一种土霉素高产菌株及其高通量筛选方法
【专利摘要】本发明属于微生物菌种筛选【技术领域】，具体涉及一株土霉素高产菌株及其高通量筛选方法。本发明筛选出一株土霉素高产菌株，其分类名为龟裂链霉菌（Streptomyces?rimosus）DC473，保藏在CGMCC，保藏编号为6218，保藏日期为2012年06月14日。本发明所涉及高产菌株筛选方法如下：试管斜面培养；孢子悬液制备；孢子悬液预处理；理性化筛选；高产菌株筛选；菌株复试。本发明的有益效果是：本发明以龟裂链霉菌代谢特征为依据，合理设计高通量筛选方法，可快速筛选高产菌株，简单易行，所涉及的培养基原料来源广、成本低，适合于工业生产。
【专利说明】一种土霉素高产菌株及其高通量筛选方法【技术领域】
[0001]本发明涉及工业生物技术、微生物菌种筛选【技术领域】，尤其是一种土霉素高产菌株及其高通量筛选方法。
【背景技术】
[0002]土霉素(Spectniomycni)是龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)有氧发酵后生成的次级代谢产物，为四环类广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较强的抑制能力，对多种球菌和杆菌有抗菌作用，对立克次体和阿米巴病原虫也有抑制作用，用来治疗上呼吸道感染、胃肠道感染、斑疹伤寒、恙虫病，支原体属感染和衣原体属感染等疾病。
[0003]土霉素主要用做畜禽用药及饲料添加剂，此外，以土霉素为原料生产半合成抗生素的市场前景较好，比如用其合成的强力霉素(多西霉素)，其市场价格是土霉素的5-7倍，用其为原料生产的美他环素，临床效果优于土霉素，很多企业将土霉素、维生素B1、维生素B6等组成复方土霉素，能使土霉素疗效增加，还能降低消化道副反应，是良好的动物饲料添加剂。因此，对土霉素高产菌株的选育和研究具有很好的经济效益和社会效益。
[0004]N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍(NTG)是一种超诱变剂，应用广泛，在碱性条件下，NTG会形成重氮甲烷(CH2N2 )，它是引起致死和突变的主要原因。它的效应很可能是CH2N2对DNA的烷化作用引起的诱变剂与一个或多个核酸碱基发生化学变化，使DNA复制时碱基置换而引起变异。如何从高丰度的基因突变库中快速获得目的突变子是诱变育种的关键。传统的随机筛选方法不仅费时 费力，还容易错失目的突变菌株。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种土霉素高产菌株及其高通量筛选方法。
[0006]为了完成上述目的，本发明采用的技术方案是:
[0007]一种土霉素高产菌株，分类名为龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)DC473,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC N0.6216，保藏日期是2012年6月14日。
[0008]所述的菌株单菌落为扁平梅花型、孢子白色，基内菌丝棕褐色。
[0009]一种土霉素高产菌株高通量筛选方法，包括以下步骤:
[0010]A、试管斜面培养:砂土管保藏的出发株转接试管斜面，于温度37.0±0.5°C，湿度40%-60%恒温室培养3-5天；
[0011]B、孢子悬液制备:向成熟的试管斜面中加入IOmL无菌水，将孢子刮下，混匀，制成孢子悬液，用血球计数板计数，使孢子浓度为IO12-1O14个/mL ；
[0012]C、孢子悬液预处理:取制备好的孢子悬液，加入0.5-1.5uL亚硝基胍溶液，使其终浓度为0.1%-0.3%，漩涡振荡器振荡30-60S，混匀后于37±0.5°C静置2_3h ；
[0013]D、理性化筛选:将亚硝基胍处理的孢子悬液稀释至IO1-1O7倍，稀释液涂布在含10-15 μ g/mL 土霉素及0.2-0.4 μ g/mL的链霉素分离培养基上，于37.0±0.5°C，40%_60%湿度条件下暗培养3-5天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养；
