一种哺乳动物血液基因组dna提取试剂盒及提取哺乳动物血液基因组dna的方法
【专利摘要】本发明提供了一种哺乳动物血液基因组DNA提取试剂盒，由以下成分组成：红细胞裂解液、白细胞裂解液、蛋白沉淀液和DNA沉淀液。本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：1）不采用有机试剂，环保，对人体也无不良影响。2）可获得较高浓度和纯度的DNA，保留大片段DNA。3）采用“一步去除法”，操作简单，适用人群的范围广。4）操作时间短，可在短时间内获得实验所需要的DNA样品，大大提高了实验的效率。5）成本较低，价格低廉。
【专利说明】一种晡乳动物血液基因组DNA提取试剂盒及提取晡乳动物血液基因组DNA的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种哺乳动物血液基因组DNA提取试剂盒及提取哺乳动物血液基因组DNA的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]DNA提取是分子生物学研究的基础技术，目前已经发展了多种从血样中提取DNA的方法。在血液中含有大量的蛋白质及盐类，其性质与核酸的物理性质非常相似。在血样DNA提取过程中处理不当极易与DNA共同沉淀下来，并且难以分离，这将大大影响血样DNA的提取质量。
[0003]为降低或清除蛋白质及盐类对血样DNA提取的影响，现有的血样提取DNA过程中常常采用有机试剂，并需要多步操作，以尽可能地去除蛋白质及盐类。
[0004]普遍采用的方法为:
I)采用酚、氯仿抽提法来去除蛋白质和盐，通过多次抽提来提高提取的DNA样品的质量。苯酚、氯仿提取DNA是利用苯酚作为蛋白质的变性剂，反复抽提去除蛋白质。此方法可有效分离DNA和蛋白质，但使用的有机试剂挥发性大，对人体有较大的毒害性，且耗时长、导致DNA降解的可能性也相应增加。步骤也相对繁杂，所需要的操作技能较高。
[0005]2)使用SDS并配合使用纯化柱的方法进行血液DNA的提取。此方法提取时间短，但因采用纯化柱吸附，得到的DNA量较少。
[0006]在此方面，目前已公开报道的提取血液DNA的方法，主要步骤为在血样中加入细胞洗涤液，离心分离后得到残留细胞团，加入SDS、醋酸铵、盐酸胍、蛋白酶K置于60°C水浴15~30分钟，然后经纯化柱充分结合DNA，离心取沉淀物加入硅胶膜洗涤液洗涤两次，离心后加入TE缓冲液，最后得到含DNA的保存液。实验采用了纯化柱吸附的方法，能有效地增加提取的DNA浓度，保障最大程度地回收样品中的DNA。但此方法并不能保证DNA的纯度，可能会对后期的PCR等实验造成不可预估的影响。
[0007]3)利用SDS、蛋白质和K离子形成蛋白质的沉淀，并进行去除，从而得到DNA样品。这种方法主要用于提取质粒，即所称的碱裂法。但该方法得出的DNA纯度也较低。
[0008]4 )通过磁珠吸附DNA后，在磁场的作用下，DNA-磁珠复合体吸附至管底或管壁，除去上清液，再对DNA-磁珠复合体进行洗脱，来获得纯化的DNA溶液。
[0009]在此方面，目前已公开报道的磁珠法提取DNA的方法:主要通过菌体重悬、裂解、中和、磁珠结合、洗涤、洗脱几个步骤获得DNA。这种方法简单有效地提取出了 DNA。但在实际操作中操作时，需要多次的重悬，因此操作步骤较多、时间也较长。
[0010]5)通过将核酸吸附于玻璃粒子或二氧化硅粒子从而达到分离和纯化DNA的目的。
[0011]在此方面，目前已公开报道的基于二氧化硅磁性微粒的超低量DNA提取的方法。利用表面具有小尺寸的纳米级突起的二氧化硅磁性复合微粒，高效实现超低量DNA的提取。然而，采用此纯化方法同样需要多次重悬操作，以致时间较长。
[0012]同时，已公开专利中涉及的其它一些DNA提取方法，其得率、质量均不理想。为此，本发明公开了一种哺乳动物血液基因组DNA提取试剂盒及提取哺乳动物血液基因组DNA的方法。
[0013]
【发明内容】
[0014]本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种哺乳动物血液基因组DNA提取试剂盒及提取哺乳动物血液基因组DNA的方法。
[0015]本发明的哺乳动物血液基因组DNA提取试剂盒，由以下成分组成:红细胞裂解液、白细胞裂解液、蛋白沉淀液和DNA沉淀液，
