复合菌剂及其应用以及利用其制备有机肥的方法

复合菌剂及其应用以及利用其制备有机肥的方法
【专利摘要】本发明公开了一种复合菌剂，其活性成分包含枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、康宁木霉、米曲霉、绿色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳杆菌CICC20768和褐球固氮菌。相应地，本发明还公开了一种复合菌剂制备有机肥的方法，包括以下步骤：a.将复合菌剂与植物类纤维原料混合均匀，得到发酵原料；b.将发酵原料进行堆肥发酵；c.将堆肥后的发酵原料干燥得到有机肥。复合菌剂所包含的微生物之间不产生拮抗作用，能够在有机肥的生产过程中有效地合作，充分利用生产原料的各化学组分，最终生产出高品质的有机肥。得到的有机肥符合国家标准(NY884-2012)的参数指标，能够改善土壤种植性状，有利于土壤微生物菌群组成的优化，提供全方面的植物根系营养。
【专利说明】复合菌剂及其应用以及利用其制备有机肥的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及复合菌剂及其应用以及利用其制备有机肥的方法，复合菌剂可以应用于植物纤维类废弃物快速资源化处理，尤其是木薯酒糟的快速资源化处理。
【背景技术】
[0002]农业废弃物是指在整个农业生产过程中被丢弃的有机类物质，目前我国每年产生的农业废弃物以几十亿吨计。其中农林生产过程中产生的植物类残余废弃物占据了很大的一部分比重，而且是所有农业废弃物中最难被利用的一种。
[0003]作为农业废弃物中比重较高的植物纤维类废弃物，其来源广泛，比如在农业生产过程中残留的作物秸杆、园林废弃物、树皮、果壳、蔗渣和酒糟渣等。这一大类农业废弃物的化学组成主要包括纤维素、半纤维素和木质素，具有产量大、可再生、再生周期短和环境友好等特点。将植物纤维类废弃物进行堆肥化处置回归到农业再利用是一种重要的农业废弃物资源化处理手段。其通过高温好氧堆肥发酵、厌氧发酵和好氧厌氧结合的多种发酵方式，将植物纤维类废弃物进行快速腐熟、稳定和干燥，制备成能够改良土壤性状、提高土壤耕地性能和提升农产品作物品质的有机肥。
[0004]植物纤维类废弃物的有机肥化随着技术手段的提升和产品利用价值的提升，越来越受到各行业的关注，其生产工艺也在不断地优化和改进之中。而高效的堆肥菌剂又是植物纤维类废弃物堆肥生产有机肥技术的关键与核心。高效的堆肥发酵菌剂包含能够快速有效降解纤维类废弃物中难 以被利用的纤维素、半纤维素和木质素等物质，使其能够更好地改良土壤、培肥地力。与此同时降解的纤维类物质为菌剂中其他菌种提供能量来源，产生对作物有利的氣基酸和糖类等有益物质。闻效菌剂所制备的有机肥，其活菌数闻，施用该有机肥能够促进土壤微生物的活动，促进作物根系对土壤中营养的吸收，最终达到增产增质的效果。
[0005]目前，已有专利涉及植物纤维类废弃物发酵有机肥菌剂获得授权。ZL200910233577.6公开了一种农业废弃物快速堆肥菌剂及其生产有机肥的方法，通过一株能在50°C下快速分解各种富含纤维素废弃物的菌株NJZS对纤维类废弃物进行堆肥发酵得到有机肥。ZL200810224244.2公开了一种用于降解秸杆的菌剂，其活性成分主要包括绿色木霉 CICC40502 (Trichodermaviride)、黄绿木霉(Trichodermaaureoviride)和饲料类芽孢杆菌(Paenibacilluspabuli)三种菌种，能够快速腐熟稻杆制备有机肥。ZL00121101.3公开了一种有机物快速腐熟菌剂，其由7株纤维素分解菌和载体组成，适用于肥的快速腐熟生产。
[0006]以上公开的有机肥菌剂相关方面的专利均能够提供快速腐熟有机肥生产原料的特性，达到缩短有机肥发酵周期的目的。但是在实际生产中，由于有机肥的生产原料来源不同，每批次的碳氮比、PH值和物理性状组成等重要发酵条件都不同，仅仅依赖单一或少量的菌株组成的发酵菌剂，很难保证每批次产品品质的稳定，难以实现高品质的有机肥大规模化生产。有鉴于此，有必要提供一种复合菌剂，能够在有机肥的生产过程中有效地合作，将不同来源的原料统一发酵成高品质的有机肥产品。

【发明内容】

[0007]本发明的目的是提供一种能够在有机肥的生产过程中有效地合作，将不同来源的原料统一发酵成高品质的有机肥产品的复合菌剂及其应用以及利用其制备有机肥的方法。
[0008]为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种复合菌剂，其活性成分包含枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)、巨大芽抱杆菌(BaciIIusmegaterium)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、米曲霉(AspergillusOryzae)、绿色木霉(Trichodermaviride)、白地霉(Geotrichumcandidum)、黑曲霉(AspergiIIusniger)、少抱根霉(Rhizopusoligosporus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和圆褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)。其中，枯草芽孢杆菌能够在高温堆肥阶段继续存活,并且产生大量的蛋白酶、纤维素酶、糖酶等水解酶系对原料进行充分水解，同时枯草芽孢杆菌还能对主要的土传病原菌通过拮抗作用进行有效抑制。巨大芽孢杆菌能够在生长过程中产生大量的有机酸，可将土壤中的难容的含磷物质分解或溶解，转化成容易被植物吸收的磷元素，提高磷的利用率。同时巨大芽孢杆菌在增殖过程中能够释放出高活性的分解酵素及多种促进因子，促进植物养分的吸收，提高肥效。圆褐固氮菌作为一种自生固氮菌，具有将强的固氮能力，同时也可以分泌生长素，促进植株的生长和果实的发育。康宁木霉、米曲霉、绿色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉能够产生高活力的纤维素酶、糖化酶和蛋白酶，可以降解堆肥原料中的纤维素、半纤维素和蛋白质等主要组分。
