K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明属于生物技术及临床分子诊断领域，尤其涉及一种人类K-ras基因8种突变检测试剂盒及检测方法。本发明将MGB探针技术和错配ARMS技术相结合，在等位基因位点设计与DNA正链互补的MGB探针和与DNA负链互补的ARMS下游引物，并且在ARMS下游引物中引入一个错配位点，此外MGB探针与ARMS引物重叠不超过5bp，使用多重荧光PCR分4个反应管对人类K-ras基因8种突变进行分型检测。本发明方法具有特异性强、敏感性高、操作简单快速、分型准确、结果易判读等优势，可用于临床上K-ras基因突变的检测，协助医生筛选抗EGFR治疗有效的人群。
【专利说明】K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术及临床分子诊断领域，尤其涉及一种人类κ-ras基因8种突变检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]K-ras基因是RAS基因家族中的一种，定位在人类的12号染色体上，是一种原癌基因，对人类癌症影响很大。K-ras基因编码分子量为21kD的ras蛋白又名p21蛋白，p21蛋白位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参与细胞内的信号传导，结合GTP时为活化态，结合GDP时为失活态。K-ras基因在机体内好像分子开关，它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用，正常的K-ras基因可抑制肿瘤细胞生长，但发生异常时会诱导基因永久活化，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。K-ras基因被激活的方式有3种:基因点突变、基因大量表达、基因插入及转位。其中点突变最常见，多发生在2号外显子的12号密码子和13号密码子上，密码子61、63、117、119和146较少见。
[0003]K-ras基因是目前确认的肿瘤靶向治疗药物的重要基因标记物之一，K_ras基因突变是预测EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKl)和表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体(帕尼单抗和西妥昔单抗)靶向治疗抵抗的重要因素之一。在EGFR信号通路中，K-ras及其下游区小分子G蛋白是该信号通路的基本组成部分之一。K-ras基因突变后可以使该通路异常活化，不受EGFR上游信号指令的影响。此时，EGFR单抗与细胞膜表 面EGFR结合，虽阻滞了信号通路的下传，但K-ras基因突变后可发生自身磷酸化，抗拒EGFR单抗的作用，从而对EGFR单抗药物治疗无效。因此，运用EGFR靶向药物治疗之前必须要进行K_ras基因突变检测，根据患者的基因突变状态选择合适的药物，提高治疗的针对性，最大程度的延长患者的生存期。
[0004]目前，有关K-ras基因突变的检测在结直肠癌和肺癌治疗中已经得到临床认可和使用。最早2008年6月在美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上发布了临床研究结果，即K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用；而K-ras野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。同年10月，K-ras基因突变检测被写入最新版(2008年第3版)《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》。该指南明确指出所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态，并且只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如西妥昔单抗和帕尼单抗)治疗。另外，《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出:当K-ras基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯(厄洛替尼)进行分子靶向治疗，K-ras基因突变与非小细胞肺癌(NSCLC)对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关。因此肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行K-ras基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施，以提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。
