金黄色葡萄球菌itc融合蛋白及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白，是由IsdB免疫优势片段（IsdBid）和Trap以及ClfA免疫优势片段N3区域（ClfAN3）融合而成的蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明还提供了该融合蛋白的编码基因、制备方法以及在制备预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗中应用。本发明的ITC融合蛋白含有多种抗原，因此免疫效果好，提高了抗金黄色葡萄球菌感染的保护作用，结果与ClfA、IsdB和TraP任意单个蛋白免疫结果相比较，ITC融合蛋白免疫效果优于单个蛋白的免疫效果，并且由于ITC包含分子量较小的Trap和有两种抗原的免疫优势片段，使得肽链长度不会过长，利于体外表达，在预防金黄色葡萄球菌新型疫苗的开发应用方面具有重要价值。
【专利说明】金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学和基因工程领域，涉及一种金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白及制备方法和应用，即将IsdB免疫优势片段和Trap以及ClfA免疫优势片段N3区域融合而成的ITC融合蛋白及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S.aureus)是一种革兰氏阳性菌，既是引起人类多种感染的主要病原菌，也是引起奶牛乳房炎的主要病原菌。但随着临床上抗生素在S.aureus感染治疗中的普遍使用，已出现了大量S.aureus耐药菌株,致使抗生素治疗收效甚微，甚至毫无效果。因此，对S.aureus感染的免疫预防和免疫治疗成为人们现在研究的焦点。在过去的40多年里,人们对S.aureus全菌灭活苗、荚膜多糖结合苗、类毒素、菌体表面粘附素以及菌体结构蛋白亚单位苗等作了大量研究，但免疫保护效果都不令人满意。近年来，随着对S.aureus认识的不断深入和对S.aureus苗的研究探索,使人们意识到使用单一抗原分子作为免疫原进行免疫，其所提供的免疫保护作用有限。而使用S.aureus多种以上抗原制成疫苗会使免疫保护作用得到进一步提高。
[0003]Isd 是 S.aureus 铁调节表面决定族(Iron-regulated surface determinant)的缩写，包括IsdB、IsdA, IsdH等多个成分。Kuklin等报导，Isd家族成员——IsdB在各种
S.aureus株中高度保守，将表达的IsdB用硫羟磷酸铝佐剂制备免疫原免疫小鼠，证实该疫苗具有高度的免疫原性，能显著降低小鼠致死率。TraP(Target of RNAIII ActivatingProtein)是一个由167个氨基酸残基组成的蛋白质，在葡萄球菌中高度保守。它能够被RNAIII激活蛋白(RAP)激活，而且研究认为TraP在葡萄球菌应激反应中发挥作用，可保护DNA免受氧化损伤、自然突变和适应性突变。本实验室曾对表达的IsdB、TraP和RAP的免疫保护作用进行了比较研究，结果IsdB、TraP和RAP均能够刺激小鼠产生良好的体液免疫应答和高水平的细胞因子(IL-4、IFN-Y )，在小鼠败血症模型中用不同菌株攻毒，其免疫保护效果TraP略优于IsdB，IsdB略优于RAP。本实验室的进一步研究证实，将IsdB免疫优势片段126-361aa与TraP进行融合表达，获得的融合蛋白的免疫原性和免疫保护作用得到进一步提高。ClfA是凝集因子A (clumping factor A, ClfA)的缩写,是S.aureus黏附于寄主细胞的最主要的黏附因子之一。ClfA可以介导S.aureus黏附到宿主基质蛋白上，也可以与纤维蛋白原结合而使S.aureus得到保护，从而起到抗吞噬作用，而且ClfA几乎表达于所有的S.aureus表面 。ClfA由933个氨基酸残基构成，分为S、A、R、W、M和C区。其中A区结构域共约500个氨基酸残基组成，可分为三个亚区，即N1、N2和N3。经研究证实ClfA的N2N3具有免疫保护作用，可以用于治疗或预防S.aureus感染。目前，使用上述几种抗原联合起来制备预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗还未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明的第一目的是提供一种金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白，将金黄色葡萄球菌的多种抗原进行串联表达，克服现有的单一抗原分子作为免疫原进行免疫，其所提供的免疫保护作用有限的问题。