其中，所述的红细胞裂解液的组成成分及各成分终浓度如下=Tris 10mM-150mM, NH4Cl100mM-300mM, EDTA 二钠盐(分子式为:CltlH14N2Na2O8CH2O) 5mM-100mM ；pH 为 7.6-8.0 ；
所述的白细胞裂解液的组成成分及各成分终浓度如下:Tris 10mM-150mM, EDTA 二钠盐(分子式为:C10H14N2Na2O8.2H20)5mM-1OOmM, 0.1%-2% (w/v)的 SDS，蛋白酶 K (0.5_4)g/L，PH 为 7.6-8.0 ；
所述的蛋白沉淀液为NaCl、CaCl2, NH4Cl和MgCl2中的一种或几种，终浓度浓度为5-6M ；
所述的DNA沉淀液的组成成分及各成分终浓度如下:NaAC 1-3M，异丙醇50%_70% (v/V)。
[0016]本发明的提取哺乳动物血液基因组DNA的方法，包括如下步骤:
1)裂解红细胞:在血样中加入红细胞裂解液，混合均匀，离心，去除上部液体后得到沉
淀；
2)裂解白细胞并去除RNA:加入白细胞裂解液，充分反应后，加入RNA酶；
3)沉淀蛋白质:加入蛋白沉淀液，离心后，取上清液；
4)沉淀DNA:加入DNA沉淀液，离心后，得DNA沉淀；
5)将DNA沉淀加入70%乙醇洗涤，洗涤干净后，离心得DNA样品。
[0017]优选地，
所述的步骤(1)中血样与红细胞裂解液的体积比为1: (31)。
[0018]所述的步骤(1)、(3)、(4)、(5)中离心时的离心速为8000~14000rpm。
[0019]所述的步骤(2)中白细胞裂解液的量为400-700μ I。
[0020]所述的步骤(3)中白细胞裂解液与蛋白沉淀液的体积比为(1-2): (1-3)。
[0021]所述的步骤(3)中上清液与DNA沉淀液的体积比为3: (4~6)。
[0022]优选地，
所述的提取哺乳动物血液基因组DNA的方法，包括如下步骤:
O红细胞裂解:
取200μ I血样、1200μ I红细胞裂解液加入到微量离心管中，颠倒混匀5min ;于12000rpm离心3min,去尽上部红色液体；
2)裂解白细胞并去除RNA:加入550 μ I白细胞裂解液，于56 °C恒温水浴20min;加入25 μ IRNA酶，室温放置2min ；
3)沉淀蛋白质
加入180 μ I蛋白沉淀液,静置5min ;于12000rpm离心5min,取上清液至新的EP管中；
4)沉淀DNA
加入DNA沉淀液1200 μ I，加异丙醇至终浓度50%-70% (v/v )，室温沉淀20min ；于12000rpm离心5min,去除上清液；
5)洗涤DNA
加入200 μ I 70%乙醇溶液,轻轻摇晃两下,室温沉淀20min ;于12000rpm离心5min,去除上清液。室温倒置干燥5min，加50 μ I双蒸水溶解。
[0023本发明的技术原理如下:红细胞裂解液成分能够有效裂解红细胞，通过离心从而有效去除了红细胞杂质。白细胞裂解液成分能够有效裂解白细胞，使DNA释放出来，从而提高了 DNA提取效率。蛋白沉淀液有效的使蛋白质沉淀，DNA保持在溶液中，从而有效的去除蛋白质杂质，提闻提取纯度。
[0024]本发明与现有技术相比，具有如下技术效果:
O不采用有机试剂，环保，对人体也无不良影响。
[0025]2)以含有蛋白酶K和SDS的白细胞裂解液，可以有效裂解细胞释放DNA，
提高DNA提取率。
[0026]3)在蛋白沉淀液中，蛋白质在高盐浓度条件下析出形成沉淀，而溶液中的阳离子与带负电的DNA结合成DNA盐，这时DNA在溶液中呈溶解状态，从而有效与蛋白杂质分离，提高DNA提取纯度。
[0027]4)本发明方法操作简单，适用范围广。
[0028]5)操作时间短，可在短时间内获得实验所需要的DNA样品，大大提高了实验的效率。
[0029]6)本发明所用红细胞裂解液、白细胞裂解液、蛋白沉淀液配方成分简单高效，价格低廉，可极大程度上减少提取成本。
[0030]
【具体实施方式】
[0031]下面通过实施例对本发明做进一步说明。说明书内实施案例提供了本发明的实施方案的事例，但不限为本发明的范围。
[0032]实施例1
本实施例的哺乳动物血液基因组DNA提取试剂盒，由以下成分组成:红细胞裂解液、白细胞裂解液、蛋白沉淀液和DNA沉淀液，红细胞裂解液的成分及各成分终浓度如下=TrisIOmM, NH4Cl IOOmM, EDTA 二钠盐5mM ；pH为7.6 ;白细胞裂解液的成分及各成分终浓度如下:Tris IOmM, EDTA 二钠盐 5mM，SDS 0.1% (w/v)，蛋白酶 K 0.5g/L, pH 为 7.6 ;蛋白沉淀液的成分及终浓度如下=NaCl 5M ;DNA沉淀液的成分及各成分终浓度如下:NaAC 1M，异丙醇50% (v/v)。
