一种贝氏柯克斯体核酸检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及贝氏柯克斯体核酸检测试剂盒，特别是涉及一种利用复合探针实时荧光PCR技术检测贝氏柯克斯体核酸的试剂盒。该试剂盒通过对样本中的贝氏柯克斯体进行定性检测，可应用于贝氏柯克斯体感染的辅助诊断。
【专利说明】一种贝氏柯克斯体核酸检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及贝氏柯克斯体核酸检测试剂盒，特别是涉及一种利用复合探针实时荧光PCR技术检测贝氏柯克斯体的试剂盒。该试剂盒通过对样本中的贝氏柯克斯体进行定性检测，可应用于含贝氏柯克斯体感染的辅助诊断。
【背景技术】
[0002]贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii, CB)是常见的人畜共患自然疫源性疾病Q热的病原体，是一种严格寄生活细胞的革兰阴性菌。该病原体对理化因子抵抗力强，在不同外界环境中可长期存活，在宿主细胞的吞噬溶酶体内增殖，适宜PH值为4.5~5.0。通常是通过气溶胶传播，人类和动物普遍易感，它能引发世界范围的流行。但是动物除了偶尔出现流产外，一般没有临床表现，可在人体却能引发严重的疾病。临床表现Q热主要分为两类，急性和慢性。急性q热的症状类似于流感发热，可用广谱抗生素治疗。相比之下，慢性Q热通常表现为慢性心内膜炎或肝炎，需要长时间的抗生素治疗。因其具有广泛应用性、环境稳定性和低敏感剂量，贝氏柯克斯体被认为是一种潜在的生物恐怖剂，并被美国列为B类生物占戈剂° [Levy P Y, Drancourt M, Etienne J, et al.Comparison of different antibioticregimens for therapy of32cases of Q fever endocarditis[J].Antimicrobial AgentsChemotherapy,1991,35 (3):533-537 ；Madariaga MG, Rezai K, Trenholme GM, WeinsteinRA:Q fever:a biological weapon in your backyard.Lancet Infect Dis2003,3:709-721 ；RaouIt D, Marrie T, Mege J`.Natural history and pathophysiology of Qfever.Lancet Infect Dis2005 ；5:219-26]。
[0003]许多基因的DNA序列，如27X IO3外?旲蛋白基因(coml)、异朽1橡酸脱氣酶基因(icd)、荚膜合成基因(mucZ)和传感器样基因(qrsA)基因等，已被用来从分子水平分析贝氏柯克斯体各株间的遗传相关特性。有文献报道icd序列中的碱基突变可区分来自急、慢性Q热的分离株。和其他细菌的同源不同，贝氏柯克斯体的基因是酸诱导的，这个特点可能与细菌能在宿主细胞的吞噬溶酶体恶劣的酸性环境中的复制能力有关。由于icd是一种管家基因，它并不是重要的毒性因子，不能直接把这些突变同细菌的致病性突变联系起来。这些点突变是怎样在进化过程中形成的和他们在一组特异性的贝氏柯克斯体分离株中发挥了什么作用还是未知的。由于发现icd上的突变位点会导致细胞变得更加耐酸，贝氏柯克斯体上的icd基因的突变可能会某种程度上使其不能有效的对生物体的细胞介导产生反应，从而使立克次体更好的适应特定的组织或器官。[Nguyen S V, Hirai K.Differentiationof Coxiella burnetii isolates by sequence determination and PCR restrictionfragment length polymorphism analysis of isocitrate dehydrogenase gene[J].FEMSmicrobiology letters,1999,180 (2):249-254 ;Klee S R, Tyczka J, Ellerbrok H, etal ；Guatteo R, Beaudeau F, Joly A, et al.Assessing the ffithin-herd Prevalence ofCoxiella burnetii Milk-shedder Cows using a Real-time PCR Applied to Bulk TankMilk[J].Zoonoses and public health,2007,54(5):191-194]。[0004]临床微生物实验室对贝氏柯克斯体的检测较为困难，主要原因包括:1)血清学诊断在发病一周内很难检测到抗体，而且病原分离操作复杂，且分离率十分低；2)病原学检查耗时长加之分离操作过程中存在随时致人受染的危险；3) Q热临床表现的多型以及多种并发症的可能出现，给临床诊断带来一定的困难。现将目前临床上检测贝氏柯克斯体的主要方法分述如下:
