美国红鱼抗病毒蛋白（viperin）及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种美国红鱼viperin及其制备和应用。美国红鱼抗病毒蛋白序列为SEQ?ID?No.1中氨基酸所示。所述表达SEQ?ID?No.1中氨基酸的viperin的质粒pVip在抗病毒感染中的应用。本发明的viperin表达质粒注射鱼类后能够显著提高鱼类的抗病毒能力。
【专利说明】美国红鱼抗病毒蛋白(viper in)及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种美国红鱼viperin及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]Viperin是一种与内质网相关的、受干扰素诱导的抗病毒蛋白，其分子量约为40kDa。从低等脊椎动物到哺乳动物viperin均呈现出高度的氨基酸序列保守性，其蛋白结构均包含一个 SAM 酶(S-adenosyl methionine-dependent radical enzymes)结构域和一个高度保守的C末端区域。Viperin通过其N-端α螺旋结构锚定在内质网膜或脂质体上。由于内质网和脂质体是病毒蛋白合成和病毒扩增所必需的场所，所以在这两个细胞器上的定位对于viperin行使抗病毒功能有着至关重要的作用。在正常情况下viperin的表达水平非常低，然而当受到病毒(包括DNA和RNA病毒)、脂多糖或者I型干扰素的刺激后viperin的表达水平会骤然上升。目前已知的哺乳类viperin抗病毒机制主要有(I)干扰破坏病毒出芽所必需的脂後结构；(2)干扰病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用从而影响病毒的组装。然而，鱼类viperin研究较少，其抗病毒作用尚不清楚。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供一种美国红鱼viperin及其制备和应用。
[0004]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0005]一种美国红鱼抗病毒蛋白(viperin),美国红鱼抗病毒蛋白序列为SEQ ID N0.1中氨基酸所示。
[0006]一种美国红鱼抗病毒蛋白的制备方法，以美国红鱼cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与质粒pCN3用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即得到表达SEQ ID N0.1中氨基酸的viperin的质粒pVip ;所述Fl为 5’ -GATATCATGCAGCTCTCCTCTATC-3’ ；R1 为 5’ -GATATCCCACTCCAGCTTCATGT-3’。
[0007]一种美国红鱼抗病毒蛋白(viperin)的应用，所述表达SEQ ID N0.1中氨基酸的viperin的质粒pVip在制备抗病毒感染的制剂中的应用。
[0008]本发明具有如下优点:本发明的viperin表达质粒注射鱼类后能够显著提高鱼类的抗病毒能力。
【具体实施方式】
[0009]下面结合实施例对 本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
[0010]在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法:
[0011]1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。[0012]2.大肠杆菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning: ALaboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)o
[0013]3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
[0014]实施例1
[0015]本发明的viperin为序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列。
[0016]序列表SEQ ID N0.1 为:
[0017]MQLSSIVASPKQLLQLCISTLHCLLASVFSKVSSWTAGTCKESTSPVSPVDGKLDQNKVQNATTPTSVNYHFTRKCNYKCGFCFHTAKTSFVLPLEEAKRGLKLLKESGMEKINFSGGEPFLHDKGEFLGKLVQFCKQDLQLPSVSIVSNGSMIKEKWFQKYGDYLDILAISCDSFDEETNQLIGRAQGRKSHLDNLYKIRNWCQQYKVAFKINSVINTFNVDEDMTESITQLSPVRWKVFQCLLIDGENAGEKALREAERFVISDQLFQEFLDRHSSVSCLVPESNEKMRNSYLILDEYMRFLDCREGRKDPSKSVLDVGVKEAICFSGFDEKMFLKRGGKYVWSKADMKLEW
[0018](a)序列特征:
[0019]?长度:354 (有效长度354)
[0020]?类型:氨基酸序列
[0021]籲链型:单链
[0022]?拓扑结构:线性
·[0023](b)分子类型:蛋白质
[0024](C)假设:否
[0025](d)反义:否
[0026]( e )最初来源:美国红鱼
[0027]结构特点:该蛋白含有一个SAM家族蛋白结构域(氨基酸66 — 274)。
[0028]实施例2
[0029]Viperin表达质粒pVip的构建:
[0030]以美国红鱼cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增。PCR条件为:94 V 60s预变性模板DNA，然后94 °C 40s, 60 V 60s, 72 V 60s, 5个循环后改为940C 40s, 650C 60s, 72°C 60s, 30个循环后再在72°C延伸反应7 — IOmin0 PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体PCN3 (构建过程参见Jiao XD, Zhang M，Hu YH, SunL.Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tardaantigens.Vaccine2009; 27:5195 - 202.)用限制性内切酶 EcoRV 酶切后回收 5.4kb 片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，命名为pVip。通过DNA测序分析证明了 pVip为含有viperin序列的表达质粒。
[0031]所述LB组成成分按重量百分比计:1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，97.5 % 蒸馏水。所述 Fl 为 5’-GATATCATGCAGCTCTCCTCTATC-3’ ；R1 为5’ -GATATCCCACTCCAGCTTCATGT-3’。
[0032]实施例3
[0033]Viperin表达质粒pVip的应用
[0034]步骤I)质粒注射
[0035]将上述实施例1的pVip在PBS中稀释至200ug/ml，即为pVip稀释液。将20条美国红鱼(重约27g)随机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别注射IOOul pVip稀释液，将B组(对照组)的每条鱼分别注射IOOul PBS0
[0036]所述PBS 组成成分按重量百分比计:0.8%NaCl, 0.02%KC1, 0.358%Na2HP04.12H20, 0? 024%NaH2P04，余量为水。
[0037]步骤2)病毒悬液制备
[0038]将细胞肿大病毒RBIV-Cl (具体制备方法见Zhang M, Xiao Z, Hu Y, SunL.Characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream, Oplegnathusfasciatus (Temminck&Schlege), in China.Aquae Res.2012; 43:556 - 64)于 PBS 中稀释至106copies/ml,即为病毒悬液。 [0039]步骤3)攻毒感染
[0040]在上述步骤I)注射后第3天，将A和B组的每条鱼注射IOOul上述步骤2)的病毒悬液。在感染后5天和7天，取鱼脾脏组织。利用DNA提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司”)从组织中提取DNA，用绝对定量PCR法检测组织中病毒含量(具体方法见上述参考文献)。结果表明，A组鱼5天和7天的病毒数(2.8xl05和5.4xl06)显著(P〈0.01)低于B组鱼5天和7天的的病毒数(3.5xl06和1.2xl07)。
[0041]这些结果表明，viperin能够显著增强鱼类抵抗病毒的侵染。
【权利要求】
1.一种美国红鱼抗病毒蛋白(viperin),其特征在于:美国红鱼抗病毒蛋白序列为SEQID N0.1中氨基酸所示。
2.—种权利要求1所述的美国红鱼抗病毒蛋白的制备方法，其特征在于:以美国红鱼cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与质粒pCN3用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即得到表达SEQ ID N0.l中氨基酸的 viperin 的质粒 pVip ;所述 Fl 为 5’ -GATATCATGCAGCTCTCCTCTATC-3，；R1 为5’ -GATATCCCACTCCAGCTTCATGT-3’。
3.一种权利要求1所述的美国红鱼抗病毒蛋白(viperin)的应用,其特征在于:所述表达SEQ ID N0.1中 氨基酸的viperin的质粒pVip在制备抗病毒感染的制剂中的应用。
【文档编号】C12N15/52GK103740658SQ201410038037
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】孙黎, 张宝存 申请人:中国科学院海洋研究所