制备交联nampt及筛选nampt抑制剂的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，涉及抑制剂领域，包括以下步骤：制备NAMPT重组蛋白，使用还原剂还原NAMPT重组蛋白，还原蛋白与交联剂反应获得活性中心被封堵的交联NAMPT，配置第一蛋白溶液、和第二蛋白溶液，制备第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液，采用荧光光谱仪分别测定第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液的荧光强度，并计算第一待分析溶液和第二待分析溶液荧光强度下降的百分率。本发明的步骤比较少，操作较简单，成本比较低，反应过程受外界环境影响比较小，不仅重复性较好，而且结果比较准确。
【专利说明】制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及NAMPT抑制剂选择领域，具体涉及一种制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法。
【背景技术】
[0002]NAMPT (nicotinamidephosphoribosyltransferase,尼克酸胺憐酸核糖转移酶)又称为 PBEF (pre-B cell colony-enhancing factor,前 B 细胞克隆增强因子)或 Visfatin(cisceral fat adipokine，内脏脂肪素)，是哺乳动物体内 NAD (nicotinamde adeninedinucleotide,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸)补救合成通路中的限速酶。NAD用于参与细胞物质、能量代谢、蛋白质修饰、DNA修复等工程，当人体处于应激状态或者产生疾病时，人体内的NAD含量会增加，与NAD对应的NAMPT的含量也会增加。
[0003]NAMPT广泛分布在人体中，NAMPT在人体细胞内(细胞浆、细胞核和线粒体)和细胞外的作用机制不同，细胞内的NAMPT主要通过合成NAD，来调节细胞代谢、促进细胞分化成熟、促进细胞生长和保持细胞各项功能的稳定。细胞外的NAMPT不仅能够通过合成NMN(nicotinamide mononucleotide,烟酰胺单核苷酸)发挥作用，而且本身具有非酶的作用，即NAMPT能够作为一个细胞因子，通过作用于其未知的受体发挥作用，如产生介导炎症、氧化应激等反应。
[0004]研究表明，快速增殖的肿瘤细胞需要较多的MD，肿瘤细胞中NAMPT的含量远高于正常细胞，通过抑制肿瘤细胞中NAMPT的表达，能够抑制肿瘤细胞的生长。因此，NAMPT成为了抗肿瘤药物研究的新靶点。
[0005]现有的NAMPT 抑制剂包括 FK866(又称 AP0866，英文名为(E)-N-[4-[1-(benzoyl)piperidin-4-yl]butyl]-3-pyridin-3-ylprop-2-enamide,分子式为 C24H29N3O2)和CB30865 (英文名 p-[N-(7-bromo-3, 4-dihydro-2-methyl-4-oxoquinazoIin-6-yImethy 1+++) -N- (prop-2-ynyl) amino] -N- (3-pyridylmethyl) benzamide,分子式 C26H22BrN5O2),其中FK866的抗肿瘤临床试验已经进行了 5项，但是FK866在使用时副作用较大，抗肿瘤疗效较差，新的NAMPT抑制剂还在积极探索中。
[0006]目前，筛选NAMPT抑制剂的方法为以下2种:
[0007](1)针对NAMPT的蛋白质构象进行药物设计:得到先导化合物，对其进行结构改造得到待选抑制剂；或通过FK866等已知抑制剂获得母核，对母核进行结构改造得到待选抑制剂，然后将待选抑制剂与肿瘤细胞株进行作用，筛选效果较好的待选抑制剂得到抑制剂成品。
[0008](2)将待选抑制剂加入体外的NAMPT重组蛋白酶促反应体系，得到NMN (尼克酰胺单核苷酸);向NMN中先加入苯乙酮反应、再加入乙酸反应，得到带有一个荧光基团的NMN衍生物，对NMN衍生物进行荧光测定，得到NMN的生成量，通过NMN的生成量判断NAMPT重组蛋白的酶活性是否受到待选抑制剂的影响。
[0009]但是，现有的筛选NAMPT抑制剂的方法分别存在以下缺陷:[0010](I)对先导化合物和已知抑制剂母核化合物结构改造得到待选抑制剂，将待选抑制剂与肿瘤细胞株作用得到抑制剂成品的方法，每次只能对一种待选抑制剂进行筛选，步骤比较繁琐，不仅成本比较高，而且工作效率比较低。
[0011](2)将待选抑制剂加入体外的NAMPT重组蛋白酶促反应体系，通过测定NMN选择抑制剂的方法，反应步骤较多，操作比较复杂，反应过程受外界环境影响较大，检测结果准确度较低。
【发明内容】
[0012]针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，成本较低，工作效率较高，反映步骤较少，操作比较简单，反应过程受外界环境影响较小，检测结果较准确。
[0013]为达到以上目的，本发明采取的技术方案是:一种制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0014]S1、制备NAMPT重组蛋白；
[0015]S2、按照摩尔份，将1份NAMPT重组蛋白加入20~100份还原剂中；在温度为20°C~25°C的条件下孵育0.5h~1.5h，得到粗蛋白；采用脱盐柱除去粗蛋白中的还原剂，得到预处理蛋白；
[0016]S3、按照摩尔 份，将1份预处理蛋白与2~5份1，4_双(马来酰亚胺基)丁烷混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下静置反应Ih~5h，采用脱盐柱除去未反应的1，4-双(马来酰亚胺基)丁烷，得到交联NAMPT ；
[0017]S4、预置PBS缓冲溶液，将PBS缓冲溶液分为3份:第一 PBS缓冲溶液、第二 PBS缓冲溶液、第三PBS缓冲溶液，所述第一 PBS缓冲溶液和第二 PBS缓冲溶液的体积相同；
[0018]向第一 PBS缓冲溶液中加入NAMPT重组蛋白，形成浓度小于50 μ M的第一蛋白溶液；将第一蛋白溶液平均装入偶数支容积为500μ L~2mL的第一石英管中，将所述第一石英管平均分为2组:A组、B组；