[0009]本发明的复合菌剂由多种微生物组成，包含了好氧和厌氧，细菌和真菌，纤维降解菌、固氮菌和产益生元菌等多种有效微生物，能够将不同来源的原料统一发酵成高品质的有机肥产品。本发明所提出的复合菌剂经过多次筛选得到，所包含的微生物之间不产生拮抗作用，能够在有机肥的生产过程中有效地合作，充分利用生产原料的各化学组分，最终生广出闻品质的有机肥。
[0010]需要说明的是，本发明的实施例采用的菌种来自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，其编号为:枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580、康宁木霉CICC40108、米曲霉 CICC2148、绿色木霉 CICC40502、白地霉 CICC3152、黑曲霉 CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳杆菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0011]在一些实施方式中，复合菌剂的制备方法包括以下步骤:
[0012]i活化培养:将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、康宁木霉、米曲霉、绿色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳杆菌和圆褐固氮菌分别取I~2环菌种接种至对应的活化培养基进行活化培养，得到各菌种的活化菌种液；
[0013]ii扩大培养:将各菌种的活化菌种液按1% (V/V)的接种量分别接种到对应的扩大培养基中，进行扩大培养得到各菌种的种子液；
[0014]iii固体培养:将各菌种的种子液等体积混合，按10% (V/ff,ml/g)的接种比例接种到固体培养基中，在28~30°C下培养2~3天，然后在37~40°C下培养2~3天，得到固体种子；
[0015] iv固体扩大培养:将固体种子按5% (W/W)接种比例添加到固体扩大培养基中，在30°C下培养3~5天，然后在37~40°C下培养3~5天，最后在50~55°C下干燥至含水量低于20%,得到复合菌剂。
[0016]本发明的复合菌剂通过活化、扩大培养、固体培养和固体扩大培养多个步骤制备而成，制备方法简单、易于实现，多级活化和扩大培养使得复合菌剂的活菌含量高，最终得到的固体复合菌剂能够维持长时间的高活菌率，非常适合大规模生产和应用。
[0017]在一些实施方式中，在步骤i中，各菌种的活化培养基重量百分比计的配方及培养条件如下:
[0018]枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌分别进行活化培养的第一活化培养基配方为:牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5 %、余量为去离子水、pH7.4~7.6，培养条件为:转速150-200r/min、35-37°C、15 ~18h ；
[0019]康宁木霉、米曲霉、绿色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉分别进行活化培养的第二活化培养基配方为:马铃薯20%、葡萄糖2%、余量为去离子水、pH自然，培养条件为:转速100 ~150r/min、28-30°c、24 ~28h ；
[0020]植物乳杆菌进行活化培养的第三活化培养基配方为:蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5 %、柠檬酸氢二铵0.2 %、葡萄糖2 %、吐温0.1 %、乙酸钠0.5 %、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.58%。、硫酸锰0.25%。、余量为去离子水、pH6.2~6.6，培养条件:35-37°C>24~28h、静置培养；
[0021]圆褐固氮菌进行活化培养的第四活化培养基配方为:葡萄糖1%、磷酸二氢钾0.2%。、氯化钠0.2%。、硫酸镁0.2%。、硫酸钙0.2%。、碳酸钙0.5%、余量为去离子水、pH7.0~
7.2，转速 150-200r/min、35-37°C、15 ~18h。
[0022]上述各菌种分开进行活化培养，每个菌种的活化培养都具有对应的活化培养基配方及培养条件，能够使各菌种快速活化。其中，吐温为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，简称聚山梨酯(Polysorbate)。
[0023]在一些实施方式中，在步骤ii中，各菌种的扩大培养基重量百分比计的配方及培养条件如下:
[0024]枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌分别进行扩大培养的第一扩大培养基配方为牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量为去离子水、pH7.4~7.6，培养条件为:转速150~200r/min、35-37°C、15 ~18h ；
[0025]康宁木霉、米曲霉、绿色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉进行扩大培养的第二扩大培养基配方为:马铃薯20%、葡萄糖2%、余量为去离子水、pH自然，培养条件为:转速100 ~150r/min、28 ~30°C、24 ~28h ；
[0026]植物乳杆菌进行扩大培养的第三扩大培养基配方为:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5 %、柠檬酸氢二铵0.2 %、葡萄糖2 %、吐温0.1 %、乙酸钠0.5 %、磷酸氢二钾0.2 %、硫酸镁0.58%。、硫酸锰0.25%。，余量为去离子水，pH6.2~6.6，培养条件为:35-37 0C >24~28h、静置培养；
