别构型，所述片段a和片段b对靶肿瘤细胞的特异性结合必须在片段a和片段b同时存在时才能发生。
[0007]上述的裂开型核酸适配体探针中，所述片段a和片段b对靶肿瘤细胞的特异性结合具有温度敏感性，即片段a和片段b与靶肿瘤细胞在0°C-8°C共培育时发生特异性结合，当温度上升至37°C或37°C以上时，片段a和片段b与靶肿瘤细胞全部解离；所述片段a和片段b与靶肿瘤细胞的特异性结合和解离具有可逆性。
[0008]上述的裂开型核酸适配体探针中，优选的，所述完整的核酸适配体序列是指通过指数富集的配体系统进化技术(简称SELEX技术)筛选出来的肿瘤细胞特异性核酸适配体。更优选的，所述完整的核酸适配体序列是指对人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(简称CCRF-CEM肿瘤细胞)具有特异性识别能力的核酸适配体序列，所述完整的核酸适配体序列的核苷酸序列为:
[0009]5’ -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3’ ；
[0010]所述完整的核酸适配体序列裂开后形成的片段a和片段b的核苷酸序列分别为:
[0011]片段a:5’ -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AA-3’ ；
[0012]片段b:5’-TAC TGT ACG GTT AGA-3’ 或 5’-CTG TAC GGT TAG A-3’(在前一个片段b核苷酸序列的基础上去除TA两个碱基)。
[0013]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述裂开型核酸适配体探针用于肿瘤细胞检测的方法，包括以下步骤:
[0014](I)在片段a的5’端、片段b的3’端分别连接荧光供体和荧光受体，或者在片段a的3’端、片段b的5’端分别连接荧光供体和荧光受体；
[0015](2)向待测细胞溶液中加入5’端连接有荧光供体的片段a和3’端连接有荧光受体的片段b，或者加入3’端连接有荧光供体的片段a和5’端连接有荧光受体的片段b，混匀后于0°C-8°C下共培育90分钟，并采用阴性细胞溶液进行相同操作作为阴性对照；
[0016](3)对上述共培育后的阴性细胞溶液和待测细胞溶液分别进行流式细胞术分析，即采用流式细胞仪激发荧光供体、收集荧光受体的信号，并对收集到的细胞群的荧光受体信号强度进行统计分析；在相同检测参数下，当阴性细胞溶液中荧光受体信号强度高于10的细胞数占细胞群中细胞总数的百分率小于或等于5%、待测细胞溶液中荧光受体信号强度高于10的细胞数占细胞群中细胞总数的百分率大于或等于10%时，即认为待测溶液中有目标肿瘤细胞被所述裂开型核酸适配体探针检出。
[0017]上述裂开型核酸适配体探针用于肿瘤细胞检测的方法中，所述荧光供体和荧光受体之间存在荧光共振能量转移效应；所述荧光供体和荧光受体组成荧光供受体对，所述荧光供受体对优选包括 FITC-TMR、FAM-TMR、Alexa488_TMR、Atto550-Atto647, Cy3_Cy5。
[0018]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述裂开型核酸适配体探针用于温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放的方法，包括以下步骤:
[0019](1)将片段a的5’端先插入连接片段后再修饰第一功能团，在一捕获容器底部修饰第二功能团，通过第一功能团与第二功能团之间的相互作用将带有连接片段的片段a固定至捕获容器底部，得到固定有片段a的捕获容器；
[0020](2)将待捕获细胞样品与片段b —起加入上述固定有片段a的捕获容器中，于(TC-8°C下共培育90分钟，去除上清液并洗涤捕获容器后，靶肿瘤细胞即可从待捕获细胞样品中分离出来并被捕获至捕获容器的底部；
[0021](3)将上述捕获有靶肿瘤细胞的捕获容器置于25°C-40°C培育60分钟后取出上清液，即得到含有单纯靶肿瘤细胞的溶液，可进一步用于细胞培养、检测或其他相关研究。
[0022]上述裂开型核酸适配体探针用于温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放的方法中，所述裂开型核酸适配体探针对肿瘤细胞的捕获与释放具有可逆性；所述固定有片段a的捕获容器具有循环使用功能，即在通过温度变化控制肿瘤细胞捕获与释放过程中，当经过一轮细胞捕获与释放后，所述固定有片段a的捕获容器能够继续用于下一轮肿瘤细胞的捕获与释放。