[0005]本发明的第二目的是提供上述ITC融合蛋白的编码基因。
[0006]本发明的第三目的是提供上述ITC融合蛋白的制备方法。
[0007]本发明的第四目的是提供上述ITC融合蛋白的用途。
[0008]本发明通过以下技术方案来实现:[0009]一、一种金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白，是由IsdB免疫优势片段(IsdBid)和Trap以及ClfA免疫优势片段N3区(ClfAm)融合而成的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所
/Jn ο
[0010]二、编码上述的ITC融合蛋白的基因，其具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0011]三、上述的ITC融合蛋白的制备方法，其特征在于:该方法包括以下步骤:
[0012](I)ClfA优势片段的筛选，得到ClfAN3 ；
[0013](2)金黄色葡萄球菌IsdBid、TRAP、ClfAn3的基因克隆；
[0014](3)采用重叠延伸PCR技术将IsdBid、TRAP、ClfAn3这三个基因用连接序列连接成ITC融合蛋白的编码基因；
[0015](4)将ITC融合蛋白的编码基因构建入表达载体进行原核表达得到融合蛋白。
[0016]四、上述的ITC融合蛋白在制备预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗中应用。
[0017]采用上述技术方案的积极效果:本发明的ITC融合蛋白是由金黄色葡萄球菌的IsdB免疫优势片段IsdBid和Trap以及ClfA免疫优势片段N3区域ClfAN3融合而成，由于含有多种抗原，因此免疫效果更好，提高了抗金黄色葡萄球菌感染的保护作用，结果与ClfA、IsdB和TraP任意单个蛋白免疫结果相比较，融合蛋白免疫效果优于单个蛋白的免疫效果，并且由于同时含有多种抗原的免疫优势片段，使得肽链长度不会过长，利于体外表达，同时使得制备预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗的制备过程大大简化，在新型疫苗开发应用方面具有重要的价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是ClfAN2N3片段分段的生物信息学分析结果；
[0019]图A为ClfA_结构域片状图，图B为ClfA N3结构域片状图，图C为ClfA N2结构域片状图，图D为ClfA N2N3结构域空间构象图，图E、F为ClfA N2N3结构域的片状结构和空间构象图的融合；
[0020]图2是clfA N2N3基因的PCR产物的电泳分析结果；
[0021]M:DNA Marker DL2000 ；1:clfA N2N3 ；
[0022]图3是clfA N2基因的PCR产物的电泳分析结果；
[0023]M:DNA Marker I ；1:clfA N2 ；
[0024]图4是clfA N3基因的PCR产物的电泳分析结果；
[0025]M:DNA Marker I ；1:clfA N3 ；
[0026]图5是clfA N2N3基因的PCR产物回收的电泳分析结果；
[0027]M:DNA Marker DL2000plus II ；1:clfA N2N3 ；