[0027]圆褐固氮菌进行扩大培养的第四扩大培养基配方为:葡萄糖1%、磷酸二氢钾
0.2%。、氯化钠0.2%。、硫酸镁0.2%。、硫酸钙0.2%。、碳酸钙0.5%、余量为去离子水，pH7.0~
7.2，培养条件为:转速 150 ~200r/min、35-37°C、15 ~18h。
[0028]上述各菌种分开进行扩大培养，每个菌种的扩大培养都具有对应的扩大培养基配方及培养条件，能够使各菌种快速增殖，缩短扩大培养时间。其中，吐温为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，简称聚山梨酯(Polysorbate)。
[0029]在一些实施方式中，在步骤iii中:固体培养基为木薯酒糟或木薯酒糟与豆柏按5~8:1 (W/W)混合或木薯酒糟、豆柏和秸杆按5~8:1:1 (W/W)混合。
[0030]在一些实施方式中，在步骤iv中:固体扩大培养基为木薯酒糟或木薯酒糟与豆柏按5~8:1 (W/W)混合或木薯酒糟、豆柏和秸杆按5~8:1:1 (W/W)混合。
[0031]在一些实施方式中，豆柏的粗蛋白含量>43%，从而使固体培养基或固体扩大培养基具有充分的蛋白含量。
[0032]相应地，本发明还提供了一种利用上述复合菌剂制备有机肥的方法，包括以下步骤:[0033]a按添加比例I~5 % (W/W)，将复合菌剂与植物类纤维原料混合均匀，得到发酵原料，其中，发酵原料的水分含量为50~60%、pH6.0~8.5，复合菌剂的活性成分包含枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、康宁木霉、米曲霉、绿色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳杆菌和圆褐固氮菌；
[0034]b将发酵原料进行堆肥发酵，当发酵环境的温度在30°C以下时，堆肥的时间为20~25天，当发酵环境在温度在30°C以上时，堆肥的时间为15~20天。在发酵过程中，每隔3~4天翻料一次；
[0035]c将堆肥后的发酵原料于50°C下干燥至水分含量低于30%，即得到有机肥。
[0036]上述制备有机肥的方法，利用复合菌剂对植物类纤维原料进行堆肥发酵，发酵周期短，条件温和，易于实现。复合菌剂中的多种活性菌能够对不同来源的植物纤维类原料进行高效快速分解，使得自身得到快速增殖，因此在生产有机肥的发酵过程中需要调控的步骤较为简单，操作方便。得到的有机肥中的有机质的质量分数(以烘干基计)大于45%，总养分(氮+五氧化二磷+氧化钾)的质量分数(以烘干基计)大于5%，水分的质量分数小于30%，PH值:5.5~8.5，符合国家标准(NY884-2012)的参数指标。得到的有机肥能够改善土壤种植性状，有利于土壤微生物菌群组成的优化，提供全方面的植物根系营养，促进植物生长，提升作物产量。
[0037]相应地，本发明还提供了上述复合菌剂在制备有机肥的应用。复合菌剂所包含的微生物之间不产生拮抗作用，能够在有机肥的生产过程中有效地合作，充分利用生产原料的各化学组分，最终生产出高品质的有机肥。
[0038]本发明的有益效果为:复合菌剂由多种微生物组成，包含了好氧和厌氧，细菌和真菌，纤维降解菌、固氮菌和产益生元菌等多种有效微生物，能够将不同来源的原料统一发酵成高品质的有机肥产品。本发明所提出的复合菌剂所包含的微生物之间不产生拮抗作用，能够在有机肥的生产过程中有效地合作，充分利用生产原料的各化学组分，最终生产出高品质的有机肥。利用复合菌剂制备有机肥可以实现植物纤维类废弃物资源化处理，得到的有机肥中的有机质的质量分数(以烘干基计)大于45%，总养分(氮+五氧化二磷+氧化钾)的质量分数(以烘干基计)大于5%，水分的质量分数小于30%，？!1值:5.5~8.5，完全达到有机肥国家标准的要求。且生产周期短、工艺稳定。
【具体实施方式】
[0039]下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。[0040]实施例1
[0041]复合菌剂，其活性成分包含枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580、康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳杆菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0042]复合菌剂的制备:
[0043]i活化培养:将储存于4°C冰箱的斜面菌种:枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580、康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳杆菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分别取I环菌种接种至对应的500ml活化培养基进行活化培养，得到各菌种的活化菌种液。其中，活化培养的培养方式为摇瓶培养。
[0044]各菌种的活化培养基重量百分比计的配方及培养条件如下:
[0045]枯草芽孢杆菌CICC21082和巨大芽孢杆菌CICC21580分别进行活化培养的第一活化培养基配方为:牛肉膏0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量为去离子水、pH7.4，培养条件为:转速 150r/min、35°C、15h ；
[0046]康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分别进行活化培养的第二活化培养基配方为:马铃薯20%、葡萄糖2%、余量为去离子水、pH自然，培养条件为:转速100r/min、28°C、24h ；