[0023]上述裂开型核酸适配体探针用于温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放的方法中，所述连接片段优选一段不会与片段a杂交的核酸片段(如聚A链、聚T链等)或者一段具有亲水性和生物相容性的聚合物链(如聚乙二醇链等)；所述第一功能团优选生物素、巯基、羧基、氨基或炔基；所述第二功能团优选链霉亲和素、巯基、氨基或叠氮基；所述捕获容器优选细胞培养板(如96孔板等)或细胞捕获芯片(如微流控芯片等)。
[0024]本发明的裂开型核酸适配体探针中，当片段a和片段b与靶肿瘤细胞在0°C-8°C共同培育时表现出高亲和力的特异性结合，随着环境温度逐渐升高，片段a和片段b对靶肿瘤细胞的特异性结合能力逐渐下降，片段a和片段b与靶肿瘤细胞逐渐解离，当环境温度升至37°C或37°C以上时，片段a和片段b对靶肿瘤细胞的特异性结合能力几乎完全消失，片段a和片段b与靶肿瘤细胞完全解离；片段a和片段b与靶肿瘤细胞的特异性结合和解离具有明显的可逆特征，当片段a和片段b与靶肿瘤细胞在OV-8°C结合后，随着环境温度升高至37°C或37°C以上，片段a和片段b从靶肿瘤细胞表面解脱下来，随着环境温度降低至0°C-8°C，片段a和片段b重新结合到靶肿瘤细胞表面。
[0025]本发明的探针用于肿瘤细胞检测的方法中，在没有靶肿瘤细胞存在时，5’端连接有荧光供体的片段a和3’端连接有荧光受体的片段b、或者3’端连接有荧光供体的片段a和5’端连接有荧光受体的片段b均处于游离状态且不发生相互作用，此时荧光供体和荧光受体距离较远，信号转换微弱；体系中引入靶肿瘤细胞时，5’端连接有荧光供体的片段a和3’端连接有荧光受体的片段b、或者3’端连接有荧光供体的片段a和5’端连接有荧光受体的片段b与靶肿瘤细胞结合并形成特定构型，导致荧光供体和荧光受体靠近而发生显著的信号转换效应。
[0026]荧光供体可优选FITC、FAM、Alexa488、Atto550、Cy3、包裹染料分子的二氧化硅纳米颗粒或荧光量子点，荧光受体可优选TMR、Atto647或Cy5。
[0027]本发明的探针用于肿瘤细胞特异性捕获与释放的方法中，通过温度变化控制肿瘤细胞捕获与释放时，第一功能团和第二功能团之间的相互作用不会受到显著影响，固定的片段a不会产生明显损失。
[0028]连接片段用于使片段a与捕获容器底部之间存在一定距离，以避免片段a与靶肿瘤细胞结合时捕获容器底部产生的空间位阻；第一功能团与第二功能团之间的相互作用包括特异性结合作用或者共价交联作用；捕获容器用于装载一定体积溶液并进行细胞培育。
[0029]与现有技术相比，本发明的优点在于:
[0030]本发明利用了核酸适配体对肿瘤细胞的特异性高亲和力以及裂开型核酸探针的靶标响应性构型转换机制和温度敏感性，发展了基于裂开型核酸适配体探针的肿瘤细胞检测以及温度控制的特异性捕获与释放技术。在基于SAP的肿瘤细胞检测技术中，本发明利用裂开型核酸探针作为信号转换元件，将核酸适配体对靶肿瘤细胞的识别能力高灵敏、高特异性地转换为荧光信号的变化，避免了现有基于单一信号报告基团标记核酸适配体的检测方法中，为克服非特异性吸附信号而进行的繁琐洗涤过程，缩短了检测时间。同时，基于裂开型核酸探针信号转换机制，SAP与靶肿瘤细胞结合前后因构型发生变化而引起荧光信号被激活，极大提高了检测方法的灵敏性和特异性，这是传统分析方法所无法比拟的。而在基于SAP的肿瘤细胞捕获与释放技术中，本发明利用裂开型核酸探针对靶标响应能力的温度敏感特性，实现了一种温和、简单、快速且细胞亲和性好的温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放方法，将有望在血液循环肿瘤细胞分析及相关研究中发挥重要作用。
[0031]本发明为核酸适配体在肿瘤细胞检测以及捕获和释放研究中的应用提供了全新的手段和思路。该基于裂开型核酸适配体探针的肿瘤细胞检测方法操作简单、快速、灵敏、特异性强、成本低，该基于裂开型核酸适配体探针的肿瘤细胞捕获与释放方法操作简单、温和、快速、选择性好、细胞伤害小，均具有重要的科学价值和广阔的市场前景，有巨大的社会效益和经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为本发明实施例中裂开型核酸适配体探针的构建及其肿瘤细胞识别原理示意图。