[0005]1.病原学检查从患者血、尿、痰、脑脊液和胸水中培养分离到贝氏柯克斯体。将临床标本接种豚鼠、田鼠或鸡胚。接种动物需4~6周血中方可出现特异性抗体，加之分离操作过程中存在随时致人受染的危险，故不作常规方法，必要时应对操作人员妥加防护。
[0006]2.血清学检查对本病的诊断有较大价值。常用有以下四种方法。
[0007](I)补体结合试验抗体滴度在1: 64以上为阳性。
[0008](2)微量凝集试验可在病程初期见出IgM抗体，滴度在1: 8以上为阳性；抗体仅维持10周，故对确认近期感染有价值。
[0009](3)间接免疫荧光试验适用于发病早期检测，滴度高峰出现于发病第4~8周，通常在第二周即可检测，特异性滴度在1: 16以上为阳性，而单份血清滴度则需在1: 128以上。
[0010](4) ELISA试验:于发病第2~8周时检测IgM抗体。
[0011]3.分子诊断方法:目前可用DNA探针和PCR技术检测标本中贝氏柯克斯体，特异性强，敏感性高，并可鉴别贝氏柯克斯体的急、慢性感染。其中，实时荧光PCR法则是公认的检测细菌最准确、最快捷的方法。这些技术具有更高的特异性，但需要专业的技术人员和设备才能实施，检测成本相对也较高。
[0012]本试验以贝氏柯克斯体的icd基因为靶序列，应用复合探针法建立了一种特异、灵敏、快速检测产贝氏柯克斯体的方`法。
【发明内容】
[0013]本发明的目的在于提供一种实时荧光PCR法检测贝氏柯克斯体核酸的试剂盒(下面简称试剂盒)，该试剂盒包括:(I)样本处理液A、样本处理液B、PCR反应液A、PCR反应液B、阴性对照、强阳对照、弱阳性对照。(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
[0014]为了解决上述任务，本发明的具体技术路线为:
[0015](I)针对贝氏柯克斯体基因保守序列设计的能够与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针。
[0016](2)寡核苷酸探针标记荧光发生基团，使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多聚核苷酸间接结合。
[0017](3)适宜于PCR扩增的反应体系和荧光检测体系。核酸扩增反应体系包括耐热DNA聚合酶、2’ -脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、含有镁离子和甲酰胺的缓冲液。
[0018](4)从待测样本中提取DNA，加入前述的反应体系中，直接经PCR扩增，从荧光扩增曲线判断是否存在贝氏柯克斯体。
[0019]根据本发明一个优选的实施方案，其中试剂盒的PCR反应液由10XPCR缓冲液、靶基因正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、灭菌水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是 5’ -CGTTATTTTACGGGTGTGC-3’ 和 5’ -CAGAATTTTCGCGGAAAATCA-3’ ；用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针是f:FAM-CATATTCACCTTTTCAGGCGTTTTGAC-P, q:AAGTGGAAAAGTCCGCAA-dabcyl ；PCR 反应酶系包含 Taq 酶和 UNG 酶。
[0020]根据本发明另一个优选的实施方案，阴性质控品为灭菌水；阳性质控品为通过体外重组将目的片段基因导入T载体，构建并提取重组质粒DNA，用TE液稀释-20C保存。用于实际检测中的质量控制。
[0021]根据本发明提供的试剂盒，对贝氏柯克斯体进行检测，该方法包括下列步骤:
[0022](I)用样本处理液进行阴、阳性质控品和待测样本的DNA提取。样本处理液除本发明提及的方法外，还可以使用其它成熟的DNA提取方法和试剂盒。
[0023](2)将提取的DNA加入到含有PCR反应液和PCR反应酶系的PCR反应管中，进行PCR扩增，使用荧光定量PCR检测仪进行检测。
[0024]本发明所述的试剂盒针对贝氏柯克斯体检测中的特殊性，对反应体系中引物探针浓度、Taq酶的用量、退火温度等均进行优化，结合荧光PCR技术，用于贝氏柯克斯体核酸检测，并研制出用于贝氏柯克斯体核酸检测试剂盒，灵敏度可达到IO2拷贝/ ml。
[0025]本发明与现有技术相比，具有下列优点:
[0026](I)采用的复合探针技术为国内唯一实时荧光PCR技术(专利号:ZL99125469.4，相关论文发表于Anal Biochem, 2002, 309:206-211)，是具有自主知识产权产品。特异性更
强，灵敏度更高；
[0027](2)全封闭反应，提取细菌DNA后`，直接用于PCR检测，避免了污染发生；