[0005]目前常用的K-ras点突变检测的方法有DNA直接测序法、单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性分析法(PCR-PFLP)、高分辨溶解曲线(HRM)、基因芯片、液相芯片法、荧光定量PCR法等。测序法是公认的基因突变检测的金标准，能够准确地显示可能存在的具体突变类型，但测序法所用的设备成本高、检测时间稍长、操作繁琐、灵敏度较低，而且结果判读较复杂，对操作者要求较高，难以形成商业化的诊断产品。单链构象多态性分析与限制性片段长度多态性分析步骤繁多、灵敏度低，而且检测结果经常需要测序法确认，也不是适用于临床检测的简便有效的方法。高分辨溶解曲线是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。但是该方法难于筛查纯合突变，并且假阳性假阴性较高，PCR条件苛刻，不能分型，而且检测结果需要测序法确认。基因芯片和液相芯片虽能准确区分具体的突变类型，但是其对设备要求高，难以大规模推广，多用于科研单位。 [0006]荧光定量PCR法是分子诊断领域应用最广泛的一种检测手段，该方法灵敏度高、操作简便，适合大规模的临床应用。常用的荧光探针类型有Taqman探针、MGB探针、Allglo探针等，其中Taqman探针应用最广。Taqman探针是在探针寡核苷酸的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5’端_3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，通过监测荧光信号的变化体现PCR产物量的变化。MGB探针工作原理与Taqman探针类似,但是MGB探针的3’端淬灭突光基团为不发光的MGB (minor groovebinder)。MGB探针与Taqman探针相比有如下优点:(I)提高信噪比:无背景荧光，有更好的淬灭效果；(2)提高探针的Tm值:探针更短(13-20bp)，适应于更多重的PCR。因此MGB探针具有区分单碱基突变的能力，比Taqman探针更适用于检测碱基突变。Allglo探针是另外一种可以提高探针Tm值、缩短探针序列的探针类型，其探针上标记的荧光染料在oligo上面互相互为报告及粹灭基团，是美国AlleLogic Biosciences公司推出的新一代荧光定量探针，但是Allglo探针在国内的合成厂家十分有限，大规模应用时难以保证原材料来源的广泛性。
[0007]突变扩增阻滞系统(amplificationrefractory mutation system,ARMS)也叫等位基因特异性PCR，该法是在PCR基础上发展而成的，是一种直接用于点突变分析的PCR技术。由于PCR过程中引物延伸是3’端开始的，所以3’末端的碱基对引物的延伸来说处于至关重要的位置。根据这个原理，将突变与正常等位基因所不同的那个碱基安排在引物3’最末端，当反应进行时，如果引物3’末端碱基与模板DNA序列匹配则可以扩增，如果不匹配，则链延伸反应就会因3’，5’ -磷酸二酯键形成障碍而受阻，从而达到区分检测等位基因的目的。目前，国内的厦门艾德生物医药科技有限公司就是在ARMS技术的基础上开发了自主知识产权的ADx-ARMS专利技术，并成功研制了相应的试剂盒进行K-ras基因突变检测，但是该公司试剂盒价格昂贵，而且检测7种突变需要分7管检测，需要较多量的肿瘤样本。
[0008]因此，有必要提供一种改进的方法对K-ras基因突变进行快速、准确、经济有效的检测。
[0009]
【发明内容】
[0010]虽然ARMS技术在肿瘤个体化分子检测领域已有广泛应用，但是在实施过程中如果仅凭引物3’末端一个碱基的不同来识别等位基因有很大的非特异性，容易产生假阳性结果，而且用通用探针检测ARMS引物时特异性不强，也提高了产生假阳性的机率。因此本试剂盒在此基础上做了改进:(1)引物与探针均设计在等位基因位点，但保证型特异性探针与型特异性引物的重叠不超过5 bp ; (3)型特异性探针使用MGB探针，可以缩短探针长度，提高检测特异性，MGB探针与等位基因位点处DNA正链互补；(3) PCR扩增时上游引物使用通用引物，下游引物使用ARMS引物，ARMS下游引物与等位基因位点处DNA负链互补，且在ARMS引物3’末端倒数第2或第3的位置人为引入一个错配碱基提高检测的特异性；(4)使用多重荧光PCR技术，分4个反应管对人类K-ras基因8种突变进行分型检测。每个PCR反应管在检测野生型基因对照的同时，还可以检测两种突变型基因，减少了反应管数。经改进后的检测方法能够快速、准确地对K-ras基因突变进行分型检测，特异性好，灵敏度高，结果判读方便，而且经济实惠，可以在临床应用上大规模推广。
[0011]本发明提供的试剂盒包括:PCR混合反应液、等位基因特异性MGB探针、通用上游引物、ARMS下游引物、野生型内标探针及野生型下游引物，以及阳性对照品。本发明所述的PCR混合反应液中包括PCR Buffer、UNG酶、Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs。
[0012]本发明提供的试剂盒可以在4管内完成K-ras基因8种突变分型检测，在保证精确分型的基础上减少反应管数，节约样本。反应管A检测密码子12 GGT > GAT与12 GGT >AGT置换突变；反应管B检测密码子12GGT > GTT与12 GGT > GCT置换突变；反应管C检测密码子12 GGT > TGT与12 GGT > CGT置换突变；反应管D检测密码子13 GGC > GAC与13 GGC > CGC置换突变。
[0013]本发明提供的试剂盒运用等位基因特异性探针和等位基因特异性引物扩增的技术设计特异性MGB探针、通用上游引物和ARMS下游引物，所述特异性MGB探针优选在5’端连接有荧光发光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。所述的荧光发光基团为FAM或VIC，所述的荧光淬灭基团为MGB。具体地，所述的特异性MGB探针序列如SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8 所示；所述通用上游引物的序列如SEQ `ID N0:9所示；所述ARMS下游引物序列如SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17所示。具体序列如下:
SEQ ID NO:1:5，-FAM-AGTTGGAGCTGATG-BHQ -3，(检测 12 GGT > GAT 置换突变)
SEQ ID NO:2:5’ -VIC-TAGTTGGAGCTAGT-BHQ -3’(检测 12 GGT > AGT 置换突变)
SEQ ID N0:3:5，-FAM-TTGGAGCTGTTGG-BHQ -3，(检测 12 GGT > GTT 置换突变)