[0033]图2为本发明实施例1中裂开型核酸适配体探针对靶肿瘤细胞的识别亲和力、特异性和温敏性考察中，CCRF-CEM细胞和Ramos细胞分别与Cy5_SAPb探针、Cy5_SAP探针(同时包含Cy5-SAPb和SAPa)、Cy5_Sgc8c探针在4°C、20°C和37°C培育后的流式分析结果图，其中:
[0034]曲线a为CCRF-CEM细胞或Ramos细胞与Cy5_SAPb探针在4°C、20°C或37°C培育后的流式分析结果；
[0035]曲线b为CCRF-CEM细胞或Ramos细胞与Cy5_SAP探针(同时包含Cy5_SAPb和SAPa)在4°C、20°C或37°C培育后的流式分析结果；
[0036]曲线c为CCRF-CEM细胞或Ramos细胞与Cy5_Sgc8c探针在4°C、20°C或37°C培育后的流式分析结果。
[0037]图3为本发明实施例1中裂开型核酸适配体探针与靶肿瘤细胞结合的可逆温度响应性考察中，Cy5-SAP探针标记的CCRF-CEM细胞首先在37°C培育不同时间再于4°C培育不同时间、扣除背景后的归一化细胞平均荧光强度柱状图。
[0038]图4为本发明实施例2中SAPa_Cy3探针和Cy5_SAPb探针的构建及其肿瘤细胞检测原理示意图。
[0039]图5为本发明实施例2中基于裂开型核酸适配体探针结合荧光共振能量转移效应的肿瘤细胞特异性检测可行性考察中，SAPa_Cy3探针和Cy5_SAPb探针共存时分别对CCRF-CEM细胞和Ramos细胞检测的流式细胞分析结果图。
[0040]图6为本发明实施例3中基于裂开型核酸适配体探针的温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放原理示意图。
[0041]图7为本发明实施例3中基于裂开型核酸适配体探针的温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放可行性考察中，对照实验组未修饰生物素化SAPa探针的96孔板加入SAPb探针后对CCRF-CEM细胞捕获结果的明视场成像图。
[0042]图8为本发明实施例3中基于裂开型核酸适配体探针的温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放可行性考察中，对照实验组修饰有生物素化SAPa探针的96孔板在不加入SAPb探针的情况下对CCRF-CEM细胞捕获结果的明视场成像图。
[0043]图9为本发明实施例3中基于裂开型核酸适配体探针的温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放可行性考察中，对照实验组修饰有生物素化SAPa探针的96孔板加入SAPb探针后对Ramos细胞捕获结果的明视场成像图。
[0044]图10为本发明实施例3中基于裂开型核酸适配体探针的温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放可行性考察中，修饰有生物素化SAPa探针的96孔板加入SAPb探针后对CCRF-CEM细胞捕获结果的明视场成像图。
[0045]图11为本发明实施例3中基于裂开型核酸适配体探针的温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放可行性考察中，修饰有生物素化SAPa探针的96孔板加入SAPb探针并对CCRF-CEM细胞捕获后的样品在4°C培育I小时后的释放结果的明视场成像图。
[0046]图12为本发明实施例3中基于裂开型核酸适配体探针的温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放可行性考察中，修饰有生物素化SAPa探针的96孔板加入SAPb探针并对CCRF-CEM细胞捕获后的样品在37°C培育I小时后的释放结果的明视场成像图。[0047]图13为本发明实施例3中基于裂开型核酸适配体探针的温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放可行性考察中，修饰有生物素化SAPa探针的96孔板加入SAPb探针后对CCRF-CEM细胞的捕获结果、修饰有生物素化SAPa探针的96孔板加入SAPb探针并对CCRF-CEM细胞捕获后的样品分别在4°C和37°C培育I小时后的释放结果的统计分析图。