[0047]植物乳杆菌CICC20768进行活化培养的第三活化培养基配方为:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、葡萄糖2 %、吐温0.1 %、乙酸钠0.5 %、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.58%。、硫酸锰0.25%。、余量为去离子水、pH6.2，培养条件:35°C、24h、静置培养；
[0048]褐球固氮菌CICC20603进行活化培养的第四活化培养基配方为:葡萄糖I %、磷酸二氣钟0.2%。、氣化纳0.2%。、硫酸续0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!为去尚子水、ρΗ7.0，转速 150r/min、35°C、15h。
[0049]ii扩大培养:将各菌种的活化菌种液按I % (V/V)的接种量接种到对应的IL液体扩大培养基中，进行扩大培养得到各菌种的种子液。其中，扩大培养的培养方式为摇瓶培养。
[0050]各菌种的扩大培养基重量百分比计的配方及培养条件如下:
[0051]枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580分别进行扩大培养的第一扩大培养基配方为牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量为去离子水、pH7.4，培养条件为:转速 150r/min、35°C、15h ；
[0052]康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152进行扩大培养的第二扩大培养基配方为:马铃薯20%、葡萄糖2%、余量为去离子水、pH自然，培养条件为:转速100r/min、28°C、24h ;
[0053]植物乳杆菌CICC20768进行扩大培养的第三扩大培养基配方为:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、葡萄糖2%、吐温0.1 %、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.58%。、硫酸锰0.25%。，余量为去离子水、pH6.2，培养条件为:35°C、24h、静置培养；
[0054]褐球固氮菌CICC20603进行扩大培养的第四扩大培养基配方为:葡萄糖I %、磷酸二氢钾0.2%。、氣化纳0.2%。、硫酸续0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!为去尚子水，ρΗ7.0，培养条件为:转速 150r/min、35°C、15h。
[0055]iii固体培养:将各菌种的种子液等体积混合，按10% (V/ff,ml/g)的接种比例接种到5Kg木薯酒糟固体培养基中，充分混匀，在28°C下培养2天，然后在37°C下培养2天，得到固体种子。
[0056]iv固体扩大培养:将固体种子按5% (W/W)接种比例添加到50Kg木薯酒糟固体扩大培养基中，充分混匀，在30°C下培养3天，然后在37°C下培养3天，最后在50°C下干燥至含水量低于20%,得到复合菌剂。
[0057]对本实施例所制备的复合菌剂进行活菌数的检测，检测结果如表1所示。从表1的结果中可以得出微生物菌剂的有效菌种活菌数大都能达到IO5个/克(三个平行实验均值)以上，能够得到一种高活性的复合菌剂。
[0058]实施例2
[0059]复合菌剂，其活性成分包含枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580、康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳杆菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0060]复合菌剂的制备:
[0061]i活化培养:将储存于4°C冰箱的斜面菌种:枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580、康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳杆菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分别取2环菌种接种至对应的50ml活化培养基进行活化培养，得到各菌种的活化菌种液。其中，活化培养的培养方式为摇瓶培养。
[0062]各菌种的活化培养基重量百分比计的配方及培养条件如下:
[0063]枯草芽孢杆菌CICC21082和巨大芽孢杆菌CICC21580分别进行活化培养的第一活化培养基配方为:牛肉膏0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量为去离子水、pH7.6，培养条件为:转速 200r/min、37°C、18h ；
[0064]康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分别进行活化培养的第二活化培养基配方为:马铃薯20%、葡萄糖2%、余量为去离子水、pH自然，培养条件为:转速150r/min、30°C、28h ；
[0065]植物乳杆菌CICC20768进行活化培养的第三活化培养基配方为:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、葡萄糖2 %、吐温0.1 %、乙酸钠0.5 %、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.58%。、硫酸锰0.25%。、余量为去离子水、pH6.6，培养条件:37°C、28h、静置培养；
[0066]褐球固氮菌CICC20603进行活化培养的第四活化培养基配方为:葡萄糖I %、磷酸二氢钾0.2%。、氣化纳0.2%。、硫酸续0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!为去尚子水、ρΗ7.2，转速 200r/min、37°C、18h。