[0033]试剂盒中各个成分的配制方法如下:红细胞裂解液配制方法为:称量 Tris 1.21g (1Ommol)jNH4Cl 5.35g (100mmol), EDTA二钠盐1.86 g (5mmol)于1000mL烧杯中，加入约800mL双蒸水充分溶解后，用盐酸调制PH7.6，转至1000mL容量瓶中定容，灭菌后使用。
[0034]白细胞裂解液配制方法为:称量Tris L 21g (1Ommol)，EDTA 二钠盐 L 86 g(5mmol), SDS 1g于1000mL烧杯中，加入约800mL双蒸水充分溶解后,用盐酸调制pH7.6,转至1000mL容量瓶中定容，灭菌后加入0.5g蛋白酶K充分溶解备用。
[0035]蛋白沉淀液配制方法为:称量292.2g (5mol) NaCl，加入800mL双蒸水充分溶解后，转至1000mL容量瓶中定容，灭菌后使用。
[0036]DNA沉淀液配制方法:称量无水乙酸钠82.03g (Imol)于1000mL烧杯中，加入800mL双蒸水充分溶解后，用乙酸调节pH转至5.2，转至1000mL容量瓶中定容，灭菌后使用。异丙醇现用现加。
[0037]使用上述试剂盒提取哺乳动物血液基因组DNA，包括如下步骤:
1、红细胞裂解:
(1)取200 μ l血样、1200 μ l红细胞裂解液(RLB)加入到Eppendorf管中，颠倒混匀5min。
[0038](2)于12000rpm离心3min，去尽上部红色液体。
[0039]2、裂解白细胞并去除RNA:
(I)加入550 μ l白细胞裂解液(TB)，于56°C恒温水浴20min。
[0040](2)加入 25 μ lRNA 酶，室温放置 2min。
[0041]3、沉淀蛋白质
(I)加入180 μ l蛋白沉淀液(PB)，静置5min。
[0042](2)于12000rpm离心5min,取上清液至新的EP管中。
[0043]4、沉淀 DNA
(I)加入DNA沉淀液1200 μ l，异丙醇至终浓度50%，室温沉淀20min。
[0044](2)于12000rpm离心5min,去除上清液。
[0045]5、洗涤 DNA
加入200 μ l 70%乙醇溶液,轻轻摇晃两下,室温沉淀20min。与12000rpm离心5min,去除上清液。室温倒置干燥5min，加50 μl双蒸水溶解。
[0046]6、用紫外分光光度法测定DNA含量为283.3ng/ μl，OD260/OD280=l.85。
[0047]实施例2
本实施例的哺乳动物血液基因组DNA提取试剂盒，由以下成分组成:红细胞裂解液(RLB)、白细胞裂解液(TB)、蛋白沉淀液和DNA沉淀液，红细胞裂解液的成分及各成分终浓度如下:Tris 50mM, NH4Cl 200mM, EDTA 二钠盐50mM ；pH为7.8 ;白细胞裂解液的成分及各成分终浓度如下:Tris 50mM, EDTA 二钠盐50mM，SDS 1% (w/v)，蛋白酶K 2g/L，PH为
7.8 ;蛋白沉淀液的成分及终浓度如下:NaCl 5.5M ；DNA沉淀液的成分及各成分终浓度如下:NaAC 2M,异丙醇 60% (v/v)。
[0048]试剂盒中各个成分的配制方法如下:
红细胞裂解液配制方法为:称量 Tris 6.05g (50mmol), NH4Cl 10.7g (200mmol),EDTA二钠盐18.61 g (50mmol)于1000mL烧杯中，加入约800mL双蒸水充分溶解后，用盐酸调制pH7.8，转至1000mL容量瓶中定容，灭菌后使用。
[0049]白细胞裂解液配制方法为:称量Tris 6.05g (50mmol)，EDTA 二钠盐 18.61 g(50mmol),SDS IOg于1000mL烧杯中，加入约800mL双蒸水充分溶解后，用盐酸调制ρΗ7.8，转至1000mL容量瓶中定容，灭菌后加入2g蛋白酶K充分溶解备用。
[0050]蛋白沉淀液配制方法为:称量321.42g (5.5mol) NaCl，加入800mL双蒸水充分溶解后，转至1000mL容量瓶中定容，灭菌后使用。
[0051]DNA沉淀液配制方法:称量无水乙酸钠164.06g (2mol)于1000mL烧杯中，加入800mL双蒸水充分溶解后，用乙酸调节pH转至5.2，转至1000mL容量瓶中定容，灭菌后使用。异丙醇现用现加。
