一种高产恩拉霉素菌株及其筛选方法
【专利摘要】本发明属于工业生物技术、微生物菌种筛选【技术领域】，具体涉及一种高产恩拉霉素菌株及其筛选方法。本发明筛选出一株恩拉霉素高产菌株，其分类名为杀真菌链霉菌（Streptomyces?fungicidicus）DCS069，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会（CGMCC），保藏编号为CGMCC?No.6216，保藏日期是2012年6月14日。本发明公开的筛选方法包括如下步骤：(a)试管斜面培养；(b)菌丝培养；(c)原生质体制备；(d)原生质体微波处理；(e)原生质体再生培养；(f)菌株初筛；(g)菌株复试。本发明的有益效果是：本发明提供的筛选方法简单高效，适合于工业生产。
【专利说明】一种高产恩拉霉素菌株及其筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及工业生物技术、微生物菌种筛选【技术领域】，尤其是一种高产恩拉霉素菌株及其筛选方法。
【背景技术】
[0002]恩拉霉素(Enramycin)，又名安来霉素、恩来霉素、恩霉素、持久霉素，是由放线菌Streptomyces fungicidious发酵产生的一种由不饱和脂肪酸和十几种氨基酸组成的环状多肽类抗生素。最早由日本武田药品工业株式会社研发，1974年在日本正式注册。1993年，我国农业部批准该药在我国注册。2009年，其在中国的销售额达到2亿元人民币。
[0003]恩拉霉素作为一种新型肽类抗生素，其抗菌作用机理是抑制细菌细胞壁的合成。由于只需要添加微量恩拉霉素就可以呈现出优良的促生长和改善饲料利用率的作用，并且具有稳定性、低毒性、长期使用后不易产生耐药性等特点，因此被世界上很多国家推荐作为动物促生长剂，是一种较好的饲料添加剂。因此，对恩拉霉素高产菌株的选育和研究具有很好的经济效益和社会效益。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种高产恩拉霉素菌株及其筛选方法。
[0005]为了完成上述目的，本发明采用的技术方案是:
[0006]—种高产恩拉霉素的菌株，分类名称为杀真菌链霉菌(Streptomycesfungicidicus) DCS069,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC N0.6216，保藏日期是2012年6月14日。
[0007]该菌株单菌落为白色，边缘整齐，孢子丰满。
[0008]一种筛选高产恩拉霉素菌株的方法，包括以下步骤:
[0009]A、试管斜面培养:砂土管保藏的出发株转接试管斜面，温度28.0±0.5°C，湿度40%-60%恒温室培养5-8天；
[0010]B、菌丝培养:将成熟的斜面接种于DC-S菌丝培养基中，28.0 ±0.5 °C，220rpm,培养40-50h，然后转接于含有0.2-1.0%甘氨酸的DC-S菌丝培养基中，28.0±0.5°C，220rpm，培养 35-45h ；
[0011]C、原生质体制备:将制备得到的菌丝体在3000rpm离心IOmin,弃上清，收集菌丝体；用高渗缓冲液洗涤2次，加入终浓度为l_2mg/mL的溶菌酶，混合均匀，30°C保温30-120min，过程中不断振荡混匀；然后用含有棉花的枪头过滤酶解液，除去残留菌丝体，收集滤液；在1000rpm转速下离心5min,温和的沉淀原生质体；再用高渗缓冲液洗漆原生质体一次，以洗净酶液；弃去上清液，然后用适量高渗缓冲液重新悬浮原生质体；
[0012]D、原生质体微波处理:将制备好的原生质体悬液，转移至灭菌的培养皿中，置于微波炉内进行微波处理；[0013]E、原生质体再生培养:经微波处理的原生质体进行稀释、分离，稀释度为10_4_10_7个/mL，稀释液平铺在R2YE再生培养基上，于28.0±0.5°C，40%_60%湿度条件下培养5_8天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养；
[0014]F、菌株初筛:在再生培养基上挑取单菌落接种到斜面培养基上，于28.0±0.5°C,40%-60%湿度条件下培养5-8天；斜面成熟后接种到种子培养基中，于28.0±0.5°C,220rpm震荡培养26-30h ;种液成熟后接种到发酵培养基中，相同条件下震荡培养9-12天，生长到周期后检测效价，选效价高的菌株进行砂土保藏；
