眼斑水龟微卫星标记的特异性引物及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种眼斑水龟微卫星标记的特异性引物及检测方法。以眼斑水龟基因组DNA为模板，使用本发明的微卫星标记的特异性引物PCR扩增微卫星位点序列，然后对PCR扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据检测结果对微卫星位点进行多态性分析。本发明提供的眼斑水龟微卫星标记的特异性引物及检测方法可应用于眼斑水龟的遗传多样性水平评估、种群遗传结构分析、亲缘关系鉴定等领域。
【专利说明】眼斑水龟微卫星标记的特异性引物及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子标记【技术领域】，具体涉及一种眼斑水龟微卫星标记的特异性引物及检测方法。
【背景技术】
[0002]眼斑水龟(Sacalia bealei)隶属于龟鳘目眼斑龟属，是中国特有种,主要分布于广东、广西、福建、安徽、江西、贵州、香港等地，生活在山区溪流中。眼斑水龟具有食用、药用及观赏价值，是一种重要的经济淡水龟。近年来，由于过度猎捕、贸易、栖息地破坏，野生眼斑水龟资源日益减少，为了科学保护眼斑水龟种质资源，实现资源的可持续性利用，开展该种的遗传多样性分析以及人工繁育具有重要意义。
[0003]分子标记是开展物种遗传分析和标记辅助选择的重要工具，尤其是微卫星分子标记，其广泛分布于真核生物基因组，具有多态性高，特异性好，共显性遗传，检测方便等优点，已经成为目前应用最广泛的分子标记。开发眼斑水龟微卫星标记对于其谱系地理格局、群体结构和遗传多样性的分析，以及种质资源的科学保护与利用均具有重要的应用价值。目前，尚未见眼斑水龟微卫星标记开发的相关报道。
【发明内容】
[0004]本发明的第一个目的是提供一种眼斑水龟微卫星标记的特异性引物，其特征在于，所述的微卫星标记的特异性引物如下所示:
[0005]微卫星位点tSb-SSR3 特异性引物:F:ACGCCTTCCCAGAGTGTC
[0006]R:ATGCCTATTTCCCCAGTG`
[0007]微卫星位点tSb-SSR12 特异性引物:F: TCTGGAGTCCATAGCTGC
[0008]R:CTCACATTGACGAAAGGC
[0009]微卫星位点tSb-SSR15 特异性引物:F:AGAACCCAGGATTTCGGAG
[0010]R:AGGAGCAGTTAGCAGGCGT
[0011]微卫星位点tSb-SSR19 特异性引物:F:AACACTTGCTTCCCTACCG
[0012]R:GCCCCTTCTTACTGACCG
[0013]微卫星位点tSb-SSR30 特异性引物:F: TTGAGGGITTAATGCCTTGT
[0014]R:GAATGGATTGGACCACAGG
[0015]微卫星位点tSb-SSR33 特异性引物:F: TGGGAGnTTGTCAITGTCTTC
[0016]R:TGCCGTTCTTATGTTATGTTCG
[0017]微卫星位点tSb-SSR36 特异性引物:F:1TTGACAGTATGGTGGGITT
[0018]R:GAAAGGAGTCAGATAGGTGGA
[0019]微卫星位点tSb-SSR48 特异性引物:F:AGGTCAITGGGCGGITTG
[0020]R:CCACTGTTGCTCATGTTGGTT
[0021]本发明的第二个目的是提供一种眼斑水龟微卫星标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0022](I)、提取眼斑水龟基因组DNA ；
[0023](2)、以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用所述的眼斑水龟微卫星标记的特异性引物中的每个微卫星位点的特异性引物分别进行PCR扩增；
[0024](3)、利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行多态性检测。
[0025]本发明通过构建眼斑水龟微卫星(GT) 12富集文库，筛选含有微卫星序列的阳性克隆，设计微卫星位点的特异性引物，并对这些微卫星位点进行多态性检测，开发了 8个多态性丰富的眼斑水龟微卫星位点。8个眼斑水龟微卫星位点的编号分别为:tSb-SSR3，tSb-SSR12, tSb-SSR15, tSb_SSR19，tSb_SSR30，tSb_SSR33，tSb_SSR36，tSb_SSR48 ;其核苷酸序列分别如SEQIDN0.1~8所示。