[0019]向第二 PBS缓冲溶液中加入交联NAMPT，配置浓度与第一蛋白溶液相同的第二蛋白溶液；将第二蛋白溶液平均装入偶数支容积为500μ L~2mL的第二石英管中，每支第二石英管中的第二蛋白溶液的体积，与每支第一石英管中第一蛋白溶液的体积相等，将所述第二石英管平均分为两组:C组、D组；
[0020]S5、配置浓度为0.5mM~1.5mM的待选择抑制剂溶液，向A组的每支第一石英管中加入体积不一的待选择抑制剂溶液，每支第一石英管中第一蛋白溶液的NAMPT重组蛋白的摩尔量:待选择抑制剂溶液的摩尔量为1:0~1:100 ;每支第一石英管加入待选择抑制剂溶液后混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下，静置5min~15min，得到第一待分析溶液；
[0021]向B组的每支第一石英管中加入体积不一的第三PBS缓冲溶液，每支第一石英管中第三PBS缓冲溶液的体积，与A组对应的第一石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同，每支第一石英管加入第三PBS缓冲溶液后混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下，静置5min~15min,得到第一对照溶液；
[0022]向C组的每支第二石英管中加入体积不一的待选择溶液，每支第二石英管中待选择抑制剂溶液的体积，与A组对应的第一石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同，混合均匀，每支第二石英管加入待选择抑制剂溶液后混合均匀后，在温度为20°C~25°C的条件下，静置5min~15min,得到第二待分析溶液；
[0023]向D组的每支第二石英管中加入体积不一的第三PBS缓冲溶液，每支第二石英管中第三PBS缓冲溶液的体积，与A组对应的第一石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同，每支第二石英管加入第三PBS缓冲溶液后，混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下，静置5min~15min,得到第二对照溶液；
[0024]S6、使用荧光光谱仪测定第一待分析溶液的荧光强度、第一对照溶液的荧光强度、第二待分析溶液的荧光强度、第二对照溶液的荧光强度；
[0025]S7、根据第一待分析溶液的荧光强度和第一对照溶液的荧光强度，计算第一待分析溶液荧光强度下降的百分率；根据第二待分析溶液的荧光强度和第二对照溶液的荧光强度，计算第二待分析溶液荧光强度下降的百分率。
[0026]在上述技术方案的基础上，所述待选择抑制剂为迷迭香酸、洋蓟素、1，3- 二咖啡酰奎宁酸或FK866。
[0027]在上述技术方案的基础上，步骤S2中所述还原剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦。
[0028]在上述技术方案的基础上，步骤S2包括以下步骤:按照摩尔份将1份NAMPT重组蛋白加入浓度为ImM~5mM的30份二硫苏糖醇中，在温度为20°C~25°C的条件下孵育lh，得到粗蛋白，采用脱盐柱除去粗蛋白中未反应的二硫苏糖醇得到预处理蛋白。
[0029]在上述技术方案的基础上，步骤S3包括以下步骤:将1，4-双(马来酰亚胺基)丁烷溶解于二甲基亚砜中，形成浓度为IOmM的1，4_双(马来酰亚胺基)丁烷溶液，取120 μ LI，4-双(马来酰亚胺基)丁烷溶液与预处理蛋白混合均匀后，在温度为20°C~25°C的条件下反应2h，采用脱盐柱除去未反应的1，4_双(马来酰亚胺基)丁烷，得到交联NAMPT。
[0030]在上述技术方案的基础上，步骤S4包括以下步骤:预置PBS缓冲溶液，将PBS缓冲溶液分为3份:第一 PBS缓冲溶液、第二 PBS缓冲溶液、第三PBS缓冲溶液，所述第一 PBS缓冲溶液和第二 PBS缓冲溶液的体积相同；
[0031]向第一 PBS缓冲溶液中加入NAMPT重组蛋白，配置浓度为0.5 μ M的第一蛋白溶液；将第一蛋白溶液平均分装于偶数支第一石英管中，将第一石英管平均分为两组:Α组、B组；
[0032]向第二 PBS缓冲溶液中加入交联ΝΑΜΡΤ，配置浓度为0.5 μ M的第二蛋白溶液；将第二蛋白溶液拼接分装于偶数支第二石英管中，将第二石英管平均分为两组:C组、D组。
[0033]在上述技术方案的基础上，步骤S5包括以下步骤:配置浓度为0.5mM的待选择抑制剂溶液，向A组的第一石英管中依次加入体积不一的待选择抑制剂溶液，每支第一石英管中第一蛋白溶液的NAMPT重组蛋白的摩尔量:待选择抑制剂溶液的摩尔量为1:0~1:100 ;将每支第一石英管加入待选择抑制剂后，混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下，静置lOmin，得到第一待分析溶液；
[0034]向B组的第一石英管中依次加入体积不一的第三PBS缓冲溶液，第三PBS缓冲溶液的体积与加入A组的待选择抑制剂溶液的体积对应相等，每支第一石英管加入第三PBS缓冲溶液后，混合 均匀，在温度为20°C~25°C的条件下，静置lOmin，得到第一对照溶液。[0035]在上述技术方案的基础上，步骤S6包括以下步骤:使用荧光光谱仪，在激发波长为280nm的条件下，分别激发第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液，检测并记录第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液的发射波长为315nm~360nm的突光强度；
[0036]或者使用荧光光谱仪，在激发波长为280nm的条件下，分别激发第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液，检测并记录第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液的发射波长为333nm的荧光强度。
[0037]在上述技术方案的基础上，所述步骤S7中所述计算第一待分析溶液荧光强度下降的百分率的公式为:第一待分析溶液荧光强度下降百分率=(1-第一待分析溶液的荧光强度/第一对照溶液的荧光强度)X 100% ;所述计算第二待分析溶液荧光强度下降的百分率的公式为:第二待分析溶液荧光强度下降百分率=(1-第二待分析溶液的荧光强度/第二对照溶液的荧光强度)X 100%。
[0038]在上述技术方案的基础上，一种用于筛选NAMPT抑制剂的交联NAMPT，其特征在于:采用权利要求1中的步骤S1、S2和S3制成。
[0039]与现有技术相比，本发明的优点在于:
[0040](I)本发明的抑制剂分别与NAMPT重组蛋白和交联NAMPT反应，得到第一待分析溶液和第二待分析溶液，通过荧光光谱仪测定第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液、第二对照溶液。
[0041]在激发光为280nm的条件下，产生的发射波长为315nm~360nm的荧光强度，或者发射波长为333nm的荧光强度 并将第一待分析溶液的荧光强度与第一对照溶液的荧光强度进行比对；将第二待分析溶液的荧光强度与第二对照溶液的荧光强度进行比对，根据比对结果判定抑制剂对NAMPT重组蛋白和交联NAMPT是否有抑制作用。
[0042]与现有的对先导化合物和已知抑制剂母核化合物结构改造得到待选抑制剂，将待选抑制剂与肿瘤细胞株作用得到抑制剂成品的方法相比，成本比较低，反映步骤比较少，操作比较简单，工作效率较高，反应过程受外界环境影响比较小。
[0043](2)本发明采用BMB与NAMPT重组蛋白反应，形成酶活中心被封堵的交联NAMPT，本发明将待抑制剂分别与NAMPT重组蛋白和交联NAMPT反应，通过反应结果能够判断抑制剂与NAMPT重组蛋白的作用位点是否位于NAMPT的酶活中心，如果待选择抑制剂不仅能够与NAMPT重组蛋白作用，而且能够与交联NAMPT作用，则该待选择抑制剂为NAMPT重组蛋白催化作用抑制剂；如果待选择抑制剂只能与NAMPT重组蛋白作用，该待选择抑制剂可能成为NAMPT非酶作用抑制剂。
[0044]本发明能够区分待选择抑制剂是催化作用抑制剂，还是潜在的非酶作用抑制剂，为NAMPT抑制剂的设计和筛选提供了较好的工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1为交联NAMPT的结构示意图；
[0046]图2为不同摩尔量的迷迭香酸对NAMPT、交联NAMPT的荧光强度下降百分率的影响的趋势图；
[0047]图3为不同摩尔量的洋蓟素对NAMPT、交联NAMPT的荧光强度下降百分率的影响的趋势图；
[0048]图4为不同摩尔量的1，3- 二咖啡酰奎宁酸对NAMPT、交联NAMPT的荧光强度下降百分率的影响的趋势图；
[0049]图5为不同摩尔量的FK866对NAMPT、交联NAMPT的荧光强度下降百分率的影响的趋势图。
【具体实施方式】
[0050]以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。
[0051]本发明的制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，包括以下步骤:
[0052]S1:制备NAMPT重组蛋白.[0053]S2:按照摩尔份将1份NAMPT重组蛋白加入20~100份(优选为30份)还原剂中，还原剂可以选用DTT (二硫苏糖醇)或TCEP (三(2-羧乙基)膦)?’在温度为20°C~25°C的条件下孵育0.5h~1.5h (优选为lh)，得到粗蛋白，采用脱盐柱除去粗蛋白中的还原剂，得到预处理蛋白；
[0054]S3:按照摩尔份将1份预处理蛋白与2~5份交联试剂BMB (I, 4_双(马来酰亚胺基)丁烷)加入反应釜，混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下反应Ih~5h (优选为2h)后，采用脱盐柱除去未反应的BMB，得到交联NAMPT ；
[0055]S4:预置PBS缓冲溶液，将PBS缓冲溶液分为三份:第一 PBS缓冲溶液、第二 PBS缓冲溶液和第三PBS缓冲溶液，其中，第一 PBS缓冲溶液和第二 PBS缓冲溶液的体积相等。
[0056]向第一 PBS缓冲溶液中加入NAMPT重组蛋白，形成浓度小于50 μ M(优选为0.5 μ M)的第一蛋白溶液，;将第一蛋白溶液平均装入偶数支容积为500μ I~2mL的第一石英管中，将偶数支第一石英管平均分为2组:A组、B组；
[0057]向第二 PBS缓冲溶液中加入交联NAMPT，配置浓度与第一蛋白溶液相同的第二蛋白溶液；将第二蛋白溶液平均装入偶数支容积为500μ I~2mL的第二石英管中，每支第二石英管中的第二蛋白的体积，与每支第一石英管中第一蛋白的体积相等，将偶数支第二石英管平均分为两组=C组、D组；
[0058]S5、配置浓度为0.5mM~1.5mM的待选择抑制剂溶液，待选择抑制剂可以选用迷迭香酸、洋蓟素、1，3-二咖啡酰奎宁酸或FK866。向A组的第一石英管中依次加入体积不一的待选择抑制剂溶液，每支第一石英管中第一蛋白溶液的NAMPT重组蛋白的摩尔量:待选择抑制剂溶液的摩尔量为1:0~1:100 ;每支第一石英管中加入待选择抑制剂溶液后混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下，静置5min~15min (优选为lOmin)，得到第一待分析溶液；
[0059]向B组的所有第一石英管中依次加入体积不一的第三PBS缓冲溶液，B组每支第一石英管中第三PBS缓冲溶液的体积，与A组对应的第一石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同，每支第一石英管中加入第三PBS缓冲溶液后混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下，静置5min~1 5min (优选为IOmin),得到第一对照溶液；
[0060]向C组的所有第二石英管中依次加入体积不一的待选择抑制剂溶液，C组每支第二石英管中待选择抑制剂溶液的体积，与A组对应的第一石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同，每支第二石英管中加入待选择抑制剂溶液后混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下，静置5min~15min (优选为lOmin),得到第二待分析溶液；
[0061]向D组的所有第二石英管中依次加入体积不一的第三PBS缓冲溶液，D组每支第二石英管中第三PBS缓冲溶液的体积，与C组对应的第二石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同，每支第二石英管加入第三PBS缓冲溶液后混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下，静置5min~15min (优选为IOmin),得到第二对照溶液；
[0062]S6:使用型号为HORIBA FM4的荧光光谱仪，在激发波长为280nm的条件下，分别激发第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液，检测并记录第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液分别发射波长为315nm~360nm的荧光强度。