[0052]使用上述试剂盒提取哺乳动物血液基因组DNA，包括如下步骤:
1、红细胞裂解:
(1)取200 μ I血样、1200 μ I红细胞裂解液(RLB)加入到Eppendorf管中，颠倒混匀5min。
[0053](2)于12000rpm离心3min，去尽上部红色液体。
[0054]2、裂解白细胞并去除RNA:
(I)加入550 μ I白细胞裂解液(TB)，于56°C恒温水浴20min。
[0055](2)加入 25 μ I RNA 酶，室温放置 2min。
[0056]3、沉淀蛋白质
(I)加入180 μ I蛋白沉淀液(PB)，静置5min。
[0057](2)于12000rpm离心5min,取上清液至新的EP管中。
[0058]4、沉淀 DNA
(I)加入DNA沉淀液1200 μ I，异丙醇至终浓度60%，室温沉淀20min。
[0059](2)于12000rpm离心5min,去除上清液。
[0060]5、洗涤 DNA
加入200 μ I 70%乙醇溶液,轻轻摇晃两下,室温沉淀20min。与12000rpm离心5min,去除上清液。室温倒置干燥5min，加50 μ I双蒸水溶解。
[0061]6、用紫外分光光度法测定DNA含量为224.5ng/y I, OD260/OD280=l.83 实施例3
本实施例的哺乳动物血液基因组DNA提取试剂盒，由以下成分组成:红细胞裂解液(RLB)、白细胞裂解液(TB)、蛋白沉淀液和DNA沉淀液，红细胞裂解液的成分及各成分终浓度如下:Tris 150mM,NH4Cl 300mM，EDTA 二钠盐IOOmM ;pH为8.0 ;白细胞裂解液的成分及各成分终浓度如下:Tris 150mM,EDTA 二钠盐IOOmM, SDS 2% (w/v)，蛋白酶K 4g/L，PH为
8.0 ;蛋白沉淀液的成分及终浓度如下:NaCl 6M ；DNA沉淀液的成分及各成分终浓度如下:NaAC 3M，异丙醇 70% (v/v)。
[0062]试剂盒中各个成分的配制方法如下:
红细胞裂解液配制方法为:称量 Tris 18.17g (150mmol), NH4Cl 16.05g (300mmol),EDTA 二钠盐37.22 g (100 mmol)于1000mL烧杯中，加入约800mL双蒸水充分溶解后，用盐酸调制PH8.0，转至1000mL容量瓶中定容，灭菌后使用。
[0063]白细胞裂解液配制方法为:称量Tris 18.17g (150mmol)，EDTA 二钠盐 37.22g (IOOmmol), SDS 20g于1000mL烧杯中，加入约800mL双蒸水充分溶解后，用盐酸调制PH8.0，转至1000mL容量瓶中定容，灭菌后加入4g蛋白酶K充分溶解备用。
[0064]蛋白沉淀液配制方法为:称量350.64g (6mol)无水NaCl，加入800mL双蒸水充分溶解后，转至1000mL容量瓶中定容，灭菌后使用。
[0065]DNA沉淀液配制方法:称量无水乙酸钠246.09g (3mol)于1000mL烧杯中，加入800mL双蒸水充分溶解后，用乙酸调节pH转至5.2，转至1000mL容量瓶中定容，灭菌后使用。异丙醇现用现加。
[0066]使用上述试剂盒提取哺乳动物血液基因组DNA，包括如下步骤:
1、红细胞裂解:
(I)取200 μ I血样、1200 μ I红细胞裂解液(RLB)加入到Eppendorf管中，颠倒混匀5min。
[0067](2)于12000rpm离心3min，去尽上部红色液体。
[0068]2、裂解白细胞并去除RNA:
(I)加入550 μ I白细胞裂解液(TB)，于56°C恒温水浴20min。
[0069](2)加入 25 μ I RNA 酶，室温放置 2min。 [0070]3、沉淀蛋白质
(I)加入180 μ I蛋白沉淀液(PB)，静置5min。
[0071](2)于12000rpm离心5min,取上清液至新的EP管中。
[0072]4、沉淀 DNA
(I)加入DNA沉淀液1200 μ I，异丙醇至终浓度70%，室温沉淀20min。
[0073](2)于12000rpm离心5min,去除上清液。
[0074]5、洗涤 DNA
加入200 μ I 70%乙醇溶液,轻轻摇晃两下,室温沉淀20min。与12000rpm离心5min,去除上清液。室温倒置干燥5min，加50 μ I双蒸水溶解。
[0075]6、用紫外分光光度法测定DNA含量为232.4ng/ μ 1，OD260/OD280=l.85。