[0026]利用本发明中的眼斑水龟微卫星标记的特异性引物对33个眼斑水龟样本进行了检测，结果表明，8个微卫星位点在该群体中能够有效扩增，扩增效率达到100%，利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明，8个微卫星位点在群体中均存在丰富的多态性，且均符合哈迪-温伯格平衡。说明本发明中的8对微卫星标记的特异性引物能够用于眼斑水龟的遗传多样性水平评估、种群遗传结构分析、亲缘关系鉴定等工作。
[0027]本发明公开了一组能够高效扩增眼斑水龟群体微卫星标记的特异性引物及检测方法，且本发明的微卫星位点多态性丰富，因此，本发明提供的眼斑水龟微卫星标记的特异性引物及检测方法可应用于在眼斑水龟的遗传多样性水平评估、种群遗传结构分析、亲缘关系鉴定等领域。
【专利附图】
【附图说明】·
[0028]图1是8对微卫星位点特异性引物扩增眼斑水龟基因组DNA的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中泳道M为marker，泳道I~33为每对微卫星位点特异性引物扩增眼斑水龟基因组DNA的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条带。
【具体实施方式】
[0029]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0030]实施例1:
[0031]一、眼斑水龟基因组DNA的提取
[0032]1、试剂配制:
[0033]消化缓冲液:称取Tris0.6057g，EDTA18.612g，SDS2.5g，用灭菌超纯水定容至500mL (终浓度为 TrislOmmol/L，EDTA0.lmol/L, SDS0.5%),调节 pH 值至 8.0，室温保存备用。
[0034]2、DNA 抽提:
[0035]分别剪取33只眼斑水龟尾部肌肉组织于2mL离心管中，将组织剪碎，加800 U L消化缓冲液，10 y L蛋白酶K( 20mg/mL)，混匀后于55 °C消化8~IOh ;消化清透后，加入800 y L饱和酚，轻轻颠倒混匀20min，1000Og离心lOmin，抽提上清；再加入400 u L饱和酚，400 u L氯仿/异戍醇(24:1),轻轻颠倒混匀20min, 1000Og离心IOmin,抽提上清；再加入800 y L氯仿/异戍醇(24:1),轻轻颠倒混匀20min, 1000Og离心IOmin,抽提上清；再加入ImL预冷的无水乙醇，于-20°C冷冻2h，12000g离心15min，弃上清；再加预冷的70%乙醇，小心洗涤DNA沉淀两次，12000g离心5min，弃上清；晾干乙醇，加入50 u L超纯水溶解沉淀，置于_20°C保
存备用。
[0036]二、眼斑水龟微卫星富集文库的构建
[0037]1、基因组酶切及片段回收
[0038]取一只眼斑水龟样本的基因组DNA300ng，使用内切酶MboI于37°C进行酶切，2h后进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切效果，回收400~1000bp的DNA片段。
[0039]2、接头制备和连接
[0040]将接头弓丨物SAU-LA (5 ’ -GCGGTACCCGGGAAGCTTGG-3 ’)和 SAU-LB (5 ’ -P04_GATCCCAAGCTTCCCGGGTACCGC-3’ )溶解为浓度100 u M，各取10 u L，混匀后于95°C加热3min，自然冷却至室温，得到双链接头。将步骤I中回收的DNA片段与双链接头混合，用T4连接酶(购自大连TaKaRa公司，货号:D2011A)于16°C过夜连接，得到连接产物。以连接产物为模板，SAU-LA为引物进行PCR扩增，使用PCR产物纯化试剂盒(购自生工生物工程(上海)有限公司，货号:SK8141)进行纯化。
[0041]3、探针杂交和磁珠富集
[0042]先用生物素标记的(GT)12探针与步骤2得到的纯化的PCR产物进行杂交，95°C水浴15min，立即取出，冰浴3m in，65°C水浴2h，得到杂交产物。然后将杂交产物加入磁珠悬液(购自Promega公司，货号:Z5481),室温下轻轻混匀,慢摇30min,于磁力架上吸去溶液。用2X SSC溶液(0.3mol/L的氯化钠，0.03mol/L的柠檬酸钠，1%SDS)洗涤非特异性吸附的DNA片段后，加超纯水于95°C洗脱lOmin，于磁力架上迅速吸取上清液。
[0043]4、克隆制备和筛选
[0044]以步骤3得到的上清液为模板，SAU-LA为弓丨物进行PCR扩增。扩增产物用PCR产物纯化试剂盒回收，连接到PMD18-T载体(购自大连TaKaRa公司，货号D109A)，转化至DH5 a感受态细胞(购自大连TaKaRa公司，货号D109A)。将转化产物涂布于含X_gal和IPTG的LBAmp+平板上，倒置于37°C培养箱中过夜培养。
[0045]挑取白色菌斑，接种到500 ii L含Amp+的LB液体培养基中，于37 °C摇床过夜培养。然后以菌液为模板，利用PMD18-T载体引物M13-47和RV-M分别为上下游引物进行PCR扩增，检测阳性克隆。