[0063]或者使用型号为HORIBA FM4的荧光光谱仪，在激发波长为280nm的条件下，分别激发第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液，检测并记录第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液分别发射波长为333nm的荧光
强度。
[0064]S7、根据第一待分析溶液的荧光强度和第一对照溶液的荧光强度，计算第一待分析溶液荧光强度下降的百分率；根据第二待分析溶液的荧光强度和第二对照溶液的荧光强度，计算第二待分析溶液荧光强度下降的百分率。
[0065]本发明实施例中制备NAMPT重组蛋白包括以下步骤:
[0066]将pET-1 la-hnampt(G355C，D393C)均转化至大肠杆菌 BL21 (DE3) Star 感受态细菌，将感受态细菌涂于含有50 μ g/ml氨苄青霉素的LB平板(无菌的、凝固在培养皿里的，掺了琼脂的固体培养基)的上表面，在37°C的无菌条件下培养12h后，将菌落转移至含有50 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37°C的条件下培养至克隆菌液的0D600=0.6 (0D指某种溶液在600nm波长处的吸光值)，加入浓度为0.5mmol/L的IPTG (异丙基硫代半乳糖苷)，在20°C的条件下诱导反应12h得到菌体培养液。
[0067]取1000Og菌体培养液在温度为4°C的条件下离心10min，收集细菌沉淀，用裂解液重悬细菌，采用型号为avestin EmulsiFlex-C3的压力破碎仪，在压力为15000bar的条件下破碎细胞得细胞悬浮液，将细胞悬浮液在温度为4°C、转速为20000rpm的条件下离心30min,收集上清液。
[0068]采用蛋白纯化层析系统对上清液进行蛋白纯化,得到纯化蛋白；选用HisTrap FFcrude层析柱，使用浓度为30mM~300mM的咪唑溶液对纯化蛋白进行梯度洗脱，收集紫外吸收峰为280nm对应的第一洗脱液。
[0069]采用型号为S-200的分子筛对第一洗脱液进行纯化，收集排阻体积为130ml左右的流出液；采用型号为Source Q的阴离子交换柱，选用浓度为OmM~500mM的NaCl溶液对流出液进行梯度洗脱，收集紫外吸收峰为280nm对应的第二洗脱液，得到NAMPT重组蛋白。
[0070]本发明的反应机理如下:
[0071 ] 本发明实施例中，NAMPT重组蛋白为两个NAMPT(G355C和D393C)单体形成的NAMPT二聚体，该二聚体具有两个催化中心，每个催化中心的入口处均有两对半胱氨酸，NAMPT重组蛋白与DTT反应，NAMPT重组蛋白的两对半胱氨酸均还原成半胱氨酰，形成预处理蛋白。预处理蛋白与BMB反应，BMB与预处理蛋白中半胱氨酰的酰基作用，形成交联NAMPT，参见图1所示，绿色带状物为BMB，红色位点为BMB与NAMPT交联位点，交联之处为位于NAMPT重组蛋白的被还原的催化中心，交联NAMPT为催化中心被BMB封堵的NAMPT重组蛋白。
[0072]本发明实施例通过测定NAMPT重组蛋白分别与待选择抑制剂、PBS缓冲溶液作用后的荧光强度，从而确定待选择抑制剂对NAMPT重组蛋白的影响；本发明实施例通过将待选择抑制剂分别于NAMPT重组蛋白、交联NAMPT作用，从而确定待选择抑制剂与NAMPT重组蛋白的结合位点，以及待选择抑制剂与NAMPT重组蛋白的结合强度。
[0073]本发明实施例是通过测定NAMPT重组蛋白内源荧光的变化来实现的，成本比较低，不仅操作比较简单，而且单次测量时间较短。
[0074]下面，将结合4个实施例对本发明作出详细说明。
[0075]实施例1，选择待选抑制剂为迷迭香酸。
[0076]S1:制备NAMPT重组蛋白。
[0077]S2:将2mL浓度为200 μ M的NAMPT重组蛋白加入1.6mL浓度为5mM的DTT ( 二硫苏糖醇)中，在温度为20°C的条件下，孵育lh，得到粗蛋白，采用脱盐柱除去粗蛋白中的DTT，得到预处理蛋白。
[0078]S3:将预处理蛋白和80 μ L浓度为IOmM的BMB交联试剂加入试管，混合均匀，在温度为20°C的条件下反应2h后，用脱盐柱除去多余的BMB，得到交联NAMPT。
[0079]S4:预置PBS缓冲溶液，将PBS缓冲溶液分为三份:第一 PBS缓冲溶液、第二 PBS缓冲溶液和第三PBS 缓冲溶液，其中，第一 PBS缓冲溶液和第二 PBS缓冲溶液的体积相同，向第一 PBS缓冲溶液中加入NAMPT重组蛋白，形成浓度为0.5 μ M的第一蛋白溶液，将第一蛋白溶液平均装入30支容积为2mL的第一石英管中，将第一石英管平均分为两组:A组、B组。
[0080]向第二PBS缓冲溶液中加入交联NAMPT，配置浓度为0.5 μ M的第二蛋白溶液，将第一蛋白溶液平均装入30支容积为2mL的第二石英管中，将第二石英管平均分为两组:C组、D组。
[0081]S5:配置浓度为ImM迷迭香酸，向A组的第一石英管中加入迷迭香酸:向第一支第一石英管中加入O μ L迷迭香酸、向第二支第一石英管中加入0.5 μ L迷迭香酸、向第三支第一石英管中加入I μ L迷迭香酸、向第四支第一石英管中加入1.5 μ L迷迭香酸、向第五支第一石英管中加入2 μ L迷迭香酸、向第六支第一石英管中加入3 μ L迷迭香酸、向第七支第一石英管中加入4 μ L迷迭香酸、向第八支第一石英管中加入5 μ L迷迭香酸、向第九支第一石英管中加入7 μ L迷迭香酸、向第十支第一石英管中加入10 μ L迷迭香酸、向第十一支第一石英管中加入15 μ L迷迭香酸、向第十二支第一石英管中加入20 μ L迷迭香酸、向第十三支第一石英管中加入25 μ L迷迭香酸、向第十四支第一石英管中加入35 μ L迷迭香酸、向第十五支第一石英管中加入50 μ L迷迭香酸。每支第一石英管加入迷迭香酸后，混合均匀，在温度为20°c的条件下静置lOmin，得到第一分析溶液。
[0082]向B组的第一石英管中滴加第三PBS缓冲溶液，滴加的体积依次为O μ L、0.5 μ L、I μ L、l.5μ L、2y L、3y L、4y L、5y L、7y L、10y L、15y L、20y L、25y L、35y L 和 50μ L,每
支第一石英管加入第三PBS缓冲溶液后混合均匀，在温度为20°C的条件下静置lOmin，得到第一对照溶液。