[0067]ii扩大培养:将各菌种的活化菌种液按I % (V/V)的接种量接种到对应的IL液体扩大培养基中，进行扩大培养得到各菌种的种子液。其中，扩大培养的培养方式为摇瓶培养。
[0068]各菌种的扩大培养基重量百分比计的配方及培养条件如下:[0069]枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580分别进行扩大培养的第一扩大培养基配方为牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量为去离子水、pH7.6，培养条件为:转速 200r/min、37°C、18h ；
[0070]康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152进行扩大培养的第二扩大培养基配方为:马铃薯20%、葡萄糖2%、余量为去离子水、pH自然，培养条件为:转速150r/min、30°C、28h ;
[0071]植物乳杆菌CICC20768进行扩大培养的第三扩大培养基配方为:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、葡萄糖2%、吐温0.1 %、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.58%。、硫酸锰0.25%。，余量为去离子水、pH6.6，培养条件为:37°C、28h、静置培养；
[0072]褐球固氮菌CICC20603进行扩大培养的第四扩大培养基配方为:葡萄糖I %、磷酸二氣钟0.2%。、氣化纳0.2%。、硫酸续0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!为去尚子水，pH7.2，培养条件为:转速 200r/min、37°C、18h。
[0073]iii固体培养:将各菌种的种子液等体积混合，按10% (V/ff,ml/g)的接种比例接种至lj5Kg木薯酒糟、豆柏和秸杆按8:1:1 (W/W)混合的固体培养基中，充分混匀，在30°C下培养3天，然后在40°C下培养3天，得到固体种子。
[0074]iv固体扩大培养:将固体种子按5% (W/W)接种比例添加到50Kg木薯酒糟、豆柏和秸杆按8:1:1 (W/W)混合的固体扩大培养基中，充分混匀，在30°C下培养5天，然后在40°C下培养5天，最后在55°C下干燥至含水量低于20%，得到复合菌剂。
[0075]对本实施例所制备的复合菌剂进行活菌数的检测，检测结果如表1所示。从表1的结果中可以得出复合菌剂的各菌种的有效菌种活菌数大都能达到IO6个/克(三个平行实验均值)以上，能够得到一种高活性的复合菌剂。
[0076]实施例3
[0077]复合菌剂，其活性成分包含枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580、康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳杆菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0078]复合菌剂的制备:
[0079]i活化培养:将储存于4°C冰箱的斜面菌种:枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580、康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳杆菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分别取I环菌种接种至对应的500ml活化培养基进行活化培养，得到各菌种的活化菌种液。其中，活化培养的培养方式为摇瓶培养。
[0080]各菌种的活化培养基重量百分比计的配方及培养条件如下:
[0081]枯草芽孢杆菌CICC21082和巨大芽孢杆菌CICC21580分别进行活化培养的第一活化培养基配方为:牛肉膏0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量为去离子水、pH7.6，培养条件为:转速 180r/min、37°C、17h ；
[0082]康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分别进行活化培养的第二活化培养基配方为:马铃薯20%、葡萄糖2%、余量为去离子水、pH自然，培养条件为:转速130r/min、29°C、26h ；[0083]植物乳杆菌CICC20768进行活化培养的第三活化培养基配方为:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、葡萄糖2 %、吐温0.1 %、乙酸钠0.5 %、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.58%。、硫酸锰0.25%。、余量为去离子水、pH6.3，培养条件:36°C、26h、
静置培养；
[0084]褐球固氮菌CICC20603进行活化培养的第四活化培养基配方为:葡萄糖I %、磷酸二氣钟0.2%。、氣化纳0.2%。、硫酸续0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!为去尚子水、ρΗ7.2，转速 180r/min、37°C、17h。
[0085]ii扩大培养:将各菌种的活化菌种液按I % (V/V)的接种量接种到对应的IL液体扩大培养基中，进行扩大培养得到各菌种的种子液。其中，扩大培养的培养方式为摇瓶培养。
[0086]各菌种的扩大培养基重量百分比计的配方及培养条件如下:
[0087]枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580分别进行扩大培养的第一扩大培养基配方为牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量为去离子水、pH7.4，培养条件为:转速 180r/min、36°C、17h ；