[0014]E、高产菌株筛选:在分离培养基上挑取直径在5mm以上的单菌落接种到F1斜面培养基上，于37.0±0.5°C，40%-60%湿度条件下培养3_5天；斜面成熟后接种到种子培养基中，于30.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养24_30h ;种液成熟后接种到发酵培养基中，与种子相同条件30.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养5_7天，生长到周期后检测效价，选效价高于14000u/mL的菌株进行砂土干燥保藏；
[0015]F、菌株复试:取沙土干燥保藏的菌株转接试管斜面，于37.0±0.5°C，40%_60%湿度条件下培养3-5天，斜面成熟转接至种子培养基中，于37.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养24-30h，种液成熟后转接至发酵培养基中，于于37.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养5-7天，取样检测效价，筛选保留效价高于14000u/mL的菌株。
[0016]所述步骤D中土霉素含量为10-15 μ g/mL，链霉素含量为0.2_0.4μ g/mL。
[0017]所述步骤A、步骤E和步骤F中所用的试管斜面培养基成分及其含量为:
6.0%-7.0% 麸皮，2.0%-2.5% 琼脂。
[0018]所述步骤D固体分离培养基中成分及其含量为:2.0%-3.0%玉米淀粉，0.2%_0.5%玉米浆，0.1%-0.3%硫酸铵，0.1%-0.5%碳酸钙，0.3%-0.5%氯化钠，2.0%_2.5%琼脂。
[0019]所述的步骤E 和步骤F中所用的种子培养基成分及其含量为:2.0%-3.0%玉米淀粉，0.2%-0.5% 玉米浆，2.0%-3.0% 黄豆粉，0.1%-0.3% 硫酸铵，0.1%_0.5% 碳酸钙，0.3%-0.5%氯化钠。
[0020]所述的步骤E和步骤F中所用的发酵培养基成分及其含量为:10%_15%玉米淀粉，
0.2%-0.5% 玉米浆，2.0%-3.0% 黄豆粉，1.0%-1.5% 硫酸铵，1.0%_1.5% 碳酸钙，0.3%-0.5% 氯化钠，0.01%-0.05%磷酸二氢钾，0.1%-0.3%聚醚消沫剂。
[0021]本发明的有益效果是:该菌株摇瓶发酵6天时，检测效价为18000U/mL，较出发株(相同条件下效价为14000U/mL)提高了 28.6%。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是本发明的筛选方法流程图。
[0023]图2是本发明中菌株DC473单菌落形态图。
【具体实施方式】
[0024]本发明为一种土霉素高产菌株及其高通量筛选方法，该菌株摇瓶发酵6天时，检测效价为18000U/mL，较出发株(相同条件下效价为14000U/mL)提高了 28.6%。
[0025]下面结合附图对本发明做进一步说明。
[0026]具体实施例1，如图2所示，一种土霉素高产菌株，分类名为龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus) DC473,该菌株单菌落为扁平梅花型、孢子白色,基内菌丝棕褐色，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC N0.6216，保藏日期是2012年6月14日。
[0027]一种土霉素高产菌株高通量筛选方法，如图1所示，包括以下步骤:
[0028]A、试管斜面培养:砂土管保藏的出发株转接试管斜面，于温度37.0±0.5°C，湿度40%-60%恒温室培养3-5天。斜面培养基中成分及其含量为:6.0%-7.0%麸皮，2.0%_2.5%琼脂；
[0029]B、孢子悬液制备:向成熟的试管斜面中加入一定量无菌水，将孢子刮下，混匀，制成孢子悬液，用血球计数板计数，使孢子浓度为IO12-1O14个/mL ；
[0030]C、孢子悬液预处理:取制备好的孢子悬液，加入一定量亚硝基胍溶液，使其终浓度为0.1%-0.3%，漩涡振荡器振荡30-60S，混匀后于37±0.5°C静置2_3h ；