SEQ ID NO:4:5，-VIC-AGTTGGAGCTGCTG-BHQ -3，(检测 12 GGT > GCT 置换突变)
SEQ ID N0:5:5，-FAM-AGTTGGAGCTTGTG-BHQ -3，(检测 12 GGT > TGT 置换突变)
SEQ ID NO:6:5，-VIC-AGTTGGAGCTCGTG-BHQ -3，(检测 12 GGT > CGT 置换突变)
SEQ ID N0:7:5，-FAM-TTGGAGCTGGTGAC-BHQ -3，(检测 13 GGC > GAC 置换突变)
SEQ ID NO:8:5，-VIC-TGGAGCTGGTCGC-BHQ -3，(检测 13 GGC > CGC 置换突变)
SEQ ID N0:9:5’ - TTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGA -3’
SEQ ID NO: 10:5，-GCACTCTTGCCTACGCTAT-3’(检测 12 GGT > GAT 置换突变)
SEQ ID NO: 11:5，-CACTCTTGCCTACGCCTCT-3’(检测 12 GGT > AGT 置换突变)
SEQ ID NO: 12:5，-GCACTCTTGCCTACGCGAA-3’(检测 12 GGT > GTT 置换突变)
SEQ ID NO: 13:5，-CACTCTTGCCTACGCCAG-3’(检测 12 GGT > GCT 置换突变)SEQ ID NO: 14:5，-CACTCTTGCCTACGCCGCA-3’(检测 12 GGT > TGT 置换突变)
SEQ ID NO: 15:5，-GCACTCTTGCCTACGCCACG-3’(检测 12 GGT > CGT 置换突变)
SEQ ID NO: 16:5，-AAGGCACTCTTGCCTACCT-3’(检测 13 GGC > GAC 置换突变)
SEQ ID NO: 17:5，-CAAGGCACTCTTGCCTACTCG-3’(检测 13 GGC > CGC 置换突变)本发明提供的试剂盒还包括野生型内标探针及野生型下游引物作为内对照。所述野生型内标探针为MGB探针，优选在5’端连接有荧光发光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。所述的荧光发光基团为NED，所述的荧光淬灭基团为MGB。所述野生型内标探针及野生型下游引物序列如SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19所示。
[0014]SEQ ID NO:18:5， -NED-TTGGAGCTGGTGGC-BHQ-3’
SEQ ID NO:19:5， - GCACTCTTGCCTACGCCAC -3，
当所述MGB探针包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照品是存在密码子12 GGT > GAT和12 GGT > AGT置换突变的混合质粒DNA。
[0015]当所述MGB探针包括如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照品是存在密码子12 GGT > GTT和12 GGT > GCT置换突变的混合质粒DNA。
[0016]当所述MGB探针包括如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照品是存在密码子12 GGT > TGT和12 GGT > CGT置换突变的混合质粒DNA。
[0017]当所述MGB探针包括如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照品是存在密码子13 GGC > GAC和13 GGC > CGC置换突变的混合质粒DNA。
[0018]本发明的第二个目的是提供一种K-ras基因突变荧光分型检测的方法。该方法具体是先针对K-ras基因突变处的等位基因位点设计与DNA正链互补的特异性MGB探针，然后在等位基因位点设计与DNA负链互补的ARMS下游引物，并且保证探针与引物重叠不超过5bp，随后再设计通用上游引物及内参引物与探针。反应体系中加入PCR混合反应液、等位基因特异性MGB探针、通用上游引物、ARMS下游引物、野生型内标探针及野生型下游引物进行荧光定量PCR的检测。
[0019]所述等位基因特异性MGB探针包括如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8 序列所示的一种或多种；
所述通用上游引物的序列如SEQ ID N0:9所示；
所述 ARMS 下游引物的序列包括 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ IDNO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17 序列所示的一种或多种；
所述野生型内标探针及野生型下游引物的序列如SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19所示。
[0020]本发明提供了一种K-ras基因突变荧光分型检测的方法，其优点是采用等位基因特异性探针和引物对不同型别的等位基因进行扩增检测。本发明方法中采用的荧光标记探针是等位基因特异性MGB探针，缩短了探针序列，提高了检测特异性。另外与通常所用的ARMS上游引物不同，本发明中将错配ARMS引物设计在下游，即在等位基因位点均设计探针与引物，其中MGB探针与等位基因位点处DNA正链互补，ARMS引物与等位基因位点处DNA负链互补，且保证探针与引物重叠不超过5bp即可。本发明的检测试剂盒及检测方法具有以下优点:(I)采用特异性探针与特异性引物相结合的检测技术，灵敏度高，特异性好，能有效阻止非特异性扩增，准确检测K-ras基因的8种突变；(2)采用多重荧光PCR检测技术，减少反应管数目，节约样本，经济实惠；(3)全程闭管操作，并且加入内标系统和UNG酶防污染系统，能更加准确、有效地进行分型检测，确保结果真实可信；(4)操作简单快速，检测过程只需90min即可完成，并且结果判读简单，便于分析；(5)适用于临床K_ras基因突变检测的应用，为患者个体化用药提供科学依据，降低治疗风险及患者负担。