[0028](3)检测速度快，整个过程不超过2小时；
[0029](4)操作简单，可控性强，可进行大批量样品检测，有利于产业化；
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1显示试剂盒检测贝氏柯克斯体核酸的条件设置。
[0031]图2显示试剂盒检测贝氏柯克斯体核酸时不同浓度样本的扩增曲线，二个阳性标本的扩增曲线为S形，均能够判定为阳性。
[0032]图3显示试剂盒十个阴性标本的扩增曲线，均不具S形特征，能够判定为阴性。
[0033]图4显示强阳性对照和弱阳性对照的扩增曲线。图示扩增曲线为S型曲线，说明检测体系有效扩增了贝氏柯克斯体核酸。
[0034]图5显示阴性质控品扩增曲线。图示扩增曲线较平为直的折线，与荧光检测阈值线没有交点，且曲线不呈S型，说明检测过程中没有贝氏柯克斯体核酸的污染。
【具体实施方式】
[0035]下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
[0036]贝氏柯克斯体核酸检测试剂盒检测方法
[0037]1.样品的采集
[0038]a)采集血清:取受检者静脉血2ml，收集于无菌离心管中，室温放置不超过4小时，3000rpm离心20分钟，吸取血清转入另一无菌离心管中备用；[0039]b)采集血浆:去受检者静脉血2ml于含有抗凝剂的无菌离心管中(禁止使用肝素抗凝)，室温放置不超过4小时，3000rpm离心20分钟，分离血浆，转入无菌离心管备用。
[0040]2.核酸提取
[0041]2.1核酸提取
[0042]a)用带滤芯吸嘴吸取100 μ I样品处理液A至离心管中。
[0043]b)加入100 μ I待测样本。
[0044]c)盖上管盖，震荡混匀，1，3000rpm离心10分钟。
[0045]d)吸弃175 μ I上清(避免搅动或碰到沉淀)。
[0046]e)加入25 μ I样品处理液B。
[0047]f)充分震荡混匀，低速(2000rpm)离心数秒后，100°C干浴或沸水浴10分钟。
[0048]g)l，3000rpm离心10分钟，取上清为PCR反应模板(上清如不立即使用，需置-20°C保存,重新使用时需l,3000rpm离心10分钟)。
[0049]3.PCR 检测
[0050]3.1配制体系
[0051]a)取一支0.5ml离心管，按下列组成配制PCR反应液(N为反应管数):
[0052]PCR 反应液 A 26 μ IX (Ν+1)``[0053]PGR 反应液 B I μ IX (N+i)
[0054]按27.0μ1 /管分装至PCR反应管中。
[0055](注意:使用前确保PCR反应液充分溶解，PCR反应液B在使用前需离心以确保所有酶集中在底部)
[0056]b)加样
[0057]将3 μ I处理过的样本上清液分别加入PCR反应管中盖紧管盖，6000rpm离心Imin后放入PCR扩增仪。
[0058]扩增程序设置
[0059]Bi o-Rad、ABI7300/7500PCR扩增仪的参数设置如下
【权利要求】
1.一种实时荧光PCR法检测贝氏柯克斯体核酸的试剂盒(下面简称试剂盒)，该试剂盒包括:(I)样本处理液A、样本处理液B、PCR反应液A、PCR反应液B、阴性对照、强阳性对照、弱阳性对照；(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中试剂盒的PCR反应液由IOXPCR缓冲液、靶基因的正向引物、反向引物、寡核苷酸探针和灭菌水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是5’ -CGTTATTTTACGGGTGTGC-3’和5’ -CAGAATTTTCGCGGAAAATCA-3’。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于用于靶多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是5’ -FAM-CATATTCACCTTTTCAGGCGTTTTGAC-P-3’ 和 5’ -AAGTGGAAAAGTCCGCAA-dabcyl-3’。
3.根据权利要求1的试剂盒， 其特征还在于PCR反应酶系包含Taq酶和UNG酶。
4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于阴性质控品为灭菌水；阳性质控品为通过体外重组将目的片段基因导入PGEM-T载体，构建并提取重组质粒DNA。
【文档编号】C12Q1/68GK103882122SQ201410079181
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】陈苏红, 王升启, 罗琳, 刘志红, 孙晓彦, 刘琦琪 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所