[0031]D、理性化筛选:将亚硝基胍处理的孢子悬液进行稀释，稀释液涂布在含10-15 μ g/mL 土霉素及0.2-0.4 μ g/mL的链霉素分离培养基上，于37.0±0.5°C，40%_60%湿度条件下暗培养3-5天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养；分离培养中成分及其含量为:2.0%-3.0%玉米淀粉，0.2%-0.5%玉米浆，0.1%-0.3%硫酸铵，0.1%_0.5%碳酸钙，0.3%-0.5% 氯化钠，2.0%-2.5% 琼脂；
[0032]E、高产菌株筛选:在分离培养基上挑取直径在5mm以上的单菌落接种到Fl斜面培养基上，于37.0±0.5°C，40%-60%湿度条件下培养3_5天；斜面成熟后接种到种子培养基中，于30.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养24_30h ;种液成熟后接种到发酵培养基中，与种子相同条件30.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养5_7天，种子培养基成分及其含量为:2.0%-3.0%玉米淀粉，0.2%-0.5%玉米浆，2.0%-3.0%黄豆粉，0.1%_0.3%硫酸铵， 0.1%-0.5%碳酸钙，0.3-0.5%氯化钠；发酵培养基成分及其含量为:10%-15%玉米淀粉，0.2%-0.5% 玉米浆，2.0%-3.0% 黄豆粉，1.0%-1.5% 硫酸铵，1.0%_1.5% 碳酸钙，0.3%-0.5% 氯化钠，0.01%-0.05%磷酸二氢钾，0.1%-0.3%聚醚消沫剂；
[0033]F、菌株复试:取沙土干燥保藏的菌株转接试管斜面，于37.0±0.5°C，40%_60%湿度条件下培养3-5天，斜面成熟转接至种子培养基中，于37.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养24-30h，种液成熟后转接至发酵培养基中，于37.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养5-7天，取样检测效价，筛选保留效价高于14000u/mL的菌株；发酵培养到周期后，用比色法进行效价检测，筛选得到一株效价达18000U/mL的菌株(相同条件下效价为14000U/mL)，此菌株进行沙土干燥保藏。该高产菌株命名为DC473，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.6216，保藏日期为2012年06月14日。
[0034]具体实施例2，菌株复试
[0035]A.试管斜面培养:砂土管保藏的出发株及筛选出的高产菌株DC473分别转接试管斜面，于温度37.0±0.5°C，湿度40%-60%恒温室培养3_5天，斜面培养基中成分及其含量为:6.0%-7.0% 麸皮，2.0%-2.5% 琼脂；
[0036]B.种子培养:斜面成熟分别转接至种子培养基中，于30.0±0.5°C，220rpm条件下震荡培养24-30h ;种子培养基成分及其含量为:2.0-3.0%玉米淀粉，0.2%-0.5%玉米浆，2.0%-3.0% 黄豆粉，0.1%-0.3% 硫酸铵，0.1%-0.5% 碳酸钙，0.3%-0.5% 氯化钠；
[0037]C.发酵培养:种液成熟后分别接种到发酵培养基中，于30.0±0.5°C，220rpm条件下震荡培养3-5天，发酵培养基成分及其含量为:10%-15%玉米淀粉，0.2%-0.5%玉米浆，2.0%-3.0% 黄豆粉，1.0%-1.5% 硫酸铵，1.0%-1.5% 碳酸钙，0.3%-0.5% 氯化钠，0.01%-0.05%磷酸二氢钾，0.1%-0.3%聚醚消沫剂；
[0038]效价检测:发酵培养到周期后使用比色法对发酵单位进行检测。以上实施事例2中的实验重复进行三次，出发株三次复试发酵单位为14105U/mL、14240U/mL、14010U/mL，平均值为14118U/mL ； DC473菌株三次复试发酵单位分别为18120U/mL、18502U/mL、18370U/mL，平均值为18331U/mL.。比较DC473与出发菌株的平均效价克制，与出发株相比本发明所述的龟裂链霉菌DC473的发酵单位提高了 29.8%。
【权利要求】