[0076]对照例I市售试剂盒提取DNA
用市售商业化血液DNA提取试剂盒作为对照例，按说明书步骤操作，提取DNA样品浓度测定结果为:151.5ng/y I, OD260/OD280=l.82。
[0077]从测定结果可以看出本发明方法DNA提取率及纯度均较高，且操作简单，用时较短，成本低廉。
【权利要求】
1.一种哺乳动物血液基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，由以下成分组成:红细胞裂解液、白细胞裂解液、蛋白沉淀液和DNA沉淀液， 其中， 所述的红细胞裂解液的组成成分及各成分终浓度如下=Tris 10mM-150mM, NH4Cl100mM-300mM, EDTA 二钠盐(分子式为:CltlH14N2Na2O8CH2O) 5mM-100mM ；pH 为 7.6-8.0 ； 所述的白细胞裂解液的组成成分及各成分终浓度如下:Tris 10mM-150mM, EDTA 二钠盐(分子式为:C10H14N2Na2O8.2H20)5mM-1OOmM, 0.1%-2% (w/v)的 SDS，蛋白酶 K (0.5_4)g/L，PH 为 7.6-8.0 ； 所述的蛋白沉淀液为NaCl、CaCl2, NH4Cl和MgCl2中的一种或几种，终浓度浓度为5-6M ； 所述的DNA沉淀液的组成成分及各成分终浓度如下:NaAC 1-3M，异丙醇50%_70% (v/V)。
2.使用如权利要求1所述的哺乳动物血液基因组DNA提取试剂盒提取哺乳动物血液基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)裂解红细胞:在血样中加入红细胞裂解液，混合均匀至溶液清亮，离心，去除上部液体后得到沉淀； 2)裂解白细胞并 去除RNA:加入白细胞裂解液，充分反应后，加入RNA酶； 3)沉淀蛋白质:加入蛋白沉淀液，离心后，取上清液； 4)沉淀DNA:加入DNA沉淀液，离心后，尽去上清液； 5)将DNA沉淀加入70%乙醇洗涤，洗涤干净后，离心得DNA样品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中血样与红细胞裂解液(RLB)的体积比为1: (3~8)。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)、(3)、(4)、(5)中离心时的离心速为8000~14000rpm。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中白细胞裂解液(TB)的量为 400-700μ I。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中白细胞裂解液与蛋白沉淀液的体积比为(1-2): (1-3)。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中上清液与DNA沉淀液的体积比为3: (4~6)。
8.根据权利要求2所述的提取哺乳动物血液基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)红细胞裂解: 取200μ I血样、1200μ I红细胞裂解液加入到微量离心管中，颠倒混匀5min ;于12000rpm离心3min,去尽上部红色液体； 2)裂解白细胞并去除RNA: 加入550 μ I白细胞裂解液，于56 V恒温水浴20min ;加入25 μ IRNA酶，室温放置2min ； 3)沉淀蛋白质加入180 μ I蛋白沉淀液,静置5min ;于12000rpm离心5min,取上清液至新的EP管中； 4)沉淀DNA 加入DNA沉淀液1200 μ1，加异丙醇至终浓度50%-70% (v/v )，室温沉淀20min ；于12000rpm离心5min,去除上清液； 5)洗涤DNA 加入200 μ1 70%乙醇溶液,轻轻摇晃两下,室温沉淀20min ;于12000rpm离心5min,去除上清液；室温倒置干燥5min，加50 μ 1双蒸水溶解。
【文档编号】C12N15/10GK103898096SQ201410118427
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】潘海波, 邢楠楠, 谢阳, 华琴 申请人:江苏佰龄全基因生物医学技术有限公司