古尼拟青霉提取物的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种古尼拟青霉提取物的制备方法，其包括液体菌种发酵步骤、固体发酵步骤和发酵培养物的提取步骤；所述液体菌种发酵包括一级种子罐发酵和二级种子罐发酵；所述固体发酵为将灭菌后的固体培养基与经液体发酵菌种混合培养，干燥，粉碎。该制备方法中，所用古尼拟青霉培养方式为液-固双相发酵，且固体发酵工艺根据古尼拟青霉的微生物生长曲线，对不同生长期制定不同的环境温度和湿度，生产周期约3-5天，低于常规培养周期的10天左右，同时解决了“发菌期时间长易污染”和“对数期生长过快散热不及时易烧菌”的问题。本发明通过液固双相发酵方法大规模人工生产，成本得到大幅度降低。
【专利说明】古尼拟青霉提取物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及古尼拟青霉提取物的制备方法，属于生物制品的提取制备【技术领域】。
【背景技术】
[0002]古尼拟青霉(Paecilomycesgunnii )为麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)的真菌；其所含活性物质与冬虫夏草等虫草子实体相似，具有重要经济价值。拟青霉酮是从一种拟青霉(Paecilomyces sp.)培养物中分离制备得到的具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的生物活性物质。酪氨酸酶兼有加氧酶和氧化酶的双重功能，在黑色素合成过程中起关键作用。它能够把单酚催化成二酚，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素。具有抑制酪氨酸酶活性的生物活性物质可通过抑制酪氨酸酶活性而抑制黑色素生成，因而可用来预防和治疗色素沉着和黑色素瘤等，在医药和日用化学品等领域有着广阔的应用前景。自由基(free radical)，从化学结构上看是指含未配对电子的基团、原子或分子。自由基具有高度化学活性。对于生命体来说，自由基是生命活动中多种生化反应的中间产物。在正常情况下，人体内的自由基是处于产生与清除的动态平衡之中。自由基是机体有效的防御系统，如不能维持一定水平的自由基则会对机体生命活动带来不利影响。但自由基产生过多或清除过慢，它通过攻击生命大分子物质及各种细胞器，会造成机体分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。最新的研究表明，人类的衰老及许多疾病都与自由基损伤有关。具有清除自由基活性的物质能与自由基反应并使之还原成非自由基化合物，可清除机体代谢过程中产生的过多的自由基，是一种可增进人体健康的重要活性物质。自由基清除剂在非生命体系中有抗氧化作用，能够有效地阻止物质的氧化败坏，对于延长物品的保质期有着重要作用，被广泛用于食品、药品、日用化学品等中。古尼拟青霉(Paecilomyces gunnii)现虽已有多种生产方法，但是大多生产周期较长，成本较高，不能满足规模需求。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种生产周期短、资源利用率高的古尼拟青霉提取物的制备方法。
[0004]本发明的古尼拟青霉提取物的制备方法，包括液体菌种发酵步骤、固体发酵步骤和发酵培养物的提取步骤；所述液体菌种发酵包括一级种子罐发酵和二级种子罐发酵；所述固体发酵为将灭菌后的固体培养基与经液体发酵菌种混合培养，干燥，粉碎。
[0005]所述一级种子罐发酵是指:在50L气升式发酵罐中装入约35L液体培养基，121°C~126°C灭菌30分钟；灭菌后，冷却至23°C时接种，培养温度为23°C，通气量为1:1V/V.min，保压0.05~0.1MPa，经24h通气培养，达到对数生长期后即可；
所述二级种子罐发酵是指:在500L种子罐中装入350L液体培养基，121°C~126°C灭菌30分钟；灭菌后，冷却至23°C，将一级种子罐所得的液体种子全部接入二级种子罐培养，培养温度23°C，通气量为1:1 v/v.π?η，保压0.05~0.1MPa，经过24h通气培养，达到对数生长期后即可；