1.一种土霉素高产菌株，其特征在于:分类名为龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)DC473，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC N0.6216，保藏日期是2012年6月14日。
2.根据权利要求1所述的一种土霉素高产菌株，其特征在于:所述的菌株单菌落为扁平梅花型、孢子白色，基内菌丝棕褐色。
3.—种土霉素高产菌株高通量筛选方法，其特征在于包括以下步骤: A、试管斜面培养:砂土管保藏的出发株转接试管斜面，于温度37.0±0.5°C，湿度40%-60%恒温室培养3-5天； B、孢子悬液制备:向成熟的试管斜面中加入IOmL无菌水，将孢子刮下，混匀，制成孢子悬液，用血球计数板计数，使孢子浓度为IO12-1O14个/mL ； C、孢子悬液预处理:取制备好的孢子悬液，加入0.5-1.5uL亚硝基胍溶液，使其终浓度为0.1%-0.3%，漩涡振荡器振荡30-60s，混匀后于37±0.5°C静置2_3h ； D、理性化筛选:将亚硝基胍处理的孢子悬液稀释至IO1-1O7倍，稀释液涂布在含10-15μ g/mL土霉素及0.2-0.4 μ g/mL的链霉素分离培养基上，于37.0±0.5°C，40%_60%湿度条件下暗培养3-5天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养； E、高产菌株筛选:在分离培养基上挑取直径在5mm以上的单菌落接种到F1斜面培养基上，于37.0±0.5°C，40%-60%湿度条件下培养3_5天；斜面成熟后接种到种子培养基中，于30.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养24_30h ;种液成熟后接种到发酵培养基中，与种子相同条件30.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养5_7天，生长到周期后检测效价，选效价高于14000u/mL的菌株进行砂土干燥保藏； F、菌株复试:取沙土干燥保藏的菌株转接试管斜面，于37.0±0.5°C，40%-60%湿度条件下培养3-5天，斜面成熟转接至种子培养基中，于37.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养24-30h,种液成熟后转接至发酵培养基中，于37.0±0.5°C，220rpm条件下震荡培养5_7天，取样检测效价，筛选保留效价高于14000u/mL的菌株。
4.根据权利要求3所述的一种土霉素高产菌株高通量筛选方法，其特征在于:所述步骤D中土霉素含量为10-15 μ g/mL,链霉素含量为0.2-0.4 μ g/mL。
5.根据权利要求3所述的一种土霉素高产菌株高通量筛选方法，其特征在于:所述步骤A、步骤E和步骤F中所用的试管斜面培养基成分及其含量为:6.0%-7.0%麸皮，.2.0%-2.5% 琼脂。
6.根据权利要求3所述的一种土霉素高产菌株高通量筛选方法，其特征在于:所述步骤D固体分离培养基中成分及其含量为:2.0%-3.0%玉米淀粉，0.2%-0.5%玉米浆，.0.1%-0.3% 硫酸铵，0.1%-0.5% 碳酸钙，0.3%-0.5% 氯化钠，2.0%-2.5% 琼脂。
7.根据权利要求3所述的一种土霉素高产菌株高通量筛选方法，其特征在于:所述的步骤E和步骤F中所用的种子培养基成分及其含量为:2.0%-3.0%玉米淀粉，0.2%-0.5%玉米浆，2.0%-3.0%黄豆粉，0.1%-0.3%硫酸铵，0.1%-0.5%碳酸钙，0.3%-0.5%氯化钠。
8.根据权利要求3所述的一种土霉素高产菌株高通量筛选方法，其特征在于:所述的步骤E和步骤F中所用的发酵培养基成分及其含量为:10%-15%玉米淀粉，0.2%-0.5%玉米浆，2.0%-3.0%黄豆粉，1.0%-1.5%硫酸铵，1.0%-1.5%碳酸钙，0.3%_0.5%氯化钠，.0.01%-0.05%磷酸二氢钾，0.1%-0.3%聚醚消沫剂。
【文档编号】C12N1/20GK103789245SQ201410087566
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】张慧, 赵丽红, 郑万静 申请人:河北圣雪大成制药有限责任公司