[0083]向C组的每支第二石英管中加入浓度为ImM迷迭香酸:滴加的体积依次为O μ L、0.5yL>lyL>1.5yL>2yL>3yL>4yL>5yL>7yL>10yL>15yL>20yL>25yL>35uL 和50 μ L0每支第二石英管加入迷迭香酸后，混合均匀，在温度为20°C的条件下静置lOmin，得到第二分析溶液。
[0084]向D组的第二石英管中滴加第三PBS缓冲溶液，滴加的体积依次为O μ L、0.5 μ L、I μ L、l.5μ L、2y L、3y L、4y L、5y L、7y L、10y L、15y L、20y L、25y L、35y L 和 50μ L,每
支第二石英管加入第三PBS缓冲溶液后，混合均匀，在温度为20°C的条件下静置lOmin，得到第二对照溶液。
[0085]S6:使用型号为HORIBA FM4的荧光光谱仪，在激发波长为280nm的条件下，分别激发第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液，测量并记录第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液的发射波长为315nm~360nm的荧光强度；
[0086]S7:计算第一待测溶液的荧光强度下降的百分率=(1-第一待分析溶液的荧光强度/第一对照溶液的荧光强度)X100% ;计算第二待测溶液的荧光强度下降的百分率=(1-第二待分析溶液的荧光强度/第二对照溶液的荧光强度)X100%。
[0087]参见图2所示，为NAMPT重组蛋白的荧光强度百分率与加入迷迭香酸摩尔量的关系图，以及交联NAMPT的荧光强度百分率与加入迷迭香酸摩尔量的趋势图。
[0088]迷迭香酸加入NAMPT重组蛋白后，NAMPT重组蛋白的荧光强度有所下降，随着迷迭香酸加入量的增加，NAMPT重组蛋白的荧光下降百分率降低越明显，说明迷迭香酸能够与NAMPT重组蛋白作用。
[0089]迷迭香酸加入交联NAMPT后，交联NAMPT的荧光强度有所下降，迷迭香酸加入量越多，交联NAMPT的荧光下降百分率降低越明显，说明迷迭香酸能够与交联NAMPT作用，因为交联NAMPT为催化中心被封堵的NAMPT重组蛋白，因此可以说明:迷迭香酸未能够与NAMPT重组蛋白催化中心发生相互作用，但是迷迭香酸能够结合于NAMPT重组蛋白催化中心以外的位点结合，迷迭香酸能够做为NAMPT非酶作用抑制剂。
[0090]实施例2:选择待选抑制剂为洋蓟素。
[0091]S1:制备NAMPT重组蛋白。
[0092]S2:将3mL浓度为200 μ M的NAMPT重组蛋白加入36mL浓度为ImM的ECET中，在温度为25°C的条件下，孵育0.5h，得到粗蛋白，采用脱盐柱除去粗蛋白中的DTT得到预处理蛋白。
[0093]S3:将预处理蛋白和240 μ L浓度为IOmM的BMB加入试管，混合均匀，在温度为20°C的条件下反应Ih后，用脱盐柱除去多余的BMB，得到交联NAMPT。
[0094]S4:预置PBS缓冲溶液，将PBS缓冲溶液分为三份:第一 PBS缓冲溶液、第二 PBS缓冲溶液和第三PBS缓冲溶液，其中，第一 PBS缓冲溶液和第二 PBS缓冲溶液的体积相同，向第一 PBS缓冲溶液中加入NAMPT重组蛋白，形成浓度为I μ M的第一蛋白溶液，将第一蛋白溶液平均装入在20支容积为5mL的第一石英管中，将20支第一石英管平均分为两组:A组、B组。
[0095]向第二 PBS缓冲溶液中加入交联NAMPT，配置浓度为I μ M的第二蛋白溶液，将第二蛋白溶液分装在20支容积为5mL的第二石英管中，将20支第二石英管平均分为两组:C
组、D组。
[0096] S5:配置浓度为2mM洋蓟素，依次向A组的第一石英管中加入洋蓟素:向第一支第一石英管中加入O μ L洋蓟素、向第二支第一石英管中加入1.5 μ L洋蓟素、向第三支第一石英管中加入3 μ L洋蓟素、向第四支第一石英管中加入5 μ L洋蓟素、向第五支第一石英管中加入7 μ L洋蓟素、向第六支第一石英管中加入10 μ L洋蓟素、向第七支第一石英管中加入20 μ L洋蓟素、向第八支第一石英管中加入25 μ L洋蓟素、向第九支第一石英管中加入35 μ L洋蓟素、向第十支第一石英管中加入50 μ L洋蓟素。每支第一石英管加入洋蓟素后，混合均匀，在温度为20°c的条件静置反应15min，得到第一分析溶液。
[0097]向B组的第一石英管中滴加第三PBS缓冲溶液，滴加的体积依次为O μ L、1.5 μ L、3μ L、5y L、7y L、10y L、20y L、25y L、35y L 和 50 μ L，每支第一石英管加入第三 PBS 缓冲溶液后，混合均匀，在温度为20°C的条件下静置15min，得到第一对照溶液。
[0098]向C组的第二石英管中加入洋蓟素:滴加的体积依次为O μ L、l.5 μ L>3 μ L>5 μ L、7 μ L>10 μ L>20 μ L>25 μ L>35 μ L和50 μ L。每支第二石英管加入洋蓟素后，混合均匀，在温度为20°C的条件下静置15min，得到第二分析溶液。
[0099]向D组的第二石英管中滴加第三PBS缓冲溶液，滴加的体积依次为O μ L、1.5 μ L、3μ L、5y L、7y L、10y L、20y L、25y L、35y L 和 50 μ L，每支第二石英管加入第三 PBS 缓冲溶液后，混合均匀，在温度为20°C的条件下静置15min，得到第二对照溶液。
[0100]S6:使用型号为HORIBA FM4的荧光光谱仪，在激发波长为280nm的条件下，分别激发第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液，测量并记录第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液在发射波长为333nm的荧光强度。
[0101]S7:计算第一待测溶液的荧光强度下降的百分率=(1-第一待分析溶液的荧光强度/第一对照溶液的荧光强度)X100% ;计算第二待测溶液的荧光强度下降的百分率=(1-第二待分析溶液的 荧光强度/第二对照溶液的荧光强度)X100%。
[0102]参见图3所示，为NAMPT重组蛋白的荧光强度百分率与加入洋蓟素摩尔量的关系图，以及交联NAMPT重组蛋白的荧光强度百分率与加入洋蓟素摩尔量的趋势图。
[0103]洋蓟素加入NAMPT重组蛋白后，NAMPT重组蛋白的荧光强度有所下降，随着洋蓟素加入量的增加，NAMPT重组蛋白的荧光下降百分率降低越明显，说明洋蓟素能够与NAMPT重组蛋白作用，。