[0028]图6是clfA N2基因的PCR产物回收的电泳分析结果；[0029]M:DNA Marker I ；1:clfA N2 ；[0030]图7是clfA N3基因的PCR产物回收的电泳分析结果；[0031]M:DNA Marker I ；1:clfA N3 ；[0032]图8是PCR鉴定表达载体重组质粒pET-ClfA N2N3 ；[0033]M:DNA Marker DL2000plus II ；1:pET_ClfA N2N3 ；[0034]图9是PCR鉴定表达载体重组质粒pET-ClfA N2 ；[0035]M:DNA Marker I ；1:pET-ClfA N2 ；[0036]图10是PCR鉴定表达载体重组质粒pET-ClfA N3 ；[0037]M:DNA Marker I ；1:pET-ClfA N3 ；[0038]图11是酶切鉴定表达载体重组质粒pET-ClfA ；[0039]M:DNA Marker DL2000plus II ；1:pET-ClfA N2N3 酶切结果；2:pET-ClfA N2 酶切结果；3:pET-ClfA ^酶切结果；[0040]图12是分段表达的重组蛋白和纯化后的蛋白的SDS-PAGE结果；[0041]图A:ClfAn2n3 ;图 B =ClfA N2 ;图 C =ClfA N3 ；[0042]M:蛋白质Marker ；1:经诱导的Rosetta(DE3)全菌体；2:非诱导的重组菌全菌体；3:经诱导的重组菌全菌体；4:纯化的重组蛋白；[0043]图13是重组分段ClfA蛋白Western blot结果；[0044]M:蛋白质标准分子量 Marker ；1:ClfA N2N3 ；2:ClfA N3 ；3:ClfA N2 ；4:ControI[0045]图14是小鼠免疫后ClfAN2N3的IgG抗体水平；[0046]图15是Newman攻毒结果；[0047]图16是HLJ23-1攻毒结果；[0048]图17是iSdBid基因的PCR产物的电泳分析结果；[0049]M:DNA Marker DL2000 ；l:1sdBid 的目的基因片段；[0050]图18是isdBid基因的PCR产物回收的电泳分析结果；[0051]M:DNA Marker DL2000 ；1:纯化的 isdBid 目的基因片段；[0052]图19是traP基因的PCR产物的电泳分析结果；[0053]M:DNA Marker I ；1:traP的目的基因片段的PCR产物；2:traP的目的基因片段的PCR回收产物；[0054]图20是isdBid_traP目的片段的PCR产物的电泳分析结果；[0055]M:DNA Marker DL2000 ；1:isdBid-traP 的目的基因片段的 PCR 产物；2:isdBid-traP目的基因片段的PCR回收产物；[0056]图21是clfA N3目的片段的PCR产物的电泳分析结果；[0057]M:DNA Marker I ；1:clfA N3的目的基因片段的PCR产物；2:clfA N3目的基因片段的PCR回收产物；[0058]图22是ITC的目的编码片段的PCR产物的电泳分析结果；[0059]M:DNA Marker DL2000 ;1:1TC的目的编码片段的PCR产物；2 =ITC的目的编码片段的PCR回收产物；[0060]图23是ITC的目的编码片段的PCR及酶切鉴定结果；[0061]M:DNA Marker DL2000plus ;1:1TC的目的编码片段的PCR鉴定结果；2 =ITC的目的编码片段的酶切鉴定结果；
[0062]图24是重组蛋白和纯化后的蛋白的SDS-PAGE结果；
[0063]M:蛋白质 Marker ;1:经诱导的 Rosetta (DE3) /pET30a_TEV_LIC 全菌体；2:非诱导的 Rosetta (DE3) /pET30a_TEV_LIC/ITC 全菌体；3:经诱导的 Rosetta (DE3) /pET30a-TEV-LIC/ITC 全菌体；4:纯化的 pET-1TC 蛋白；
[0064]图25是重组蛋白和纯化后的蛋白的SDS-PAGE及Western blot结果；
[0065]M:蛋白质 Marker ；1:经诱导的 Rosetta (DE3/pET30a-TEV_LIC 全菌体；2:非诱导的 Rosetta (DE3) /pET30a_TEV_LIC/ITC 全菌体；3:经诱导的 Rosetta (DE3) /pET30a-TEV-LIC/ITC 全菌体；4:纯化的 ITC 蛋白；
[0066]图26 是 SignalP-NN 和 SignalP-HMM 结果；
[0067]图27是IsdB编码序列的PCR扩增及回收结果；
[0068]M:DNA Marker DL2000plus II ；1:isdB 的目的编码片段的PCR产物；2:isdB 的目的编码片段的PCR回收产物；
[0069]图28是pET-1sdB表达载体的PCR和酶切鉴定结果；
