一种用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒。该用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒包括一盒体，该盒体内至少设有缓冲液放置区、明胶放置区、培养基放置区。采用本实用新型所提供的试剂盒能够实现脐带间充质干细胞的分离和培养，具有结构简单、使用方便的特点，有助于实现脐带间充质干细胞的高纯度和高效分离培养。
【专利说明】—种用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞是广泛存在于结缔组织和器官间质中的多能干细胞，具有良好增殖能力和多向分化潜能，在特定条件下可向成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、造血细胞、肝细胞等功能性细胞分化。因为MSCs来源方便，易于分离、体外扩增和纯化，且在传代扩增后仍可保持干性，因此是组织工程、基因工程和细胞治疗的理想种子细胞来源。此外，MSCs具有强大的免疫调节功能，在移植中具有低免疫原性的特点，在终末期肝病等终末期疾病以及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病治疗中具有广阔的应用前景。
[0003]目前已经进行的临床试验研究证实，在终末期肝病治疗中，MSCs移植能够明显改善患者的肝功能；而将皮肤角质细胞与MSCs混合后进行移植，可有效延长移植皮肤的存活时间并减少异体移植物抗免疫疾病(graft vs host disease, GVHD)。对于MSCs免疫调节机制的研究认为，MSCs主要通过旁分泌作用，产生多种免疫调节因子，作用于免疫细胞后，诱导免疫耐受，从而发挥调控机体的免疫的作用。
[0004]此外，通过将MSCs进行基因修饰，把IFN β、EPO等基因导入其基因组中，可获得能够在体内长时间稳定表达该蛋白或细胞因子的功能性细胞。吴祖泽等人把HGF的基因导入MSCs中，体内外实验证实HGF基因转染的人骨髓MSC仍维持原有的增殖和分化能力，而对体外细胞免疫反应具有更强的抑制效果，因此在组织器官移植中存在更大的潜在应用价值(边莉，郭子宽，艾辉胜，王华，孟二红，吴祖泽，王立生；HGF基因修饰增强间充质干细胞的免疫抑制作用；军事医学科学院院刊；2006，30(4):323-328)。正因如此，目前各国均投入大量人力物力经费进行广泛和深入的研究。但所有的研究或治疗方案都必须建立在足够量MSCs获取的基础上，因此建立稳定有效快速的MSCs分离、扩增、质量控制的技术体积具有重要的意义。
[0005]在人体组织中，骨髓中存在大量的MSCs，然而随着年龄老化，自体骨髓中的MSCs的数目会显著降低、且增殖能力也会大幅衰退。同时，为保证自体或供体安全，对骨髓MSCs的采集技术要求严格，配套仪器精密、成本高，不宜应用推广。因此，对于骨髓以外来源的研究越来越被重视。目前，不同的研究已经从围产期的胎盘、脐带、脐带血，抽脂术来源的脂肪以及流产胎儿中分离获得增殖能力好、低免疫原性的MSCs。而这些组织中，脐带属于医疗废弃物，具有易于获得、来源稳定可控、无伦理争议问题的特点，具有良好的研究价值和应用前景。
[0006]但是，目前还没有能够较好地实现脐带间充质干细胞的原代分离和传代扩增培养的方法及试剂盒，这是本领域亟待解决的问题之一。
实用新型内容[0007]为解决上述技术问题，本实用新型的目的在于提供一种用于分离和培养脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,MSCs)的试剂盒,该试剂盒包含各种试剂和器皿，便于脐带间充质干细胞的分离和培养。
[0008]为了达到上述目的，本实用新型提供了一种用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，该用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒包括一盒体，该盒体内至少设有缓冲液放置区、明胶放置区、培养基放置区。
[0009]在上述用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒中，优选地，所述缓冲液放置区设有第一缓冲液瓶。
[0010]在上述用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒中，优选地，所述明胶放置区设有盛装明胶的容器。
[0011]在上述用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒中，优选地，所述培养基放置区设有第一广口瓶。该第一广口瓶用于盛装培养基，例如BPS-SFM无血清培养基。
[0012]在上述用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒中，优选地，所述盒体内还设有酶放置区和生理盐水放置区。