[0104]洋蓟素加入交联NAMPT后，交联NAMPT的荧光强度有所下降，洋蓟素加入量越多，交联NAMPT的荧光下降百分率降低越明显，说明洋蓟素能够与交联NAMPT作用，因为交联NAMPT为催化中心被封堵的NAMPT重组蛋白，因此可以说明:洋蓟素未能够与NAMPT催化中心相互作用，但是可以结合NAMPT催化中心以外的位点结合，洋蓟素能够做为NAMPT非酶作用抑制剂。
[0105]实施例3:选择待选择抑制剂为1，3- 二咖啡酰奎宁酸。
[0106]S1:制备NAMPT重组蛋白。
[0107]S2:将4mL浓度为200 μ M的NAMPT重组蛋白加入浓度为5mM的Imol 二硫苏糖醇中，孵育1.5h，得到粗蛋白，采用脱盐柱除去粗蛋白中的DTT得到预处理蛋白。
[0108]S3:将预处理蛋白和160 μ L浓度为IOmM的BMB加入试管，混合均匀，在温度为22°C的条件下，反应5h后，用脱盐柱除去多余的BMB，得到交联NAMPT。
[0109]S4:预置PBS缓冲溶液，将PBS缓冲溶液分为三份:第一 PBS缓冲溶液、第二 PBS缓冲溶液和第三PBS缓冲溶液，其中，第一 PBS缓冲溶液和第二 PBS缓冲溶液的体积相同，向第一PBS缓冲溶液中加入NAMPT，配置浓度为0.5 μ M的第一蛋白溶液，将第一蛋白溶液平均装入24支体积为ImL的第一石英管中，将第一石英管平均分为两组:A组、B组。
[0110]向第二 PBS缓冲溶液中加入交联NAMPT，配置浓度为0.5 μ M的第二蛋白溶液，将第二蛋白溶液平均装入24支体积为ImL的第二石英管中，将第二石英管平均分为两组:C组、D组。
[0111]S5:配置浓度为2mMl，3_ 二咖啡酰奎宁酸溶液，向A组的每支第一石英管中加入1，3- 二咖啡酰奎宁酸溶液:向第一支第一石英管中加入O μ LI, 3- 二咖啡酰奎宁酸溶液、向第二支第一石英管中加入0.25 μ LI, 3- 二咖啡酰奎宁酸溶液、向第三支第一石英管中加入
0.5 μ LI, 3- 二咖啡酰奎宁酸溶液、向第四支第一石英管中加入I μ LI, 3_ 二咖啡酰奎宁酸溶液、向第五支第一石英管中加入1.25 μ LI, 3- 二咖啡酰奎宁酸溶液、向第六支第一石英管中加入1.75 μ LI, 3- 二咖啡酰奎宁酸溶液、向第七支第一石英管中加入2.5 μ LI, 3- 二咖啡酰奎宁酸溶液、向第八支第一石英管中加入3.75 μ LI, 3- 二咖啡酰奎宁酸溶液、向第九支第一石英管中加入5 μ LI，3- 二咖啡酰奎宁酸溶液、向第十支第一石英管中加入
5.25 μ LI, 3- 二咖啡酰奎宁酸溶液、向第十一支第一石英管中加入8.75 μ LI, 3- 二咖啡酰奎宁酸溶液、向第十二支第一石英管中加入12.5 μ LI, 3- 二咖啡酰奎宁酸溶液。每支第一石英管加入1，3- 二咖啡酰奎宁酸溶液后均摇匀，在温度为25°C的条件下静置lOmin，得到第一分析溶液。
[0112]向B组的每支第一石英管中滴加第三PBS缓冲溶液，滴加的体积依次为O μ L、
0.25yL>0.5yL>lyL>1.25yL>1.75yL>2.5yL>3.75yL>5yL>5.25yL>8.75yL 和12.5 μ L，每支第一石 英管中加入第三PBS缓冲溶液后，混合均匀，在温度为20°C的条件下静置lOmin，得到第一对照溶液。
[0113]向C组的每支第二石英管中加入1，3- 二咖啡酰奎宁酸溶液:滴加的体积依次为0yL>0.25yL>0.5yL>lyL>1.25yL>1.75yL>2.5yL>3.75yL>5yL>5.25yL>8.75yL和12.5μ L。每支第二石英管中加入1，3-二咖啡酰奎宁酸溶液后，混合均匀，在温度为20°C的条件下静置lOmin，得到第二分析溶液。
[0114]向D组的第支第二石英管中滴加第三PBS缓冲溶液，滴加的体积依次为O μ L、
0.25yL>0.5yL>lyL>1.25yL>1.75yL>2.5yL>3.75yL>5yL>5.25yL>8.75yL 和12.5 μ L，每支第二石英管加入第三PBS缓冲溶液后，混合均匀，在温度为20°C的条件下静置lOmin，得到第二对照溶液。
[0115]S6:使用型号为HORIBA FM4的荧光光谱仪，在激发波长为280nm的条件下，分别激发第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液，检测并记录第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液在发射波长为315nm~360nm的荧
光强度。
[0116]S7:计算第一待测溶液的荧光强度下降的百分率=(1-第一待分析溶液的荧光强度/第一对照溶液的荧光强度)X100% ;计算第二待测溶液的荧光强度下降的百分率=(1-第二待分析溶液的荧光强度/第二对照溶液的荧光强度)X100%。
[0117]参见图4所示，为NAMPT重组蛋白的荧光强度百分率与加入1，3_ 二咖啡酰奎宁酸摩尔量的关系图，以及交联NAMPT的荧光强度百分率与加入1，3-二咖啡酰奎宁酸摩尔量的趋势图。
[0118]I, 3- 二咖啡酰奎宁酸加入NAMPT重组蛋白后，NAMPT重组蛋白的荧光强度有所下降，随着1，3-二咖啡酰奎宁酸加入量的增加，NAMPT重组蛋白的荧光下降百分率降低越明显，说明1，3- 二咖啡酰奎宁酸能够与NAMPT作用。
[0119]1，3_ 二咖啡酰奎宁酸加入交联NAMPT后，交联NAMPT的荧光强度有所下降，1，3- 二咖啡酰奎宁酸加入量越多，交联NAMPT的荧光下降百分率降低越明显，说明1，3- 二咖啡酰奎宁酸能够与交联NAMPT作用，因为交联NAMPT为催化中心被封堵的NAMPT重组蛋白，因此可以说明:1，3-二咖啡酰奎宁酸未能够与NAMPT重组蛋白催化中心相互作用，但是能够与NAMPT催化中心以外的位点结合，I, 3- 二咖啡酰奎宁酸能够做为NAMPT非酶作用抑制剂。
[0120]实施例4，选择待选抑制剂为FK866。
[0121]S1:制备NAMPT重组蛋白。
[0122]S2:将2mL浓度为200 μ M的NAMPT重组蛋白加入1.6mL浓度为5mM的DTT ( 二硫苏糖醇)中，孵育lh，得到粗蛋白，采用脱盐柱除去粗蛋白中的DTT得到预处理蛋白。
[0123]S3:将预处理蛋白和80 μ L浓度为IOmM的BMB交联试剂加入试管，混合均匀，在温度为25°C的条件下，反应2h后，用脱盐柱除去多余的BMB，得到交联NAMPT。
[0124]S4:预置PBS缓冲溶液，将PBS缓冲溶液分为三份:第一 PBS缓冲溶液、第二 PBS缓冲溶液和第三PBS缓冲溶液，其中，第一 PBS缓冲溶液和第二 PBS缓冲溶液的体积相同，向第一 PBS缓冲溶液中加入NAMPT重组蛋白，配置浓度为0.5 μ M的第一蛋白溶液，将第一蛋白溶液平均装入30支体积为2mL的第一石英管中，将第一石英管平均分为两组:A组、B组。