[0088]康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152进行扩大培养的第二扩大培养基配方为:马铃薯20%、葡萄糖2%、余量为去离子水、pH自然，培养条件为:转速130r/min、30°C、26h ;
[0089]植物乳杆菌CICC20768进行扩大培养的第三扩大培养基配方为:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、葡萄糖2%、吐温0.1 %、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.58%。、硫酸锰0.25%。，余量为去离子水、PH6.3，培养条件为:37°C、26h、静置培养；
[0090]褐球固氮菌CICC20603进行扩大培养的第四扩大培养基配方为:葡萄糖I %、磷酸二氣钟0.2%。、氣化纳0.2%。、硫酸续0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!为去尚子水，pH7.2，培养条件为:转速 180r/min、36°C、17h。
[0091]iii固体培养:将各菌种的种子液等体积混合，按10% (V/ff,ml/g)的接种比例接种至lj5Kg木薯酒糟、豆柏和秸杆按5:1:1 (W/W)混合的固体培养基中，充分混匀，在30°C下培养3天，然后在40°C下培养3天，得到固体种子。
[0092]iv固体扩大培养:将固体种子按5% (W/W)接种比例添加到50Kg木薯酒糟、豆柏和秸杆按5:1:1 (W/W)混合的固体扩大培养基中，充分混匀，在30°C下培养5天，然后在40°C下培养5天，最后在50°C下干燥至含水量低于20%，得到复合菌剂。
[0093]对本实施例所制备的复合菌剂进行活菌数的检测，检测结果如表1所示。从表1的结果中可以得出复合菌剂的各菌种的有效菌种活菌数大都能达到IO5个/克(三个平行实验均值)以上，能够得到一种高活性的复合菌剂。
[0094]实施例4
[0095]复合菌剂，其活性成分包含枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580、康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳杆菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0096]复合菌剂的制备:
[0097]i活化培养:将储存于4°C冰箱的斜面菌种:枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580、康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳杆菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分别取I环菌种接种至对应的500ml活化培养基进行活化培养，得到各菌种的活化菌种液。其中，活化培养的培养方式为摇瓶培养。
[0098]各菌种的活化培养基重量百分比计的配方及培养条件如下:
[0099]枯草芽孢杆菌CICC21082和巨大芽孢杆菌CICC21580分别进行活化培养的第一活化培养基配方为:牛肉膏0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量为去离子水、pH7.6，培养条件为:转速 180r/min、37°C、17h ；
[0100]康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分别进行活化培养的第二活化培养基配方为:马铃薯20%、葡萄糖2%、余量为去离子水、pH自然，培养条件为:转速130r/min、29°C、26h ；
[0101]植物乳杆菌CICC20768进行活化培养的第三活化培养基配方为:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、葡萄糖2 %、吐温0.1 %、乙酸钠0.5 %、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.58%。、硫酸锰0.25%。、余量为去离子水、pH6.3，培养条件:36°C、26h、静置培养；
[0102]褐球固氮菌CICC20603进行活化培养的第四活化培养基配方为:葡萄糖I %、磷酸二氣钟0.2%。、氣化纳0.2%。、硫酸续0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!为去尚子水、ρΗ7.2，转速 180r/min、37°C、17h。
[0103]ii扩大培养:将各菌种的活化菌种液按I % (V/V)的接种量接种到对应的IL液体扩大培养基中，进行扩大培养得到各菌种的种子液。其中，扩大培养的培养方式为摇瓶培养。
[0104]各菌种的扩大培养基重量百分比计的配方及培养条件如下:
[0105]枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580分别进行扩大培养的第一扩大培养基配方为牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量为去离子水、pH7.4，培养条件为:转速 180r/min、36°C、17h ；
[0106]康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152进行扩大培养的第二扩大培养基配方为:马铃薯20%、葡萄糖2%、余量为去离子水、pH自然，培养条件为:转速130r/min、30°C、26h ;
[0107]植物乳杆菌CICC20768进行扩大培养的第三扩大培养基配方为:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5 %、柠檬酸氢二铵0.2 %、葡萄糖2 %、吐温0.1 %、乙酸钠0.5 %、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.58%。、硫酸锰0.25%。，余量为去离子水、pH6.3，培养条件为:37°C、26h、静置培养；