[0048]图14为本发明实施例3中生物素化SAPa探针修饰的孔板用于靶肿瘤细胞的循环捕获与释放可行性考察中，修饰有生物素化SAPa探针的96孔板加入SAPb探针后对经钙黄绿素染色的CCRF-CEM细胞的第一轮抓捕结果、释放结果和第二轮抓捕结果、释放结果的荧光成像图。[0049]图15为本发明实施例3中生物素化SAPa探针修饰的孔板用于靶肿瘤细胞的循环捕获与释放可行性考察中，修饰有生物素化SAPa探针的96孔板加入SAPb探针后对经钙黄绿素染色的CCRF-CEM细胞的第一轮抓捕结果、释放结果和第二轮抓捕结果、释放结果的统计分析图。
【具体实施方式】
[0050]以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
[0051]实施例1:
[0052]针对CCRF-CEM肿瘤细胞(即人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞)设计的裂开型核酸适配体探针
[0053]一种如图1所示的本发明的裂开型核酸适配体探针(SAP)，该探针包括将完整的核酸适配体序列在适当位点分裂后形成的两条核酸片段一SAPa和SAPb。该完整的核酸适配体序列具有对靶肿瘤细胞的特异性识别能力，并在与靶肿瘤细胞结合时会形成特定的发夹构型。SAPa和SAPb在没有靶标(即靶肿瘤细胞)存在的情况下均处于自由游离状态，不会发生明显的相互作用，但当体系中引入靶肿瘤细胞后，靶标会诱导SAPa和SAPb形成与完整的核酸适配体序列类似的发夹构型，从而可与靶肿瘤细胞发生特异性结合。本实施例的裂开型核酸适配体探针设计完成后直接交上海生工生物工程技术有限公司合成。
[0054]本实施例中的完整的核酸适配体序列是一段对CCRF-CEM肿瘤细胞具有特异性识别能力的DNA，其核苷酸序列为:
[0055]5’ -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3’ ；
[0056]本实施例中的裂开型核酸适配体探针的核苷酸序列分别为
[0057]SAPa:5，-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AA-3，；
[0058]SAPb:5’ -CTG TAC GGT TAG A-3’。
[0059]裂开型核酸适配体探针对靶肿瘤细胞的识别亲和力、特异性和温敏性考察
[0060]为考察上述本实施例的裂开型核酸适配体探针对靶肿瘤细胞的识别性能，首先采用近红外荧光染料Cy5对SAPb的5’端进行标记，随后向100 ii L含有2 X IO5个CCRF-CEM细胞的结合缓冲液(含4.5g/L葡萄糖、5mM MgCl2、lmg/mL牛血清白蛋白和0.lmg/mL酵母tRNA 的 Dulbecco，s PBS 缓冲液)中加入 100 u L 含有 80nM Cy5 标记的 SAPb (Cy5_SAPb)和640nMSAPa的结合缓冲液，混匀后分别于4°C (0-8°C均可，下同)、20°C和37°C下避光培育90分钟，再立即用FACSCalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson，美国)对细胞的荧光强度进行检测(采用633nm光激发、第四通道FL4收集);同时，在相同条件下，采用人B淋巴细胞瘤细胞(简称Ramos细胞)作为阴性对照细胞，采用单纯Cy5_SAPb作为阴性对照探针，采用Cy5标记的完整核酸适配体序列SgcSc (Cy5-Sgc8c)作为阳性对照探针。
[0061]如图2所示，当以单纯Cy5_SAPb探针为阴性对照时，在4°C培育后，Cy5_SAP探针(同时包含Cy5-SAPb和SAPa)显示出与完整Cy5_Sgc8c相当的CCRF-CEM细胞荧光标记强度，说明该温度下，将SgcSc裂开并不会对其靶细胞识别能力产生影响；然而，随着温度的升高，尽管完整Cy5-Sgc8c始终保持着对CCRF-CEM细胞的高亲和力，但Cy5_SAP探针则表现出显著的温度敏感性，其标记靶细胞的荧光强度随温度升高而急剧下降。特别是当温度升高至37°C时，Cy5-SAP探针几乎完全丧失了对CCRF-CEM细胞的识别效果。同时，在以Ramos细胞为阴性对照的特异性考察中还发现，无论在任何温度下，Cy5-SAP探针都没有显示对Ramos细胞的明显标记效果，展示出良好的检测特异性；而相比之下，完整Cy5-Sgc8c则始终表现出较Cy5-SAP探针稍强的非特异性吸附信号。因此，在最佳识别温度4°C (也可以是0-8°C )下，Cy5-SAP探针产生的CCRF-CEM细胞对Ramos细胞的荧光标记信背比要远高于完整Cy5-Sgc8c。由此可见，裂开型核酸适配体探针能够有效实现在保留亲和力的同时提高检测特异性，且这一识别性能具有明显的温度敏感性。