[0013]在上述用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒中，优选地，所述酶放置区设有棕色塑料瓶和透明广口瓶。棕色塑料瓶用于盛装胶原酶A或者胶原酶A与中性蛋白酶的混合液。透明广口瓶用于盛装胰酶。
[0014]在上述用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒中，优选地，所述生理盐水放置区设有第二广口瓶。该第二广口瓶用于盛装生理盐水。
[0015]在上述用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒中，优选地，所述缓冲液放置区设有第二缓冲液瓶。该第二缓冲液瓶用于盛装PBS缓冲液，例如含青霉素-链霉素且无Ca2+、Mg2+的 PBS 缓冲液。
[0016]本实用新型提供的上述试剂盒可以按照以下步骤进行脐带间充质干细胞的分离和培养:
[0017]取出缓冲液放置区中盛装PBS缓冲液的第一缓冲液瓶，用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；
[0018]将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎，得到华通氏胶组织块；
[0019]取出盛装明胶的容器，利用明胶对培养皿进行铺被，用培养基重悬剪碎的华通氏胶组织块，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液。
[0020]当本实用新型提供的上述试剂盒包括酶放置区和生理盐水放置区时，可以按照以下步骤进行脐带间充质干细胞的分离和培养:
[0021 ] ( I)取出缓冲液放置区中盛装PBS缓冲液的第一缓冲液瓶，用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；
[0022](2)将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎；
[0023]取出棕色塑料瓶，向剪碎的华通氏胶中加入胶原酶A或者胶原酶A与中性蛋白酶的混合液，置于CO2培养箱中消化处理；[0024](3)消化处理之后，进行离心处理并收集细胞和残余组织，利用PBS缓冲液洗去残留酶，再次进行离心分离，弃去上层清液；
[0025](4)取出透明广口瓶和第二广口瓶，向弃去上层清液后的剩余物中加入胰酶，置于CO2培养箱中消化处理，加入生理盐水混匀，离心分离，弃去上层清液；
[0026](5)取出盛装无血清培养基的第一广口瓶和盛装明胶的容器，利用明胶对培养皿进行铺被，用MSCs培养基重悬组织和细胞，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液。
[0027]当本实用新型提供的上述试剂盒包括盛装明胶的容器和第二缓冲液瓶时，可以按照以下步骤进行脐带间充质干细胞的分离和培养:
[0028]( I)取出缓冲液放置区中盛装PBS缓冲液的第一缓冲液瓶，用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；
[0029](2)将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎；
[0030]取出棕色塑料瓶，向剪碎的华通氏胶中加入胶原酶A或者胶原酶A与中性蛋白酶的混合液，置于CO2培养箱中消化处理；
[0031](3)消化处理之后，进行离心处理并收集细胞和残余组织，利用PBS缓冲液洗去残留酶，再次进行离心分离，弃去上层清液；
[0032](4)取出透明广口瓶和第二广口瓶，向弃去上层清液后的剩余物中加入胰酶，置于CO2培养箱中消化处理，加入生理盐水混匀，离心分离，弃去上层清液；
[0033](5)取出盛装无血清培养基的第一广口瓶和盛装明胶的容器，利用明胶对培养皿进行铺被，用MSCs培养基重悬组织和细胞，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液；
[0034](6)取出第二缓冲液瓶，采用明胶对一个新的培养皿进行包被处理，接种细胞前弃去明胶，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液进行洗涤；
[0035](7)将分离获得的组织块和细胞重悬液接种于步骤(6)处理后的培养皿中，待细胞生长融合至80%-90%时进行消化传代。
[0036]在上述步骤(6)中，可以采用0.1%-0.2%的明胶对培养皿进行包被，然后在37°C、5%C02的培养箱中孵育I小时或4°C孵育8-12小时。
[0037]采用本实用新型所提供的试剂盒能够实现脐带间充质干细胞的分离和培养，具有结构简单、使用方便的特点，有助于实现脐带间充质干细胞的高纯度和高效分离培养。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1为实施例1提供的用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒的结构示意图；