[0108]褐球固氮菌CICC20603进行扩大培养的第四扩大培养基配方为:葡萄糖I %、磷酸二氣钟0.2%。、氣化纳0.2%。、硫酸续0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!为去尚子水，pH7.2，培养条件为:转速 180r/min、36°C、17h。
[0109]iii固体培养:将各菌种的种子液等体积混合，按10% (V/ff,ml/g)的接种比例接种到 5Kg木薯酒糟、豆柏(粗蛋白含量≥43%)按5:1(W/W)混合的固体培养基中，充分混匀，在30°C下培养3天，然后在40°C下培养3天，得到固体种子。
[0110]iv固体扩大培养:将固体种子按5% (W/W)接种比例添加到50Kg木薯酒糟、豆柏(粗蛋白含量> 43% )按5:1(W/W)混合的固体扩大培养基中，充分混匀，在30°C下培养5天，然后在40°C下培养5天，最后在50°C下干燥至含水量低于20%，得到复合菌剂。
[0111]对本实施例所制备的复合菌剂进行活菌数的检测，检测结果如表1所示。从表1的结果中可以得出复合菌剂的各菌种的有效菌种活菌数大都能达到IO5个/克(三个平行实验均值)以上，能够得到一种高活性的复合菌剂。
[0112]实施例5
[0113]复合菌剂，其活性成分包含枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580、康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳杆菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0114]复合菌剂的制备:[0115]i活化培养:将储存于4°C冰箱的斜面菌种:枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580、康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳杆菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分别取2环菌种接种至对应的50ml活化培养基进行活化培养，得到各菌种的活化菌种液。其中，活化培养的培养方式为摇瓶培养。
[0116]各菌种的活化培养基重量百分比计的配方及培养条件如下:枯草芽孢杆菌CICC21082和巨大芽孢杆菌CICC21580分别进行活化培养的第一活化培养基配方为:牛肉膏0.3 %、蛋白胨1 %、NaCl0.5%、余量为去离子水、pH7.6，培养条件为:转速200r/min、37°C>18h ；
[0117]康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分别进行活化培养的第二活化培养基配方为:马铃薯20%、葡萄糖2%、余量为去离子水、pH自然，培养条件为:转速150r/min、30°C、28h ；
[0118]植物乳杆菌CICC20768进行活化培养的第三活化培养基配方为:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、葡萄糖2 %、吐温0.1 %、乙酸钠0.5 %、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.58%。、硫酸锰0.25%。、余量为去离子水、pH6.6，培养条件:37°C、28h、静置培养；
[0119]褐球固氮菌CICC20603进行活化培养的第四活化培养基配方为:葡萄糖I %、磷酸二氢钟0.2%。、氣化纳0.2%。、硫酸续0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!为去尚子水、ρΗ7.2，转速 200r/min、37°C、18h。
[0120]ii扩大培养:将各菌种的活化菌种液按I % (V/V)的接种量接种到对应的IL液体扩大培养基中，进行扩大培养得到各菌种的种子液。其中，扩大培养的培养方式为摇瓶培养。
[0121]各菌种的扩大培养基重量百分比计的配方及培养条件如下:枯草芽孢杆菌CICC21082、巨大芽孢杆菌CICC21580分别进行扩大培养的第一扩大培养基配方为牛肉膏
0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量为去离子水、pH7.6，培养条件为:转速200r/min、37°C、18h ；
[0122]康宁木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、绿色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152进行扩大培养的第二扩大培养基配方为:马铃薯20%、葡萄糖2%、余量为去离子水、pH自然，培养条件为:转速150r/min、30°C、28h ;[0123]植物乳杆菌CICC20768进行扩大培养的第三扩大培养基配方为:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、葡萄糖2%、吐温0.1 %、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.58%。、硫酸锰0.25%。，余量为去离子水、pH6.6，培养条件为:37°C、28h、静置培养；
[0124]褐球固氮菌CICC20603进行扩大培养的第四扩大培养基配方为:葡萄糖I %、磷酸二氣钟0.2%。、氣化纳0.2%。、硫酸续0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!为去尚子水，pH7.2，培养条件为:转速 200r/min、37°C、18h。