[0062]裂开型核酸适配体 探针与靶肿瘤细胞结合的可逆温度响应性考察
[0063]采用流式细胞术对SAP探针与靶CCRF-CEM细胞之间相互作用的可逆温度响应性进行了考察，即以单纯Cy5-SAPb对CCRF-CEM细胞的非特异性信号为背景，首先将Cy5_SAP探针(包含40nM Cy5-SAPb和320nM SAPa)与CCRF-CEM细胞在结合缓冲液中于4°C避光培育90分钟使二者稳定结合，接着将该细胞样品置于37°C培养箱中孵育I小时，孵育期间每隔10分钟取IOOy L进行流式分析检测；随后将37°C孵育I小时后的细胞样品置于4°C避光培育I小时，培育期间每隔10分钟取出IOOy L进行流式分析检测(采用633nm光激发、第四通道FL4收集)。
[0064]将每个细胞样品通过流式细胞分析得到的平均荧光强度进行非特异性背景扣除和归一化处理后，可得到如图3所示的识别能力变化趋势。由图3可知，将Cy5-SAP探针与CCRF-CEM细胞置于4°C培育90分钟后，与Cy5_SAPb对照探针样品相比，可观察到显著增强的荧光标记信号，表明在此温度下SAP具有对靶肿瘤细胞的高亲和力。接着，将该标记有Cy5-SAP探针的CCRF-CEM细胞样品置于37°C培育不同时间发现，细胞的荧光信号随时间延长而逐渐下降，当培育时间为30分钟时，CCRF-CEM细胞的荧光标记强度即已下降80%以上，而在培育60分钟后，所检测到的信号即与Cy5-SAPb探针阴性背景相当，显示此时Cy5-SAP探针已与CCRF-CEM细胞完全解离。随后，将已于37°C下培育60分钟的Cy5_SAP标记CCRF-CEM细胞样品重新置于4°C继续培育，可以发现，随着时间的延长，细胞的荧光信号呈现出逐渐上升的趋势，当培育时间为30分钟时，所检测到的细胞荧光强度即已恢复近60%，而在培育60分钟后，则可观察到80%左右的荧光恢复。由此可见，SAP探针与CCRF-CEM细胞之间的结合和解离状态完全可以通过调节环境温度在4°C和37°C之间转换这一非常温和的方式进行控制。
[0065]实施例2:
[0066]基于裂开型核酸适配体探针结合荧光共振能量转移效应的肿瘤细胞检测方法(SP可行性考察)[0067]如图4所示，以Cy3_Cy5作为荧光供受体对模型，裂开型核酸适配体探针结合荧光共振能量转移效应用于肿瘤细胞检测的原理如下:将荧光供体Cy3连接于SAPa探针3’端构建了 SAPa-Cy3探针，将荧光受体Cy5连接于SAPb探针5’端构建了 Cy5_SAPb探针；向待测细胞溶液中加入SAPa_Cy3探针和Cy5_SAPb探针，当体系中没有靶肿瘤细胞存在时，SAPa-Cy3探针和Cy5_SAPb探针之间不会发生明显的相互作用，荧光供体Cy3和荧光受体Cy5之间距离较远，荧光共振能量转移信号微弱，处于“关闭”状态；而当体系中有靶肿瘤细胞存在时，在最佳识别温度(0-8°C)下，由于SAPa-Cy3探针和Cy5_SAPb探针经靶标诱导形成类似发夹的构型，从而将荧光供体Cy3和荧光受体Cy5之间的距离拉近并触发荧光共振能量转移信号增强，信号转换为“开启”状态；由此，通过监测荧光共振能量转移信号的变化即可指示靶肿瘤细胞的存在。
[0068]本实施例中，采用的针对CCRF-CEM肿瘤细胞的裂开型核酸适配体探针同实施例1,
[0069]SAPa_Cy3探针的核苷酸序列为:
[0070]5， -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AA_(Cy3)_3，；
[0071]Cy5_SAPb探针的核苷酸序列为: [0072]5， -(Cy5)-CTG TAC GGT TAG A_3，。
[0073]具体检测方法如下:
[0074]分别向100 ii L含有2 X IO5个CCRF-CEM细胞的结合缓冲液和100 U L含有2 X IO5个Ramos细胞的结合缓冲液中加入100 u L含有80nM SAPa_Cy3探针和640nM Cy5_SAPb探针的结合缓冲液，混匀后均于4°C避光培育90分钟，再立即用流式细胞仪对细胞的荧光强度进行检测(采用488nm光激发、第三通道FL3收集荧光共振能量转移信号)。
[0075]结果如图5所示，与SAPa_Cy3探针和Cy5_SAPb探针共培育后的CCRF-CEM细胞样品在488nm光激发下，显示出较为强烈的荧光共振能量转移信号(第三通道FL3收集信号)增强，其中信号强度高于10的细胞数占细胞群中细胞总数的51.42% ;而在相同条件下，与SAPa-Cy3探针和Cy5_SAPb探针共培育后的Ramos细胞样品则并未呈现明显的荧光共振能量转移效应发生，其中信号强度高于10的细胞数仅占细胞群中细胞总数的4.57%。由此说明，该基于裂开型核酸适配体探针结合荧光共振能量转移效应的肿瘤细胞检测方法完全具备可行性，并且展示出灵敏而特异的检测性能。
[0076]实施例3:
[0077]基于裂开型核酸适配体探针的肿瘤细胞特异性捕获与释放方法(即可行性考察)
[0078]肿瘤细胞的特异性捕获、分离和释放回收技术的发展对于血液循环肿瘤细胞分析及其相关研究具有十分重要的意义。本发明利用裂开型核酸适配体探针对靶肿瘤细胞的识别亲和力具有温度敏感性的特点，发展了一种温和、简单而快速的肿瘤细胞特异性捕获与释放方法，其具体原理如图6所示:直接选择包被有亲和素的96孔细胞培养板作为捕获容器，同时在SAPa片段5’端先插入由10个连续T碱基组成的连接片段再修饰生物素分子以构建生物素化SAPa探针；接着，基于“生物素-亲和素”特异性相互作用在该96孔板底部组装生物素化SAPa探针，并采用牛血清白蛋白(BSA)对未结合位点进行封闭；在向孔内加入待捕获细胞样品和SAPb探针后置于4°C培育，利用此温度下生物素化SAPa探针和SAPb探针的特异性识别能力将靶肿瘤细胞捕获至底板上，同时将未结合的非靶细胞和其他杂质有效去除；随即采用简单而温和的温度控制方式，将孔板置于37°C条件下，使生物素化SAPa探针和SAPb探针丧失对靶标的结合能力从而将靶肿瘤细胞释放至上清液中，由此获得的含有单纯靶肿瘤细胞的溶液可进一步用于细胞培养、检测或其他相关研究；与此同时，经细胞释放后的孔板还可循环利用进入下一轮肿瘤细胞捕获与释放过程。
[0079]本实施例中，采用的针对CCRF-CEM肿瘤细胞的裂开型核酸适配体探针同实施例1,
[0080]生物素化SAPa探针的核苷酸序列为:
[0081]5，-生物素-TTT TTT TTT T ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AA-3，。
[0082]具体捕获与释放方法包括以下步骤:[0083](I)向亲和素包被的96孔板内加入50 u L/孔含有生物素化SAPa探针的Tris-HCl缓冲液(IOOmM NaCl、30mM Tris-HCl，pH7.4)，每 50 y L Tris-HCl 缓冲液中含 200pmol 生物素化SAPa探针，于37°C下避光孵育I小时后用磷酸盐缓冲液(8.00g/L NaCU0.20g/L KCl、
1.44g/LNa2HP04、0.24g/L KH2PO4, pH7.4)洗孔三次以去掉多余的未结合生物素化SAPa探针，再加入50 ii L质量分数为1%的BSA于37°C继续避光孵育I小时以封闭孔板底部的未反应位点，接着用结合缓冲液洗孔3遍，即制得底板上固定有生物素化SAPa探针的96孔板；
[0084](2)向上述底板上固定有生物素化SAPa探针的96孔板中加入50ii L/孔含有CCRF-CEM细胞的结合缓冲液(3X IO5个CCRF-CEM细胞/50 u L结合缓冲液)和6.4 y L/孔SAPb探针(50 ii M)，混匀后于4°C避光培育90分钟，去除上清液并用结合缓冲液(预先冰好)于4°C洗孔3遍后，靶肿瘤细胞即可从原样品中分离出来并被捕获至孔板底部，随后加入100 u L/孔结合缓冲液于光学显微镜下对孔板底部捕获到的靶肿瘤细胞进行成像表征和计数，以判定该捕获过程是否有效；
[0085](3)将上述捕获有靶肿瘤细胞的孔板置于37°C避光培育60分钟后取出上清液，即可获得含有单纯靶肿瘤细胞的溶液，随后加入100 u L/孔结合缓冲液于光学显微镜下对孔板底部残留的细胞进行成像表征和计数，以判定该释放过程是否有效。