[0039]图2为实施例2提供的用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒的结构示意图；
[0040]图3为实施例3提供的用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒的结构示意图。
[0041]主要附图标号说明:[0042]盒体I缓冲液放置区2培养基放置区3明胶放置区4第一缓冲液瓶5第一广口瓶6盛装明胶的容器7酶放置区8生理盐水放置区9棕色塑料瓶10透明广口瓶11第二广口瓶12第二缓冲液瓶13
【具体实施方式】
[0043]为了对本实用新型的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本实用新型的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本实用新型的可实施范围的限定。
[0044]实施例1
[0045]本实施例提供了一种用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒，其结构如图1所示。该试剂盒包括一盒体1，该盒体I内设有缓冲液放置区2、培养基放置区3、明胶放置区4，其中:
[0046]缓冲液放置区2内设有第一缓冲液瓶5,该第一缓冲液瓶5盛装有2wt%青霉素-链霉素(青霉素终浓度100U/mL，链霉素终浓度0.01g/100mL)的PBS缓冲液；
[0047]明胶放置区4设有盛装明胶的容器7 ；
[0048]培养基放置区3设有一盛装无血清培养基的第一广口瓶6，该无血清培养基为BPS-SFM无血清培养基，其具体成分如表1所示。
[0049]上述试剂盒可以按照以下步骤进行脐带间充质干细胞的分离和培养:
[0050]1、获取15cm健康新生儿脐带组织,用第一缓冲液瓶5中的含2wt%青霉素-链霉素(青霉素终浓度100U/mL，`链霉素终浓度0.01g/100mL)的PBS缓冲液充分洗净，充分去除血污；
[0051]2、将洗净的脐带均匀剪为3_4cm长度的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉，利用眼科剪刀将剥离的华通氏胶剪为lmm3-3mm3的小块，得到华通氏胶组织块；
[0052]3、取IOcm培养皿以及盛装明胶的容器7，用浓度为0.2wt%的明胶对培养皿进行包被，置于37°C、5%C02的培养箱中孵育I小时，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液进行洗涤，去除残留明胶；
[0053]4、用第一广口瓶6中的BPS-SFM无血清培养基重悬组织和细胞(剪碎的华通氏胶组织块)，接种于明胶铺被的培养皿中，置于37°C、5%C02培养箱的培养，待细胞生长融合至85%时进行消化传代。
[0054]表1
[0055]
【权利要求】
1.一种用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，该用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒包括一盒体，该盒体内至少设有缓冲液放置区、明胶放置区、培养基放置区。
2.根据权利要求1所述的用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液放置区设有第一缓冲液瓶。
3.根据权利要求1所述的用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，所述明胶放置区设有盛装明胶的容器。
4.根据权利要求1所述的用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，所述培养基放置区设有第一广口瓶。
5.根据权利要求1所述的用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，所述盒体内还设有酶放置区和生理盐水放置区。
6.根据权利要求5所述的用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，所述酶放置区设有棕色塑料瓶和透明广口瓶。
7.根据权利要求5所述的用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，所述生理盐水放置区设有第二广口瓶。
8.根据权利要求1所述的用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液放置区设有第二缓冲液瓶。
9.根据权利要求2所述的用于分离和培养脐带间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液放置区设有第二缓冲液瓶。
【文档编号】C12N5/0775GK203625386SQ201320735171
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年8月16日
【发明者】刘湘连, 王春有, 赵宇, 李莉莉 申请人:北京东方华辉生物医药科技有限公司