[0070]M:DNA Marker DL2000plus II ；1:isdB 的目的编码片段的 PCR 鉴定结果；2:isdB的目的编码片段的酶切鉴定结果；
[0071]图29是重组蛋白和纯化后的蛋白的SDS-PAGE及Western blot结果；
[0072]M:蛋白质 Mar ker ；1:经诱导的 Rosetta (DE3) /pET30a-TEV_LIC 全菌体
[0073]2:非诱导的 Rosetta (DE3)/pET30a-TEV_LIC/IsdB 全菌体；3:经诱导的 Rosetta(DE3) /pET30a-TEV-LIC/IsdB 全菌体；4:纯化的 pET-1sdB 蛋白；
[0074]图30是重组蛋白和纯化后的蛋白的SDS-PAGE及Western blot结果；
[0075]M:蛋白质 Marker ；1:经诱导的 Rosetta (DE3) /pET30a-TEV_LIC 全菌体 2:非诱导的 Rosetta (DE3)/pET30a-TEV_LIC/ClfAN2N3 全菌体；3:经诱导的 Rosetta (DE3) /pET30a-TEV-LIC/ClfAN2N3 全菌体；4:纯化的 pET_ClfAN2N3 蛋白；
[0076]图31是重组蛋白和纯化后的蛋白的SDS-PAGE及Western blot结果；
[0077]M:蛋白质 Marker ；1:经诱导的 Rosetta (DE3) /pET30a-TEV_LIC 全菌体 2:非诱导的 Rosetta (DE3) /pET30a_TEV_LIC/TRAP 全菌体；3:经诱导的 Rosetta (DE3) /pET30a-TEV-LIC/TRAP 全菌体；4:纯化的 pET-TRAP 蛋白；
[0078]图32是纯化的重组IsdB、TRAP、ClfA N2N3和ITC蛋白的SDS-PAGE鉴定结果；
[0079]M:蛋白质Marker ；1:纯化的重组ITC蛋白；2:纯化的重组IsdB蛋白；3:纯化的重组TRAP蛋白；4:纯化的重组ClfA N2N3蛋白；
[0080]图33是纯化的重组IsdB、TRAP、ClfA _和ITC蛋白的抗ITC抗体的Westernblot鉴定结果；
[0081]M:蛋白质Marker ；1:纯化的重组ITC蛋白；2:纯化的重组IsdB蛋白；3:纯化的重组TRAP蛋白；4:纯化的重组ClfA N2N3蛋白；
[0082]图34是小鼠免疫血清的IsdB IgG抗体消长曲线；
[0083]图35是小鼠免疫血清的TRAP IgG抗体消长曲线；
[0084]图36是小鼠免疫血清的ClfA_IgG抗体消长曲线；
[0085]图37是免疫血清抗体亚类的测定；[0086]图38是各个免疫组中脾细胞中⑶4+及⑶8+百分含量的比值*(p〈0.05)，** (ρ〈0.01)；
[0087]图39是免疫鼠脾脏及淋巴结细胞FACS分析结果；
[0088]横坐标为脾脏和淋巴结细胞经FITC标记的⑶4+单抗(FLl-H)染色；纵坐标为PerCP标记的⑶8+单抗(FL3-H)染色；
[0089]图40 是脾细胞中 CD4+及 CD8+百分含量 *(ρ〈0.05)，#(ρ〈0.01)；
[0090]图41是淋巴结细胞中CD4+及CD8+百分含量*(ρ〈0.05)，#(ρ〈0.01)；
[0091]图42是0)470)8+检测结果*(?〈0.05)，#(?〈0.01)；
[0092]图43是ELISP0T检测IL-4的斑点数；
[0093]图44是小鼠脾淋巴细胞的IFN- Y和IL-4ELISP0T结果；
[0094]图 A:IFN-y ELISP0T 结果；图 B JL-4ELISP0T 结果;*(ρ〈0.05)，**(ρ〈0.01)；
[0095]图45是金黄色葡萄球菌攻毒结果；
[0096]图A: Newman 攻毒；图 B: HLJ23-1 攻毒；图 C:Wood46 攻毒。
【具体实施方式】
[0097]下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制:
[0098]本发明中生物材料的来源:`[0099]1、金黄色葡萄球菌Newman株、HLJ23-1株、Wood46株，金黄色葡萄球菌凝集因子A的免疫原性，冯昊、刘乐锋、迟佳琦、王宁、李闰婷、佟春玉、马金柱、朱战波、崔玉东，生物工程学报，2009，25 (8):1180-1186 ;另外，该生物材料还公开在专利“金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白的制备及应用”中，专利号:201110231144.4，申请日2011.08.12，