[0086]针对上述基于裂开型核酸适配体探针的肿瘤细胞特异性捕获与释放方法，首先通过设计多组对照实验对其特异性捕获可行性进行了考察(含操作步骤I和操作步骤2)，包括未修饰生物素化SAPa探针的孔板加入SAPb探针后对CCRF-CEM细胞的捕获对照(参见图7)、修饰有生物素化SAPa探针的孔板在不加入SAPb探针的情况下对CCRF-CEM细胞的捕获对照(参见图8)以及修饰有生物素化SAPa探针的孔板加入SAPb探针后对Ramos细胞的捕获对照(参见图9)。结果表明，只有修饰了生物素化SAPa探针的孔板在同时加入SAPb探针的情况下才能实现对CCRF-CEM细胞的特异性捕获(参见图10)，其捕获到的细胞密度高达4638±394cells/mm2 (参见图 13)。
[0087]随后，将上述经操作步骤I和操作步骤2获得的捕获有CCRF-CEM细胞的孔板样品置于37°C下培育I小时(操作步骤3)，考察了细胞释放可行性。以经操作步骤I和操作步骤2获得的捕获有CCRF-CEM细胞的孔板样品置于4°C下培育I小时后的释放结果为对照比较发现，4°C培育并未使捕获到的细胞得到有效释放(参见图11)，仍然可以观察到密度为4200 ±551 ce 11 s/mm2的CCRF-CEM细胞牢固结合在孔板底部(参见图13);而经过37°C处理后，由于破坏了裂开型核酸适配体探针与靶细胞之间的紧密结合，底板上仅可见个别细胞残留(参见图12)，密度下降至18±6cells/mm2 (参见图13)。[0088]综上所述，裂开型核酸适配体探针不仅可用于靶肿瘤细胞的特异性捕获，而且还能在温度改变的温和调控下，有效实现对捕获细胞的释放回收。
[0089]生物素化SAPa探针修饰的孔板用于靶肿瘤细胞的循环捕获与释放可行性考察
[0090]采用钙黄绿素对CCRF-CEM细胞进行荧光染色，即将适量CCRF-CEM细胞置于含6111钙黄绿素的磷酸盐缓冲液(8.0(-/1 NaCl、0.20g/L KCl、1.44g/L Na2HP04、0.24g/LKH2PO4,pH7.4)中，于37°C避光培育20分钟后用磷酸盐缓冲液洗涤3次并分散于结合缓冲液中备用(采用汞灯蓝光波段激发，收集绿光发射)；随后采用如上述基于裂开型核酸适配体探针的温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放可行性考察中所述孔板修饰和细胞捕获与释放程序对CCRF-CEM细胞进行连续两轮捕获与释放处理，于低倍物镜大视野观察条件下对生物素化SAPa探针修饰的孔板用于靶肿瘤细胞的循环捕获与释放性能进行了考察。结果如图14和图15所示，经4°C培育后，生物素化SAPa探针修饰的孔板在SAPb探针的共同作用下，将大量钙黄绿素标记的CCRF-CEM细胞捕获于孔板底部，密度高达4173± 113cells/mm2 ;接着进行37°C升温处理，绝大多数细胞即被释放至上清中，底板上仅可见零星光点，密度下降为15±6CellS/mm2，由此成功实现了第一轮细胞捕获与释放。随后，向上述孔中继续加入新鲜钙黄绿素标记的CCRF-CEM细胞样品并补充SAPb探针以实施第二轮细胞捕获与释放。通过统计底板上的细胞密度发现，该使用过孔板的捕获效率仍高达4330±170cellS/mm2，且释放后即急剧下降至13±5CellS/mm2。由此可见，该温控处理方式不会对生物素化SAPa探针修饰孔板的捕获与释放性能造成破坏，使其可有效用于肿瘤细胞的循环捕获与释放研究。
[0091 ] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种裂开型核酸适配体探针，其特征在于，所述探针包括将完整的核酸适配体序列在适当位点分裂后形成的两条核酸片段，设为片段a和片段b ;所述完整的核酸适配体序列具有对靶肿瘤细胞的特异性识别能力，所述适当位点是指在该位点对完整的核酸适配体序列进行分裂后的核酸片段仍能保持对靶肿瘤细胞的特异性识别能力；所述片段a和片段b在没有靶肿瘤细胞存在时不会发生相互作用，当体系中引入靶肿瘤细胞时，片段a和片段b与靶肿瘤细胞发生特异性结合，所述片段a和片段b对靶肿瘤细胞的特异性结合必须在片段a和片段b同时存在时才能发生。
2.根据权利要求1所述的裂开型核酸适配体探针，其特征在于，所述片段a和片段b对靶肿瘤细胞的特异性结合具有温度敏感性，即片段a和片段b与靶肿瘤细胞在(TC-8°C共培育时发生特异性结合，当温度上升至37°C或37°C以上时，片段a和片段b与靶肿瘤细胞全部解离；所述片段a和片段b与靶肿瘤细胞的特异性结合和解离具有可逆性。