【具体实施方式】
[0021]为使本发明更加容易理解，下面以结直肠癌石蜡切片DNA中K-ras基因突变检测为例说明该试剂盒的【具体实施方式】。
[0022]实施例1:基因组DNA的提取
收集临床病理诊断为结直肠癌(CRC)患者的石蜡包埋组织切片，用Qiagen公司的REPL1-g FFPE Kit试剂盒提取样本基因组DNA，并用NanoDrop 1000核酸蛋白测定仪检测提取的核酸的浓度和纯度。
[0023]实施例2:引物、探针的设计
设计并筛选能特异性检测K-ras基因8种突变的特异性MGB探针、ARMS引物、通用引物及内参引物与探针。K-ras基因的8种突变分别为:密码子12 GGT > GATU2 GGT >AGTU2 GGT > GTTU2 GGT > GCTU2 GGT > TGTU2 GGT > CGTU3 GGC > GAC 与 13 GGC
>CGC的置换突变。等位基因特异性MGB探针序列如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 所示；通用上游引物序列如SEQ ID NO:9所示；ARMS下游引物序列如SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示；野生型内参探针序列如SEQ ID NO: 18所示；野生型内参引物序列如SEQ ID N0:19所
/Jn ο
[0024]实施例3:反应体系的优化
(I)引物浓度的优化:在反应体系中其它条件相同的情况下，将引物浓度分别从200 nM到800 nM作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较确定最佳引物浓度是600 nM。
[0025](2)探针浓度的优化:在反应体系中其它条件相同的情况下，将探针浓度分别从100 nM到300 nM作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较确定最佳探针浓度是200nM。
[0026](3)MgC12浓度的优化:在反应体系中其它条件相同的情况下，将MgC12浓度从2mM到5 mM作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较确定最佳MgC12浓度是3 mM。
[0027](4)Taq DNA聚合酶的优化:在反应体系中加入各种酶，通过对试验结果的分析比较，确定最佳酶是 GoldStar Taq DNA Polymerase。
[0028]经优化的反应体系为30 μ I,PCR反应液的各成分组成为:PCR buffer (I X )、TaqDNA 聚合酶(I 们、醫酶(0.2 U)、dNTPs (250 nM)、MgC12 (3 mM)、MGB 探针(200 nM)、引物(600 nM)、模板 DNA (10-100 ng)。[0029]每个样本进行4管反应，每管反应加入共同的PCR反应混合液、通用上游引物、野生型内参引物和探针，然后在反应管A中加入检测密码子12 GGT > GAT与12 GGT > AGT置换突变的MGB探针和下游ARMS引物，在反应管B中加入检测密码子12 GGT > GTT与12GGT > GCT置换突变的MGB探针和下游ARMS引物，在反应管C中加入检测密码子12 GGT >TGT与12 GGT > CGT置换突变的MGB探针和下游ARMS引物，在反应管D中加入检测密码子13 GGC > GAC与13 GGC > CGC置换突变的MGB探针和下游ARMS引物。配置好PCR反应液后加入提取好的基因组DNA模板，每次实验必须包括阳性对照和阴性对照。配置完成后涡旋混匀，离心并上机检测。
[0030]实施例4:反应程序的优化
(O退火温度的优化:在反应体系中其它条件相同的情况下，进行梯度PCR，退火温度分别为58 1:至63 °C，通过对试验结果的分析比较确定最佳退火温度是60 °C。
[0031](2)退火时间的优化:在反应体系中其它条件相同的情况下，退火时间分别为45 s至90 s,通过对试验结果的分析比较确定最佳退火温度是45 S。
[0032]经优化的反应程序为:50 °C, 2 min ；95 °C，10 min ;接下来是40个循环:95 °C，
15 s ；60 °C,45s (采集荧光)。上机检测时，分别在FAM、VIC、NED荧光通道检测荧光信号。
[0033]实施例5:结果判读 反应结束后，用仪器配套的荧光定量PCR软件对本次实验结果进行分析。正常情况下，阴性对照各荧光通道(FAM、VIC、NED)均无扩增，阳性对照各荧光通道(FAM、VIC、NED)均有扩增，反应管A、B、C、D中内参通道(NED)应均有扩增。反应管A、B、C、D中NED通道是检测K-ras基因野生型的，如果被检样本中K-ras基因全部突变时，此荧光通道是无扩增的。
[0034]若反应管A的FAM通道出现扩增表明该样本有12 GGT > GAT置换突变，若反应管A的VIC通道出现扩增表明该样本有12 GGT > AGT置换突变；
若反应管B的FAM通道出现扩增表明该样本有12 GGT > GTT置换突变，若反应管B的VIC通道出现扩增表明该样本有12 GGT > GCT置换突变；
若反应管C的FAM通道出现扩增表明该样本有12 GGT > TGT置换突变，若反应管C的VIC通道出现扩增表明该样本有12 GGT > CGT置换突变；
若反应管D的FAM通道出现扩增表明该样本有13 GGOGAC置换突变，若反应管D的VIC通道出现扩增表明该样本有13 GGC > CGC置换突变。