[0015]G、菌株复试:取初筛保藏的菌株转接试管斜面，于28.0±0.5°C，40%_60%湿度条件下培养5-8天，斜面成熟转接至种子培养基中，于28.0 ±0.5°C，220rpm震荡培养26_30h，种液成熟后转接至发酵培养基中，于相同条件下震荡培养9-12天，取样检测效价，筛选保留效价高的菌株为杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus) DCS069。
[0016]所述的步骤B中所用的DC-S菌丝培养基中成分及其含量为:0.5%葡萄糖，0.8%麦芽糖粉，0.4%蛋白胨，0.4%酵母粉，0.05%MgS04.7Η20，0.2%ΚΗ2Ρ04,0.4%Κ2ΗΡ04,0.3%氯化钠。
[0017]所述的步骤D中微波处理条件为:调整微波炉功率为700W，脉冲频率为2450Hz，对原生质体悬液进行辐照处理10s，取出冰上放置20s，反复进行以上步骤，至累计微波处理时间 60-120s。
[0018]本发明的有益效果是:该菌株摇瓶发酵9天时，检测效价为8997U/mL，较出发株(相同条件下效价为6721U/mL)提高了 33.86%，筛选方法简单高效，适合于工业生产。
【专利附图】
【附图说明】`
[0019]图1是本发明的筛选方法流程图。
[0020]图2是本发明中原生质体镜检图。
[0021]图3是本发明中菌株DCS069试管斜面形态图。
【具体实施方式】
[0022]本发明为一种高产恩拉霉素菌株及其筛选方法，该菌株摇瓶发酵9天时，检测效价为8997U/mL，较出发株(相同条件下效价为6721U/mL)提高了 33.86%，筛选方法简单高效，适合于工业生产。
[0023]下面结合附图对本发明做进一步说明。
[0024]具体实施例，一种高产恩拉霉素的菌株，该菌株单菌落为白色，边缘整齐，孢子丰满，分类名称为杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus)DCS069,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC N0.6216，保藏日期是2012年6月14日。
[0025]如图1所示，一种筛选高产恩拉霉素菌株的方法，包括以下步骤:
[0026]A、试管斜面培养:培养基成分及其含量为:0.8%麦芽糖粉，0.08%干酵母粉，0.08%金枪鱼膏，0.1%胰蛋白胨，0.3%氯化钠，2%琼脂。配制的溶液用30%氢氧化钠溶液调节pH至6.7±0.I,按15mL/管分装至30mmX200mm的试管中，同时加入2%琼脂,然后依次加棉塞、两层纱布，两层牛皮纸将其包好，在0.11±0.05MPa、121 土 1°C条件下维持20min ;灭菌完毕后立即将培养基摇匀，降温至手感不烫时，铺成斜面，备用；[0027]以公司保藏菌株杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus) DCS056为出发株接斜面:取出DCS056砂土管，无菌条件下用接种针蘸取少量砂土孢子接种于试管斜面，于28.0±0.5°C，40%-60%湿度条件下培养7天。
[0028]B、菌丝培养:培养基成分及其含量为:0.5%葡萄糖，0.8%麦芽糖粉，0.4%蛋白胨，0.4% 酵母粉，0.05%MgS04.7Η20，0.2%ΚΗ2Ρ04,0.4%Κ2ΗΡ04,0.3% 氯化钠；配好后按 40mL/250mL的三角瓶装量分装至三角瓶中，然后依次加棉塞、两层纱布，两层牛皮纸将其包好，在0.11 ±0.05MPa、121±l°C条件下维持 20min。
[0029]将步骤A中培养成熟的试管斜面接种于DC-S菌丝培养基中，28.0±0.5°C，220rpm,培养48h，然后以6%接种量转接于含有0.4%甘氨酸的DC-S菌丝培养基中，28.0 ± 0.5 °C，220rpm,培养 45h。
[0030]C、原生质体制备:将制备得到的菌丝体在3000rpm离心IOmin,弃上清，收集菌丝体；用高渗缓冲液洗涤2次，加入终浓度为l_2mg/mL的溶菌酶，混合均匀，30°C保温30-120min，过程中不断振荡混匀；然后用含有棉花的枪头过滤酶解液，除去残留菌丝体，收集滤液；在1000rpm转速下离心5min,温和的沉淀原生质体；再用高渗缓冲液洗漆原生质体一次，以洗净酶液；弃去上清液，然后用适量高渗缓冲液重新悬浮原生质体。
