食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法和检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法和检测试剂盒。该方法可稳定从植物油中提取核酸成分，并采用恒温扩增的方法在短时间内实现对转基因成分的检测，所述方法包括如下步骤：包括如下步骤：1）提取待检样品DNA；2）待检样品DNA在引物、BstDNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；3）根据扩增结果判断待检样品中是否存在CaMV35S转基因成分。该方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等特点，能快速检测食用油中转基因成分CaMV35S。
【专利说明】食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法和检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物分子检测【技术领域】，具体涉及一种食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法和检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]自20世纪70年代转基因生物和转基因产品被开发以来，转基因产品发展迅猛。到目前为止，已经有超过100种以上的转基因植物被商业化种植，其中最广泛的是作为食用油加工原料的大豆、油菜和玉米。由于这些转基因油料作物出油率高、制油成本低，各发展中国家纷纷进口转基因大豆和油菜作为制油原料。但由于目前尚缺乏科学依据证明转基因食品的安全性，因而对转基因食品检测技术的需求也越来越紧迫。近年来，中国进口的制油原料中，有相当数量的转基因产品，尤其是转基因大豆，中国进口的大豆几乎100%为转基因大豆。由于世界上已经有很多国家规定了转基因食品是必须加贴标签或禁止进口，因此，对食用油脂进行转基因成分的检测，显得尤为重要。如何鉴别食用油脂是否为转基因食品，除了检测原料以外，更多的是需要从成品食用油中直接进行检测。
[0003]花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子是最常使用的组成型启动子，它具有多种顺式作用元件，能在多种植物物种的几乎所有发育阶段和所有组织中高效表达，被广泛用于转基因植株的构建。在目前市面上常见的玉米、棉花、大豆、等转基因植物中，约有85% — 90%的转基因植物使用了该启动子。虽然目前CaMV35S启动子存在多个版本，但其保守序列相对稳定，是转基因检测的最佳靶基因之一。而从食用油脂中提取出可用于核酸检测的DNA，是进行检验的关键。但是食用油的DNA提取仍是国内外的难题之一，由于食用油生产加工过程中经过高温和高压等处理过程，产品中的DNA遭到严重破坏，降解为长度较短，大小不一的片段，而且受到物理、化学和生物等因素的影响，DNA的质量也大大降低。目前，国内外仍没有一个比较稳定的食用油DNA提取方法或试剂盒。本研究建立一种可从食用油中稳定提取核酸的方法，并建立一种恒温检测CaMV35S启动子的方法。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的在于提供一种快速检测食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法。
[0005]本发明的另一个目的在于提供一种用于检测食用油中转基因成分CaMV35S的LAMP试剂盒。
[0006]本发明的另一个目的在于提供一种用于检测食用油中转基因成分CaMV35S的LAMP引物组。
[0007]本发明所采取的技术方案是:
一种食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法，包括如下步骤:
I)根据CaMV35S启动子基因序列设计特异性恒温扩增检测引物；2)提取待检样品DNA；
3)待检样品DNA在上述引物、ifeiDNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；
4)根据扩增结果判断待检样品中是否存在CaMV35S转基因成分。
[0008]所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示:
35S- F3:GGTGGCTCCTACAAATGC (SEQ ID N0:1),
35S- B3:GTCTTGCGAAGGATAGTGG (SEQ ID NO:2),
35S-FIP:GTCCATCTTTGGGACCACTGTCCATCATTGCGATAAAGGAAAGG (SEQ ID NO:3),
35S-BIP: CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGATATCACATC (SEQ ID NO:4)，
35S-FLP:AGAGGCATCTTCAACGATGG (SEQ ID NO:5),
35S-BLP:AGAAGACGTTCCAACCACG (SEQ ID NO:6)。
[0009]作为优选的，步骤2)提取待检样品DNA的具体步骤为:
1)取一定样品油，加入I~3倍体积的正己烷和0.1~0.3倍体积的TE，20~25°C环境条件下，混合均匀；
2)静置分层后，去除上 层油相；
3)将下层的TE水相转移到离心管；依次加入I~2Pg鲑鱼精DNA，0.5~0.7倍体积预冷的异丙醇，0.1~0.2倍体积的3 mol/L的乙酸钠；轻轻来回颠倒混匀后置于一 20°C以下沉淀DNA ；
4)沉淀过夜后离心，弃上清液，用预冷的65~75%的乙醇洗涤沉淀，转移到离心管，离
心；
5)空干DNA，加入TE溶解DNA，置于一20°C以下保存。
[0010]作为优选的，步骤3)所述恒温扩增反应的体系为:25 UL LAMP反应体系含有1.6μ mol/L 35S-FIPU.6 μ mol/L 35S_BIP、0.2 μ mol/L 35S_F3、0.2 μ mol/L 35S_B3、0.8μ mol/L 35S-FLP、0.8 μ mol/L 35S_BLP、1 mol/L 甜菜碱、8 mmol/L MgS04、8 U Bst DNA聚合酶、1.6 mmol/L dNTP、2.5 μ L IOXThermo pol Buffer 及待测 DNA 模板 2 μ L。
[0011]作为优选的，步骤3)所述恒温扩增反应的程序为:60~65 °C恒温反应45~60mino