所述固体发酵是向固体培养基加入固体培养基质量40%~60%的水，拌匀后灭菌；将灭菌后的固体培养基于无菌通风室中冷却至25-30°C，以接种量25%~50%接入经二级种子罐发酵后的液体菌种；将接种后的物料平铺在带孔浅盘中放入培养室中培养；培养72小时后出料、烘干、粉碎即得成品。
[0006]所述一级种子罐发酵和二级种子罐发酵所用液体培养基中包括下述质量配比的原料:黄豆粉3%、白砂糖3%、玉米粉1%、酵母粉1%、酵母浸出粉1%、蚕蛹粉0.5%、MgS040.05%、KH2PO40.05%、消泡剂 0.05%、水余量。
[0007]所述液体培养基用碱调pH值为6-7为佳。
[0008]所述固体培养基原料质量配比优选为:玉米粉65%、豆柏25%、麸皮10%。
[0009]所述固体发酵时，培养72小时出料、烘干、粉碎后，过300目筛为佳。
[0010]所述固体发酵在培养室中培养时，培养室内温湿度条件优选为:于0~24小时内保持在28°C，于24~48小时内保持在16°C，于48~72小时内保持在20°C ;培养室湿度于0-24小时内保持在100%，于24~48小时内保持在90%，于48~72小时内保持在60%。古尼拟青霉菌(Paecilomyces gunnii)作为一种微生物有其生长的四个个阶段:适应期(发菌期)、对数增长期、稳定期、衰亡期。根据古尼拟青霉菌(Paecilomyces gunnii)在固体培养基上生长的不同阶段所需要的最适温度，通过恒温恒湿空调将培养室内温度0-24小时保持在28°C，24~48小时保持在16°C，48~72小时保持在20°C。培养室湿度0~24小时保持在100%，24~48小时保持在90%，48~72小时保持在60%。培养72小时。
[0011]所述发酵培养物的提取是指，将粉碎至100~300目的固体培养物用乙醇提取、离心、浓缩滤液并干燥得到古尼拟青霉提取物。
[0012]所述固体培养物优先选用乙醇提取时的料液质量比为1:5、提取时间为24~48小时。
[0013]所述离心处理后的滤液在30_60°C下浓缩到原体积的1/5~1/10，并将浓缩物在不高于100°C条件下干燥为佳。
[0014]本发明的古尼拟青霉提取物的制备方法中，所用古尼拟青霉培养方式为液-固双相发酵，且固体发酵工艺根据古尼拟青霉的微生物生长曲线，对不同生长期制定不同的环境温度和湿度，生产周期约3-5天，低于常规培养周期的10天左右，同时解决了 “发菌期时间长易污染”和“对数期生长过快散热不及时易烧菌”的问题。本发明通过液固双相发酵方法大规模人工生产，成本得到大幅度降低。
【具体实施方式】
[0015]下述实施例是对于本
【发明内容】
的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
[0016]实施例1
本发明的古尼拟青霉提取物的制备方法，包括下述生产工序:
A、一级种子罐生产
在50L气升式发酵罐中装入约35L液体培养基，121°C~126°C灭菌30分钟；灭菌后，冷却至23°C时接种，培养温度为23°C，通气量为1:1 v/v.π?η，保压0.05~0.1MPa，经24h通气培养，达到对数生长期后即可；
一级种子罐液体培养基原料质量配比为:黄豆粉3%、白砂糖3%、玉米粉1%、酵母粉1%、酵母浸出粉1%、蚕蛹粉0.5%、MgSO40.05%、KH2PO40.05%、消泡剂0.05%、余量的水，并用饱和NaOH (氢氧化钠)调pH值为6.5。
[0017]B、二级种子罐生产
在500L种子罐中装入350L液体培养基，121°C~126°C灭菌30分钟；灭菌后，冷却至23°C，将一级种子罐所得的液体种子全部接入二级种子罐培养，培养温度23°C，通气量为1:1 v/v.π?η，保压0.05~0.1MPa，经过24h通气培养，达到对数生长期后即可；
二级种子罐液体培养基原料重量配比为:黄豆粉3%、白砂糖3%、玉米粉1%、酵母粉1%、酵母浸出粉1%、蚕蛹粉0.5%、MgSO40.05%、KH2PO40.05%、消泡剂0.05%,余量的水，并用饱和NaOH (氢氧化钠)调pH值为6.5。
[0018]C、菌种的固体发酵按如下方法进行:
在100kg培养基中含玉米粉650kg、豆柏250kg、麦麸100kg。将固体物料混合均匀后，加入适量的水约550kg拌匀装入布袋中灭菌；抽真空式灭菌锅灭菌30分钟。在无菌通风室中冷却至28°C以35% (质量)的接种量接入液体菌种；将接种后的物料平铺在带孔浅盘中放入培养室中培养；通过恒温恒湿空调将培养室内温度0-24小时保持在28°C，24~48小时保持在16°C，48~72小时保持在20°C。培养室湿度0~24小时保持在100%，24~48小时保持在90%，48~72小时保持在60%。培养72小时即可出料；烘干、粉碎、过300目筛。
[0019]D、发酵培养物的提取:
将粉碎至100~300目的固体培养物用乙醇提取(料液质量比为1:5)，提取时间为24~48小时，然后在转速2000转/分钟条件下离心，离心处理后的滤液在40°C下浓缩到原体积的1/8，并将浓缩物在60°C条件下干燥得到浅黄绿色的古尼拟青霉提取物。
【权利要求】
1.古尼拟青霉提取物的制备方法，包括液体菌种发酵步骤、固体发酵步骤和发酵培养物的提取步骤；所述液体菌种发酵包括一级种子罐发酵和二级种子罐发酵；所述固体发酵为将灭菌后的固体培养基与经液体发酵菌种混合培养，干燥，粉碎。
2.根据权利要求1所述的古尼拟青霉提取物的制备方法，其特征在于， 所述一级种子罐发酵是指:在50L气升式发酵罐中装入约35L液体培养基，121°C~126°C灭菌30分钟；灭菌后，冷却至23°C时接种，培养温度为23°C，通气量为1:1 V/V -min,保压0.05~0.1MPa,经24h通气培养，达到对数生长期后即可； 所述二级种子罐发酵是指:在500L种子罐中装入350L液体培养基，121°C~126°C灭菌30分钟；灭菌后，冷却至23°C，将一级种子罐所得的液体种子全部接入二级种子罐培养，培养温度23°C，通气量为1:1 v/v.π?η，保压0.05~0.1MPa，经过24h通气培养，达到对数生长期后即可； 所述固体发酵是向固体培养基加入固体培养基质量40%~60%的水，拌匀后灭菌；将灭菌后的固体培养基于无菌通风室中冷却至25-30°C，以接种量25%~50%接入经二级种子罐发酵后的液体菌种；将接种后的物料平铺在带孔浅盘中放入培养室中培养；培养72小时后出料、烘干、粉碎即得成品。
3.根据权利要求2所述的古尼拟青霉提取物的制备方法，其特征在于，所述一级种子罐发酵和二级种子罐发酵所用液体培养基中包括下述质量配比的原料:黄豆粉3%、白砂糖3%、玉米粉1%、酵母粉1%、酵母浸出粉1%、蚕蛹粉0.5%、MgSO40.05%、KH2PO40.05%、消泡剂0.05%、水余量。
4.根据权利要求3所述的古尼拟青霉提取物的制备方法，其特征在于，所述液体培养基用碱调PH值为6-7。
5.根据权利要求2所述的古尼拟青霉提取物的制备方法，其特征在于，所述固体培养基原料质量配比为:玉米粉65%、豆柏25%、麸皮10%。
6.根据权利要求2所述的古尼拟青霉提取物的制备方法，其特征在于，所述固体发酵时，培养72小时出料、烘干、粉碎后，过300目筛。
7.根据权利要求2所述的古尼拟青霉提取物的制备方法，其特征在于，所述固体发酵在培养室中培养时，培养室内温湿度条件为:于0-24小时内保持在28°C，于24~48小时内保持在16°C，于48~72小时内保持在20°C;培养室湿度于0-24小时内保持在100%，于24~48小时内保持在90%，于48~72小时内保持在60%。
8.根据权利要求1所述的古尼拟青霉提取物的制备方法，其特征在于，所述发酵培养物的提取是指，将粉碎至100~300目的固体培养物用乙醇提取、离心、浓缩滤液并干燥得到古尼拟青霉提取物。
9.根据权利要求8所述的古尼拟青霉提取物的制备方法，其特征在于，所述固体培养物用乙醇提取时的料液质量比为1:5、提取时间为24~48小时。
10.根据权利要求8所述的古尼拟青霉提取物的制备方法，其特征在于，所述离心处理后的滤液在30-60°C下浓缩到原体积的1/5~1/10，并将浓缩物在不高于100°C条件下干燥。
【文档编号】C12P1/02GK104073520SQ201410154665
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】史晓宇, 谢韬, 樊美珍, 黄勃 申请人:安徽康智生物科技有限责任公司