[0031]D、原生质体微波处理:将制备好的原生质体悬液,转移至灭菌的培养皿中，至于功率700W，脉冲频率2450Hz的微波炉内辐照处理10s，然后取出冰上放置20s，反复进行以上步骤，至累计微波处理时间70s ;因为微波辐照可抑制或刺激蛋白质、DNA和RNA的合成以及细胞生长，也可扰乱DNA-蛋白质相互作用，造成DNA分子的氢键和碱基堆积化学力受损或者减弱，使DNA立体结构发生变化，并干扰修复机制甚而诱发染色体畸变和基因突变；而脱壁后的原生质体能敏感地接受外界环境因子(光、热、机械损伤、其他射线等)刺激，对染色体和质粒DNA都有一定 的诱导效应，从而引起细胞内一系列化学反应，造成菌株遗传性的改变，例如一些酶基因的表达、扩增或抑制，使产抗生素能力提高；原生质体形成和再生也是一个筛选过程，只有代谢旺盛的细胞才能生存和再生并形成菌落，通过筛选获得了生物特性好，产量高的突变菌株；另外，原生质体的形成与再生使孢子形成受到影响，而孢子的形成往往与抗生素产生有关。
[0032]E、原生质体再生培养:经微波处理的原生质体用P buffer进行稀释分离，使稀释度为10-4-10-7个/mL，取0.2mL均匀平铺在R2YE再生培养基上，于28.0±0.5°C，40%_60%湿度条件下培养5-8天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养；所用的R2YE培养基、高渗缓冲液(P buffer)参照文献“应用原生质体技术改良秦岭链霉菌的研究(卞小莹。西北农林科技大学，2007)”。
[0033]F、菌株初筛:Fp F2试管斜面配制同步骤A，种子培养基配制:种子培养基成分及其含量为，3.5%玉米粉，0.5%玉米蛋白粉，0.5%棉籽饼粉，2%轻质碳酸钙，0.25%硫酸铵，0.036%硫酸亚铁，0.125%磷酸二氢钾，2.8%玉米浆；按比例称好各种原材料(除玉米浆外)，于总体积30%的饮用水中搅拌均匀，倒入总体积50%的沸水中进行糊化；降温至室温时加入玉米浆，定容；用30%氢氧化钠溶液调节pH至6.7 ±0.1，边充分搅拌边量取50mL分装至500mL三角瓶中，用6 g棉塞、两层纱布和一层牛皮纸封口 ；在0.ll±0.05MPal21±l°C条件下维持30min。
[0034]发酵培养基配制:发酵培养基成分及其含量为，12%玉米粉，4%玉米蛋白粉，0.5%轻质碳酸钙，0.5%氯化钠，0.3%硫酸铵，0.007%硫酸亚铁，0.017%磷酸二氢钾，0.3%尿素，
0.01%氯化锌，0.15%氢氧化钾，0.1%玉米浆，0.3%L-乳酸和0.07%耐高温α -淀粉酶；按比例称好各种原材料(玉米浆、乳酸、淀粉酶除外)，于总体积40%的饮用水中搅拌均匀，倒入总体积50%的沸水中进行糊化，然后加入淀粉酶进行液化，降温至室温时加入玉米浆和乳酸，定容；用氢氧化钠溶液调节PH至5.9±0.1 (一般自然pH即可);边充分搅拌边量取50mL分装至500mL三角瓶中，用八层纱布、一层牛皮纸包装；在0.11±0.05MPal21 ± 1°C条件下维持 30min。
[0035]取步骤E中成熟的单菌落(形态饱满、边缘整齐)接种至Fl斜面培养基中，于28.0±0.5°C，40%-60%湿度条件下培养7天，成熟后用接种铲挖取约0.5cm2 X 0.5cm2的F1斜面菌层，接种到种瓶培养基中，于28.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养26_30h，同时F1斜面保存于4°C冰箱中；种子成熟后按4%接种量接种到发酵培养基中，于28.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养9天；一般在发酵第3天时将F1斜面传代F2斜面，培养条件同F1斜面；发酵到周期检测效价，得到本发明菌株DCS069 (见图2)，效价为9507U/mL。
[0036]上述菌株进行砂土保藏:向F2试管斜面加入2mL无菌水，用接种针将孢子刮下，摇匀df0.2mL孢子液转移至空白砂土管中，注明菌号、制备日期和有效期，在-750~-760mmHg柱下抽干4-6h ;干燥的砂土管置于装有变色硅胶的干燥器中，5±3°C保存。
[0037]在再生培养基上挑取单菌落接种到F1斜面培养基上，于28.0±0.5°C，40%_60%湿度条件下培养5-8天；斜面成熟后用接种铲挖取约0.5cm2 X 0.5cm2的F1斜面菌层接种到种子培养基中，于28.0±0.5°C,220rpm震荡培养26_30h，种瓶使用500mL三角瓶，培养基装量为50mL，使用6g棉塞包两层纱布；种液成熟后接种到发酵培养基中，相同条件下震荡培养9-12天，发酵过程使用500mL三角瓶，培养基装量为50mL，接种量为4%，用6g棉塞包两层纱布封口 ；生长到周期后检测效价，选效价高的菌株进行砂土保藏。