[0046]三、微卫星序列测定、分析和特异性引物设计
[0047]用PMD18-T载体引物M13-47作为测序引物，将片段大小在300~800bp之间的阳性克隆进行测序。所得序列经校对后用TRF软件寻找微卫星重复，选取核心重复两侧序列均>50bp,且重复次数〈100次的微卫星序列作为备选位点,用Primer Primere5.0软件设计微卫星引物。引物退火温度控制在50°C以上，PCR产物长度控制在150~500bp之间。
[0048]8 个微卫星位点 tSb-SSR3, tSb_SSR12， tSb_SSR15， tSb_SSR19， tSb_SSR30，tSb-SSR33，tSb-SSR36，tSb_SSR48的引物序列、核心重复、退火温度如表1所示。
[0049]表1.8个微卫星位点特异性引物序列、核心重复及退火温度
[0050]
【权利要求】
1.一种眼斑水龟微卫星标记的特异性引物，其特征在于，所述的微卫星标记的特异性引物如下所示: 微卫星位点tSb-SSR3特异性引物:F:ACGCCTTCCCAGAGTGTC R:ATGCCTATTTCCCCAGTG 微卫星位点tSb-SSR12特异性引物:F:TCTGGAGTCCATAGCTGC R:CTCACATTGACGAAAGGC 微卫星位点 tSb-SSR15 特异性引物:F:AGAACCCAGGAITTCGGAG R:AGGAGCAGTTAGCAGGCGT 微卫星位点 tSb-SSR19 特异性引物:F:AACACTTGCTTCCCTACCG R:GCCCCTTCTTACTGACCG 微卫星位点 tSb-SSR30 特异性引物:F:TTGAGGGITTAATGCCTTGT R:GAATGGATTGGACCACAGG 微卫星位点 tSb-SSR33 特异性引物:F:TGGGAGnTTGTCAITGTCTTC R:TGCCGTTCTTATGTTATGTTCG 微卫星位点 tSb-SSR36 特异性引物:F:1rTGACAGTATGGTGGGITT R:GAAAGGAGTCAGATAGGTGGA 微卫星位点tSb-SSR48特异性引物:F:AGGTCAirGGGCGGITTG R:CCACTGTTGCTCATGTTGGTT`
2.一种眼斑水龟微卫星标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)、提取眼斑水龟基因组DNA； (2)、以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用所述的眼斑水龟微卫星标记的特异性引物中的每个微卫星位点的特异性引物分别进行PCR扩增； (3)、利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行多态性检测。
3.根据权利要求2所述的眼斑水龟微卫星标记的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增体系为:10 XBuffer2.5 u L, 25mmol/L Mg2+L 5 u L, IOmmoI/L dNTPs0.5 u L, IOumol/L Forward Primer0.5 u L,10 u mol/LReverse Primer0.5 u L,5U/u L Taq Enzyme0.1u L,50ng/ u LDNA0.5 u L, ddH2018.9 u L,共计 25 u L。
4.根据权利要求2所述的眼斑水龟微卫星标记的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增程序为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，退火30s，72。。延伸30s，30个循环；72°C延伸5min ;16°C保存；眼斑水龟微卫星标记的特异性引物的退火温度分别为:微卫星位点tSb-SSR3:55°C，微卫星位点tSb-SSR12:55°C，微卫星位点tSb_SSR15:57°C，微卫星位点tSb-SSR19:57°C，微卫星位点tSb-SSR30:53°C，微卫星位点tSb_SSR33:56°C，微卫星位点tSb-SSR36:53°C，微卫星位点 tSb_SSR48:57°C。
5.根据权利要求2所述的眼斑水龟微卫星标记的检测方法，其特征在于，所述的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳使用10%的凝胶浓度。
【文档编号】C12Q1/68GK103627807SQ201310661469
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】龚世平, 李伟业, 滑留帅 申请人:广东省昆虫研究所