[0125]向第二PBS缓冲溶液中加入交联NAMPT，配置浓度为0.5 μ M的第二蛋白溶液，将第二蛋白溶液平均装入30支体积为2mL的第二石英管中，将第二石英管平均分为两组:C组、D组。
[0126]S5:配置浓度为lmMFK866，向A组的第一石英管中加入FK866:向第一支第一石英管液中加入0mLFK866、向第二支第一石英管中加入0.5 μ LFK866、向第三支第一石英管中加入luLFK866、向第四支第一石英管中加入1.5yLFK866、向第五支第一石英管中加入2μ LFK866、向第六支第一石英管中加入3μ LFK866、向第七支第一石英管中加入4yLFK866、向第八支第一石英管中加入5yLFK866、向第九支第一石英管中加入7μ LFK866、向第十支第一石英管中加入10μ LFK866、向第十一支第一石英管中加入15μ LFK866、向第十二支第一石英管中加入20μ LFK866、向第十三支第一石英管中加入25 μ LFK866、向第十四支第一石英管中加入35 μ LFK866、向第十五支第一石英管中加入50 μ LFK866。每支第一石英管加入FK866后，混合均匀，在温度为20°C的条件下静置lOmin，得到第一分析溶液。
[0127]向B组的每份第一蛋白溶液中滴加第三PBS缓冲溶液，滴加的体积依次为O μ L、
0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、3μL、4μL、5μL、7μL、10μL、15μL、20μL、25μL、35μL和50 μ L，每支第一石英管加入PBS缓冲溶液后，混合均匀，在温度为20°C的条件下静置IOmin,得到第一对照溶液。
[0128]向C组的每份第二蛋白溶液中加入FK866:滴加的体积依次为O μ L,0.5 μ L、1 μ L、
1.5μ L、2y L、3y L、4 y L、5y L、7y L、10y L、15y L、20y L、25y L、35y L 和 50 μ L0 每支第二石英管加入FK866后，混合均匀，在温度为20°C的条件下静置lOmin，得到第二分析溶液。
[0129]向D组的每份第二蛋白溶液中滴加第三PBS缓冲溶液，滴加的体积依次为O μ L、0.5yL>lyL>1.5yL>2yL>3yL>4yL>5yL>7yL>10yL>15yL>20yL>25yL>35yL 和
50 μ L，每支第二石英管加入第三PBS缓冲溶液后，混合均匀，在温度为20°C的条件下静置IOmin,得到第二对照溶液。
[0130]S6:使用型号为HORIBA FM4的荧光光谱仪，在激发波长为280nm的条件下，分别激发第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液，检测并记录第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液在发射波长为315nm~360nm的荧光强度；
[0131]S7:计算第一待测溶液的荧光强度下降的百分率=(1-第一待分析溶液的荧光强度/第一对照溶液的荧光强度)X100% ;计算第二待测溶液的荧光强度下降的百分率=(1-第二待分析溶液的荧光强度/第二对照溶液的荧光强度)X100%。
[0132]参见图5所示，为NAMPT重组蛋白的荧光强度百分率与加入FK866摩尔量的关系图，以及交联NAMPT重组蛋白的荧光强度百分率与加入FK866摩尔量的趋势图。
[0133]FK866加入NAMPT重组蛋白后，NAMPT重组蛋白的荧光强度有所下降，随着FK866加入量的增加，NAM PT重组蛋白的荧光下降百分率降低越明显，说明FK866能够与NAMPT重组蛋白作用。
[0134]FK866加入交联NAMPT后，交联NAMPT的荧光强度保持稳定，交联NAMPT的荧光下降百分率没有降低，说明FK866不能与交联NAMPT作用，因此可以说明:FK866只能与NAMPT重组蛋白的催化中心结合，不能与NAMPT重组蛋白其他的位点结合。FK866是已知的一个NAMPT催化作用抑制剂，采用我们建立的方法，获得结果与此相符。
[0135]本发明不局限于上述实施方式，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
【权利要求】
1.一种制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤: 51、制备NAMPT重组蛋白； 52、按照摩尔份，将1份NAMPT重组蛋白加入20~100份还原剂中；在温度为20°C~25°C的条件下孵育0.5h~1.5h，得到粗蛋白；采用脱盐柱除去粗蛋白中的还原剂，得到预处理蛋白； 53、按照摩尔份，将1份预处理蛋白与2~5份1，4-双(马来酰亚胺基)丁烷混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下静置反应Ih~5h，采用脱盐柱除去未反应的1,4-双(马来酰亚胺基)丁烷，得到交联NAMPT ； 54、预置PBS缓冲溶液，将PBS缓冲溶液分为3份:第一PBS缓冲溶液、第二 PBS缓冲溶液、第三PBS缓冲溶液，所述第一 PBS缓冲溶液和第二 PBS缓冲溶液的体积相同； 向第一 PBS缓冲溶液中加入NAMPT重组蛋白，形成浓度小于50 μ M的第一蛋白溶液；将第一蛋白溶液平均装入偶数支容积为500 μ L~2mL的第一石英管中，将所述第一石英管平均分为2组:A组、B组； 向第二 PBS缓冲溶液中加入交联NAMPT，配置浓度与第一蛋白溶液相同的第二蛋白溶液；将第二蛋白溶液平均装入偶数支容积为500μ L~2mL的第二石英管中，每支第二石英管中的第二蛋白溶液的体积，与每支第一石英管中第一蛋白溶液的体积相等，将所述第二石英管平均分为两组:C组、D组； 55、配置浓度为0.5mM~1.5mM的待选择抑制剂溶液，向A组的每支第一石英管中加入体积不一的待选择抑制剂溶液，每支第一石英管中第一蛋白溶液的NAMPT重组蛋白的摩尔量:待选择抑制剂溶液的摩尔量为1:0~1:100 ;每支第一石英管加入待选择抑制剂溶液后混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下，静置5min~15min，得到第一待分析溶液； 向B组的每支第一石英管中加入体积不一的第三PBS缓冲溶液，每支第一石英管中第三PBS缓冲溶液的体积，与A组对应的第一石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同，每支第一石英管加入第三PBS缓冲溶液后混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下，静置5min~15min,得到第一对照溶液； 