[0012]作为优选的，步骤4)可根据恒温荧光法判断检测结果，在反应体系中加入2-20μ M SYT0-9，使用荧光PCR仪(如ΑΒΙ7500)或其它恒温荧光检测仪(Genie II )进行检测，根据扩增曲线判断结果，有“s”型扩增曲线的为阳性，无“s”型扩增曲线的为阴性。
[0013]一种用于检测食用油中转基因成分CaMV35S的试剂盒，其包括6条根据CaMV35S启动子基因序列设计的特异性恒温扩增检测引物。
[0014]所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示:
35S- F3:GGTGGCTCCTACAAATGC (SEQ ID N0:1),
35S- B3:GTCTTGCGAAGGATAGTGG (SEQ ID NO:2),
35S-FIP:GTCCATCTTTGGGACCACTGTCCATCATTGCGATAAAGGAAAGG (SEQ ID NO:3),
35S-BIP: CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGATATCACATC (SEQ ID NO:4)，
35S-FLP:AGAGGCATCTTCAACGATGG (SEQ ID NO:5),
35S-BLP:AGAAGACGTTCCAACCACG (SEQ ID NO:6)。
[0015]所述试剂盒中还包括以下组分:1fei DNA聚合酶、MgSO4、甜菜碱、dNTP、10XThermopol Buffer、SYT0_9、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有CaMV35S启动子基因序列的重组质粒,所述阴性对照品为ddH20。
[0016]一种用于检测食用油中转基因成分CaMV35S的引物组，其序列分别如下所示:
【权利要求】
1.一种食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法，包括如下步骤: 1)根据CaMV35S启动子基因序列设计特异性恒温扩增检测引物； 2)提取待检样品DNA； 3)待检样品DNA在上述引物、ifeiDNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应； 4)根据扩增结果判断待检样品中是否存在CaMV35S转基因成分。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示:
35S- F3:GGTGGCTCCTACAAATGC (SEQ ID N0:1),
35S- B3:GTCTTGCGAAGGATAGTGG (SEQ ID NO:2),
35S-FIP:GTCCATCTTTGGGACCACTGTCCATCATTGCGATAAAGGAAAGG (SEQ ID NO:3),
35S-BIP: CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGATATCACATC (SEQ ID NO:4)，
35S-FLP:AGAGGCATCTTCAACGATGG (SEQ ID NO:5),
35S-BLP:AGAAGACGTTCCAACCACG (SEQ ID NO:6)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)提取待检样品DNA的具体步骤为: 1)取一定样品油，加入I~3倍体积的正己烷和0.1~0.3倍体积的TE，20~25°C环境条件下，混合均匀； 2)静置分层后，去除上层油相； 3)将下层的TE水相转移到离心管；依次加入I~2Pg鲑鱼精DNA，0.5~0.7倍体积预冷的异丙醇，0.1~0.2倍体积的3 mol/L的乙酸钠；轻轻来回颠倒混匀后置于一 20°C以下沉淀DNA ； 4)沉淀过夜后离心，弃上清液，用预冷的65~75%的乙醇洗涤沉淀，转移到离心管，离心； 5)空干DNA，加入TE溶解DNA，置于一20°C以下保存。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述恒温扩增反应的体系为:25 μ L LAMP 反应体系含有 1.6 μ mol/L 35S_FIP、1.6 μ mol/L 35S_BIP、0.2 μ mol/L35S-F3、0.2 μ mol/L 35S_B3、0.8 μ mol/L 35S_FLP、0.8 μ mol/L 35S_BLP、1 mol/L甜菜喊、8 mmol/L MgS04、8 U Bst DNA 聚合酶、1.6 mmol/L dNTP、2.5 μ L 10 X Thermo polBuffer及待测DNA模板2 μ L0
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述恒温扩增反应的程序为:60~65 °C恒温反应45~60min。
6.根据权利要求1~5任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)可根据恒温荧光法判断检测结果，在反应体系中加入2-20 μ M SYT0-9，使用荧光PCR仪(如ΑΒΙ7500)或其它恒温荧光检测仪(Genie II )进行检测，根据扩增曲线判断结果，有“s”型扩增曲线的为阳性，无“s”型扩增曲线的为阴性。
7.一种用于检测食用油中转基因成分CaMV35S的试剂盒，其包括6条根据CaMV35S启动子基因序列设计的特异性恒温扩增检测引物。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示:
35S- F3:GGTGGCTCCTACAAATGC (SEQ ID N0:1),
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括以下组分'BstDNA聚合酶、MgSO4、甜菜碱、dNTP、10 X Thermo pol Buffer、SYT0-9、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有CaMV35S启动子基因序列的重组质粒，所述阴性对照品为ddH20。
10.一种用于检测食用油中转基因成分CaMV35S的引物组，其序列分别如下所示:
【文档编号】C12Q1/68GK103614476SQ201310610888
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】石磊, 唐大运, 张璜, 刘美贤, 范耀森, 骆康杰, 叶蕾 申请人:广州迪澳生物科技有限公司