3.根据权利要求1或2所述的裂开型核酸适配体探针，其特征在于，所述完整的核酸适配体序列是指通过指数富集的配体系统进化技术筛选出来的肿瘤细胞特异性核酸适配体。
4.根据权利要求3所述的裂开型核酸适配体探针，其特征在于，所述完整的核酸适配体序列是指对人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞具有特异性识别能力的核酸适配体序列，所述完整的核酸适配体序列的核苷酸序列为:
5’ -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3’ ； 所述完整的核酸适配体序列裂开后形成的片段a和片段b的核苷酸序列分别为:
片段 a:5’ -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AA-3’ ；
片段 b:5’ -TAC TGT ACG GTT AGA-3’ 或 5’ -CTG TAC GGT TAG A-3’。
5.一种如权利要求1 -4中任一项所述的裂开型核酸适配体探针用于肿瘤细胞检测的方法，包括以下步骤: (1)在片段a的5’端、片段b的3’端分别连接荧光供体和荧光受体，或者在片段a的3’端、片段b的5’端分别连接荧光供体和荧光受体； (2)向待测细胞溶液中加入5’端连接有荧光供体的片段a和3’端连接有荧光受体的片段b，或者加入3’端连接有荧光供体的片段a和5’端连接有荧光受体的片段b，混匀后于0°C-8°C下共培育90分钟，并采用阴性细胞溶液进行相同操作作为阴性对照； (3)对上述共培育后的阴性细胞溶液和待测细胞溶液分别进行流式细胞术分析，即采用流式细胞仪激发荧光供体、收集荧光受体的信号，并对收集到的细胞群的荧光受体信号强度进行统计分析；在相同检测参数下，当阴性细胞溶液中荧光受体信号强度高于10的细胞数占细胞群中细胞总数的百分率小于或等于5%、待测细胞溶液中荧光受体信号强度高于10的细胞数占细胞群中细胞总数的百分率大于或等于10%时，即认为待测溶液中有目标肿瘤细胞被所述裂开型核酸适配体探针检出。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述突光供体和突光受体之间存在突光共振能量转移效应；所述荧光供体和荧光受体组成荧光供受体对，所述荧光供受体对包括FITC-TMR、FAM-TMR、Alexa488_TMR、Atto550-Atto647 或 Cy3_Cy5。
7.—种如权利要求1-4中任一项所述的裂开型核酸适配体探针用于温度控制的肿瘤细胞特异性捕获与释放的方法，包括以下步骤: (I)将片段a的5’端先插入连接片段后再修饰第一功能团，在一捕获容器底部修饰第二功能团，通过第一功能团与第二功能团之间的相互作用将带有连接片段的片段a固定至捕获容器底部，得到固定有片段a的捕获容器； (2)将待捕获细胞样品与片段b—起加入上述固定有片段a的捕获容器中，于0°C-8°C下共培育90分钟，去除上清液并洗涤捕获容器后，靶肿瘤细胞即可从待捕获细胞样品中分离出来并被捕获至捕获容器的底部； (3)将上述捕获有祀肿瘤细胞的捕获容器置于25°C-40°C培育60分钟后取出上清液，即得到含有单纯靶肿瘤细胞的溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述裂开型核酸适配体探针对肿瘤细胞的捕获与释放具有可逆性，所述固定有片段a的捕获容器具有循环使用功能，即在通过温度变化控制肿瘤细胞捕获与释放过程中，当经过一轮细胞捕获与释放后，所述固定有片段a的捕获容器能够继续用于下一轮肿瘤细胞的捕获与释放。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述连接片段为一段不会与片段a杂交的核酸片段或 者一段具有亲水性和生物相容性的聚合物链；所述第一功能团包括生物素、巯基、羧基、氨基或炔基；所述第二功能团包括链霉亲和素、巯基、氨基或叠氮基；所述捕获容器包括细胞培养板或细胞捕获芯片。
【文档编号】C12Q1/04GK103451182SQ201310418651
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】王柯敏, 石慧, 何晓晓, 汤进录, 颜律安 申请人:湖南大学