【权利要求】
1.一种人类κ-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，该试剂盒包括PCR混合反应液、等位基因特异性MGB探针、通用上游引物、ARMS下游引物、野生型内标探针及野生型下游引物，以及阳性对照品。
2.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于:所述PCR混合反应液中含PCR Buffer、UNG酶、Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs。
3.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于:所述等位基因特异性MGB探针序列如SEQ ID NOiUSEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ IDNO:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8 所示。
4.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于:所述通用上游引物序列如SEQ ID N0:9所示；所述ARMS下游引物序列如SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17 所示。
5.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于:所述野生型内标探针序列如SEQ ID NO: 18所示；所述野生型下游引物序列如SEQ ID NO: 19所示。
6.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于:所述等位基因特异性MGB探针包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照品是存在密码子12 GGT > GAT和12 GGT > AGT置换突变的混合质粒 DNA。
7.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于:所述等位基因特异性MGB探针包括如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照品是存在密码子12 GGT > GTT和12 GGT > GCT置换突变的混合质粒 DNA。
8.根据权利要求1所述的人类`K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于:所述等位基因特异性MGB探针包括如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照品是存在密码子12 GGT > TGT和12 GGT > CGT置换突变的混合质粒 DNA。
9.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于:所述等位基因特异性MGB探针包括如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照品是存在密码子13 GGC > GAC和13 GGC > CGC置换突变的混合质粒 DNA。
10.一种人类K-ras基因8种突变荧光分型检测方法，其特征在于:包括以下步骤:按常规方法提取待检测样本的基因组DNA，然后分4个反应管(A、B、C、D)进行检测，首先在每个反应管中分别加入PCR混合反应液、通用上游引物、野生型内标探针及野生型下游引物，然后在反应管A加入检测密码子12 GGT > GAT与12 GGT > AGT置换突变的MGB探针和ARMS下游引物；在反应管B加入检测密码子12 GGT > GTT与12 GGT > GCT置换突变的MGB探针和ARMS下游引物；在反应管C加入检测密码子12 GGT > TGT与12 GGT > CGT置换突变的MGB探针和ARMS下游引物；在反应管D加入检测密码子13 GGC > GAC与13 GGC>CGC置换突变的MGB探针和ARMS下游引物，进行核酸样本的荧光定量PCR检测；所述通用上游引物的序列如SEQ ID N0:9所示； 所述野生型内标探针及野生型下游引物序列如SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19所示；所述用于检测密码子12 GGT > GAT与12 GGT > AGT置换突变的MGB探针和ARMS下游引物序列如 SEQ ID NO:USEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID N0:11 所示; 所述用于检测密码子12 GGT > GTT与12 GGT > GCT置换突变的MGB探针和ARMS下游引物序列如 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 所示; 所述用于检测密码子12 GGT > TGT与12 GGT > CGT置换突变的MGB探针和ARMS下游引物序列如 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 所示; 所述用于检测密码子13 GGC > GAC与13 GGC > CGC置换突变的MGB探针和ARMS下游引物序列如 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17 所示。
【文档编号】C12Q1/68GK103695555SQ201310732595
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】吴舒歌, 吴大治, 夏懿 申请人:上海星耀医学科技发展有限公司, 上海复星医药（集团）股份有限公司