向C组的每支第二石英管中加入体积不一的待选择溶液，每支第二石英管中待选择抑制剂溶液的体积，与A组对应的第一石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同，混合均匀，每支第二石英管加入待选择抑制剂溶液后混合均匀后，在温度为20°C~25°C的条件下，静置5min~15min，得到第二待分析溶液； 向D组的每支第二石英管中加入体积不一的第三PBS缓冲溶液，每支第二石英管中第三PBS缓冲溶液的体积，与A组对应的第一石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同，每支第二石英管加入第三PBS缓冲溶液后，混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下，静置5min~15min,得到第二对照溶液； 56、使用荧光光谱仪测定第一待分析溶液的荧光强度、第一对照溶液的荧光强度、第二待分析溶液的荧光强度、第二对照溶液的荧光强度； 57、根据第一待分析溶液的荧光强度和第一对照溶液的荧光强度，计算第一待分析溶液荧光强度下降的百分率；根据第二待分析溶液的荧光强度和第二对照溶液的荧光强度，计算第二待分析溶液荧光强度下降的百分率。
2.如权利要求1所述的 制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，其特征在于:所述待选择抑制剂为迷迭香酸、洋蓟素、1，3- 二咖啡酰奎宁酸或FK866。
3.如权利要求1所述的制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，其特征在于:步骤S2中所述还原剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦。
4.如权利要求1所述的制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，其特征在于，步骤S2包括以下步骤:按照摩尔份将1份NAMPT重组蛋白加入浓度为ImM~5mM的30份二硫苏糖醇中，在温度为20°C~25°C的条件下孵育lh，得到粗蛋白，采用脱盐柱除去粗蛋白中未反应的二硫苏糖醇得到预处理蛋白。
5.如权利要求1所述的制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，其特征在于，步骤S3包括以下步骤:将1，4-双(马来酰亚胺基)丁烷溶解于二甲基亚砜中，形成浓度为IOmM的1，4-双(马来酰亚胺基)丁烷溶液，取120 μ LI, 4-双(马来酰亚胺基)丁烷溶液与预处理蛋白混合均匀后，在温度为20°C~25°C的条件下反应2h，采用脱盐柱除去未反应的1，4-双(马来酰亚胺基)丁烷，得到交联NAMPT。
6.如权利要求1所述的制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，其特征在于，步骤S4包括以下步骤:预置PBS缓冲溶液，将PBS缓冲溶液分为3份:第一 PBS缓冲溶液、第二 PBS缓冲溶液、第三PBS缓冲溶液，所述第一 PBS缓冲溶液和第二 PBS缓冲溶液的体积相同； 向第一 PBS缓冲溶液中加入NAMPT重组蛋白，配置浓度为0.5 μ M的第一蛋白溶液；将第一蛋白溶液平均分装于偶数支第一石英管中，将第一石英管平均分为两组:Α组、B组； 向第二 PBS缓冲溶液中加入交联ΝΑΜΡΤ，配置浓度为0.5 μ M的第二蛋白溶液；将第二蛋白溶液拼接分装于偶 数支第二石英管中，将第二石英管平均分为两组:C组、D组。
7.如权利要求1所述的制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，其特征在于，步骤S5包括以下步骤:配置浓度为0.5mM的待选择抑制剂溶液，向A组的第一石英管中依次加入体积不一的待选择抑制剂溶液，每支第一石英管中第一蛋白溶液的NAMPT重组蛋白的摩尔量:待选择抑制剂溶液的摩尔量为1:0~1:100 ;将每支第一石英管加入待选择抑制剂后，混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下，静置lOmin，得到第一待分析溶液； 向B组的第一石英管中依次加入体积不一的第三PBS缓冲溶液，第三PBS缓冲溶液的体积与加入A组的待选择抑制剂溶液的体积对应相等，每支第一石英管加入第三PBS缓冲溶液后，混合均匀，在温度为20°C~25°C的条件下，静置lOmin，得到第一对照溶液。
8.如权利要求1所述的制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，其特征在于，步骤S6包括以下步骤:使用荧光光谱仪，在激发波长为280nm的条件下，分别激发第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液，检测并记录第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液的发射波长为315nm~360nm的荧光强度； 或者使用荧光光谱仪，在激发波长为280nm的条件下，分别激发第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液，检测并记录第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液的发射波长为333nm的荧光强度。
9.如权利要求1~8任一项所述的制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，其特征在于:所述步骤S7中所述计算第一待分析溶液荧光强度下降的百分率的公式为:第一待分析溶液荧光强度下降百分率=(1-第一待分析溶液的荧光强度/第一对照溶液的荧光强度)X 100% ;所述计算第二待分析溶液荧光强度下降的百分率的公式为:第二待分析溶液荧光强度下降百分率=(1-第二待分析溶液的荧光强度/第二对照溶液的荧光强度)X100%。
10.一种用于筛选NAMPT抑制剂的交联NAMPT，其特征在于:采用权利要求1中的步骤S1、S2和S3制成。
【文档编号】C12Q1/48GK103898076SQ201410061169
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年2月24日 优先权日:2014年2月24日
【发明者】董旭, 唐淳 申请人:中国科学院武汉物理与数学研究所