【公开日】2011.12.14,并由 申请人:保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；
[0100]2、所有引物为自行设计并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成；
[0101]3、表达载体pET30a-TEV-LIC，公开在“使用TEV-LIC克隆与表达系统对蛋白激发子PebCl的纯化”中，刘权，黑龙江八一农垦大学学报，2011年，23(4): 43-45，该表达载体由黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院的刘权老师提供给本 申请人:，并由 申请人:保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料。
[0102]实施例1
[0103]本实施例用于说明金黄色葡萄球菌ClfA免疫优势片段(ClfAm)选择和确定。
[0104](I)ClfA分段表达的生物信息学分析
[0105]进入PDB 蛋白质数据库(http://www.rcsb.0rg/pdb/home/home.do),下载到 ClfA的三级结构，利用PyMOL软件进行分析。ClfA的A区域分为三个结构域，分别为NI，N2，N3结构域，其中N2N3片段具有与中和抗体结合活性和其它生物学活性，而NI则不具备这些活性。因此，本实验主要对ClfA _3片段进行分析和研究。经生物信息学分析，在N2，N3之间截断也不会影响或破坏ClfA N2N3空间构象，在两个结构域N2和N3之间截断不会破坏可能的T细胞表位，由于截取的位点包埋在结构域的内部，也不会破坏可能的B细胞表位，见图1。
[0106](2)引物的设计与合成[0107]根据已发表的金黄色葡萄球菌Newman株(GenBank Accessed NumberNC_009641.1)基因序列设计PCR引物。其中，Pl和P4引物扩增clfA _片段，片段大小为990bp，位于基因的661-1650位(SEQ ID N0.3) ;P1和P2引物扩增clfA N2片段，片段大小为447bp，位于基因的661-1107bp位(SEQ ID N0.4) ;P3和P4引物为扩增clfA N3片段，片段大小为543bp，位于基因的1108-1650bp位(SEQ ID N0.5);引物中加下划线的序列是所需要连接的表达载体pET30a-TEV-LIC的同源臂序列及终止序列，引物的核苷酸序列见表1。
[0108]表1实验中用到的引物
[0109]
【权利要求】
1.一种金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白，是由IsdB免疫优势片段(IsdBid)和Trap以及ClfA免疫优势片段N3区域(ClfAN3)融合而成的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.编码权利要求1所述的ITC融合蛋白的基因，其具有SEQID N0.1所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的ITC融合蛋白的制备方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)ClfA优势片段的筛选，得到ClfAN3 ； (2)金黄色葡萄球菌IsdBid、TRAP、ClfAn3的基因克隆； (3)采用重叠延伸PCR技术将IsdBid、TRAP、ClfAn3这三个基因用连接序列连接成ITC融合蛋白的编码基因； (4)将ITC融合蛋白的编码基因构建入表达载体进行原核表达得到融合蛋白。
4.权利要求1所述的ITC融合蛋白在制备预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗中应用。
【文档编号】C12N15/70GK103570835SQ201310480520
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】崔玉东, 朱战波, 于立权, 陈龙欣, 李闰婷 申请人:黑龙江八一农垦大学