[0038]G、菌株复试:取保藏菌株的砂土管孢子转接至试管斜面，于28.0±0.5°C，40%-60%湿度条件下培养7天，斜`面成熟后用接种铲挖取约0.5cm2 X 0.5cm2菌层接种至种子培养基中，于28.0±0.5°C，220rpm条件下震荡培养26-30h，种瓶采用500mL三角瓶，培养基装量为50mL，用6g棉塞、两层纱布封口 ；种子成熟后转接至发酵培养基中，28.0±0.5°C,220rpm震荡培养9天，发酵瓶采用500mL三角瓶，培养基装量为50mL，接种量为4%，用6g棉塞、两层纱布封口，发酵到周期后检测效价，结果为8925、9028、9039U/mL，平均8997U/mL，较出发株DCS056(相同条件下效价为6774、6714、6676U/mL,平均6721U/mL)提高了 33.86%。
[0039]由此可见，本发明筛选菌株DCS069远远高于现有生产菌株。
【权利要求】
1.一种高产恩拉霉素的菌株,其特征在于:分类名称为杀真菌链霉菌(Streptomycesfungicidicus) DCS069,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏编号为CGMCCN0.6216，保藏H期是2012年6月14日。
2.根据权利要求1所述的一种高产恩拉霉素的菌株，其特征在于:该菌株单菌落为白色，边缘整齐，孢子丰满。
3.一种筛选高产恩拉霉素菌株的方法，包括以下步骤: A、试管斜面培养:砂土管保藏的出发株转接试管斜面，温度28.0±0.5 °C，湿度40%-60%恒温室培养5 -8天； B、菌丝培养:将成熟的斜面接种于DC-S菌丝培养基中，28.0±0.5°C，220rpm，培养40-50h，然后转接于含有0.2-1.0%甘氨酸的DC-S菌丝培养基中，28.0±0.5°C，220rpm，培养 35-45h ； C、原生质体制备:将制备得到的菌丝体在3000rpm离心IOmin,弃上清,收集菌丝体；用高渗缓冲液洗涤2次，加入终浓度为l_2mg/mL的溶菌酶，混合均匀，30°C保温30_120min，过程中不断振荡混匀；然后用含有棉花的枪头过滤酶解液，除去残留菌丝体，收集滤液；在1000rpm转速下离心5min，温和的沉淀原生质体；再用高渗缓冲液洗涤原生质体一次，以洗净酶液；弃去上清液，然后用适量高渗缓冲液重新悬浮原生质体； D、原生质体微波处理:将制备好的原生质体悬液，转移至灭菌的培养皿中，置于微波炉内进行微波处理； E、原生质体再生培养:经微波处理的原生质体进行稀释、分离，稀释度为10_4-10_7个/mL,稀释液平铺在R2YE再生培养基上，于28.0±0.5°C，40%-60%湿度条件下培养5_8天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养； F、菌株初筛:在再生培养基上挑取单菌落接种到斜面培养基上，于28.0±0.5°C，40%-60%湿度条件下培养5-8天；斜面成熟后接种到种子培养基中，于28.0±0.5°C,220rpm震荡培养26-30h ;种液成熟后接种到发酵培养基中，相同条件下震荡培养9-12天，生长到周期后检测效价，选效价高的菌株进行砂土保藏； G、菌株复试:取初筛保藏的菌株转接试管斜面，于28.0±0.5°C，40%-60%湿度条件下培养5-8天，斜面成熟转接至种子培养基中，于28.0±0.5°C，220rpm震荡培养26_30h，种液成熟后转接至发酵培养基中，于相同条件下震荡培养9-12天，取样检测效价，筛选保留效价高的菌株为杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus) DCS069。
4.根据权利要求3所述的一种筛选高产恩拉霉素菌株的方法，其特征在于:所述的步骤B中所用的DC-S菌丝培养基中成分及其含量为:0.5%葡萄糖，0.8%麦芽糖粉，0.4%蛋白胨，0.4% 酵母粉，0.05%MgS04.7H20,0.2%KH2P04,0.4%K2HP04,0.3% 氯化钠。
5.根据权利要求3所述的一种筛选高产恩拉霉素菌株的方法，其特征在于:所述的步骤D中微波处理条件为:调整微波炉功率为700W，脉冲频率为2450Hz，对原生质体悬液进行辐照处理10s，取出冰上放置20s，反复进行以上步骤，至累计微波处理时间60-120S。
【文档编号】C12R1/465GK103740612SQ201310705246
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】王雪峰, 闫彩洁 申请人:河北圣雪大成制药有限责任公司