[0125]iii固体培养:将各菌种的种子液等体积混合，按10% (V/ff,ml/g)的接种比例接种到5Kg木薯酒糟、豆柏(粗蛋白含量大于或等于43% )按8:1 (W/W)混合的固体培养基中，充分混匀，在30°C下培养3天，然后在40°C下培养3天，得到固体种子。
[0126]iv固体扩大培养:将固体种子按5% (W/W)接种比例添加到50Kg木薯酒糟、豆柏(粗蛋白含量大于或等于43% )按8:1(W/W)混合的固体培扩大养基中，充分混匀，在30°C下培养5天，然后在40°C下培养5天，最后在55°C下干燥至含水量低于20%，得到复合菌剂。
[0127]对本实施例所制备的复合菌剂进行活菌数的检测，检测结果如表1所示。从表1的结果中可以得出复合菌剂的各菌种的有效菌种活菌数大都能达到IO5个/克(三个平行实验均值)以上，能够得到一种高活性的复合菌剂。
[0128]表1不同实例中各菌剂中有效菌种活菌数测定结果
【权利要求】
1.复合菌剂，其特征在于，其活性成分包含枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、康宁木霉、米曲霉、绿色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳杆菌和圆褐固氮菌。
2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂的制备方法包括以下步骤: i活化培养:将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、康宁木霉、米曲霉、绿色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳杆菌和圆褐固氮菌分别取I~2环菌种接种至对应的活化培养基进行活化培养，得到各菌种的活化菌种液； ?扩大培养:将各菌种的活化菌种液按I % (V/V)的接种量分别接种到对应的扩大培养基中，进行扩大培养得到各菌种的种子液； iii固体培养:将各菌种的种子液等体积混合，按10% (V/ff,ml/g)的接种比例接种到固体培养基中，在28~30°C下培养2~3天，然后在37~40°C下培养2~3天，得到固体种子; iv固体扩大培养:将固体种子按5% (W/W)接种比例添加到固体扩大培养基中，在30°C下培养3~5天，然后在37~40°C下培养3~5天，最后在50~55°C下干燥至含水量低于20%，得到复合菌剂。
3.根据权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于，在步骤i中，各菌种的活化培养基重量百分比计的配方及培养条件如下: 枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌分别进行活化培养的第一活化培养基配方为:牛肉膏.0.3%、蛋白胨l%、NaC1 0.5%、余量为去离子水、pH7.4~7.6，培养条件为:转速150_200r/min、35-37°C、15 ~18h ； 康宁木霉、米曲霉、绿色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉分别进行活化培养的第二活化培养基配方为:马铃薯20%、葡萄糖2%、余量为去离子水、pH自然，培养条件为:转速.100 ~150r/min、28-30°c、24 ~28h ； 植物乳杆菌进行活化培养的第三活化培养基配方为:蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏.0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、葡萄糖2%、吐温0.1%、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.58%。、硫酸锰0.25%。、余量为去离子水、pH6.2~6.6，培养条件:35_37°C、24~28h、静置培养； 圆褐固氮菌进行活化培养的第四活化培养基配方为:葡萄糖1%、磷酸二氢钾0.2%。、氯化钠0.2%。、硫酸镁0.2%。、硫酸钙0.2%。、碳酸钙0.5%、余量为去离子水、pH7.0~7.2，转速 150-200r/min、35-37°C、15 ~18h。
4.根据权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于，在步骤ii中，各菌种的扩大培养基重量百分比计的配方及培养条件如下: 枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌分别进行扩大培养的第一扩大培养基配方为牛肉膏.0.3%、蛋白胨I %、NaCl0.5%、余量为去离子水、pH7.4~7.6，培养条件为:转速150~.200r/min、35-37°C、15 ~18h ； 康宁木霉、米曲霉、绿色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉进行扩大培养的第二扩大培养基配方为:马铃薯20%、葡萄糖2%、余量为去离子水、pH自然，培养条件为:转速100~.150r/min、28 ~30 °C >24 ~28h ； 植物乳杆菌进行扩大培养的第三扩大培养基配方为:蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏.0.5%,柠檬酸氢二铵0.2%、葡萄糖2 %、吐温0.1 %、乙酸钠0.5 %、磷酸氢二钾0.2 %、硫酸镁0.58%。、硫酸锰0.25%。，余量为去离子水，pH6.2~6.6，培养条件为:35_37°C、24~28h、静置培养； 圆褐固氮菌进行扩大培养的第四扩大培养基配方为:葡萄糖1%、磷酸二氢钾0.2%。、氯化钠0.2%。、硫酸镁0.2%。、硫酸钙0.2%。、碳酸钙0.5%、余量为去离子水、pH7.0~7.2，培养条件为:转速150~200r/min、35-37°C、15~18h。
5.根据权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于，在步骤iii中:固体培养基为木薯酒糟或木薯酒糟与豆柏按5~8:1 (W/W)混合或木薯酒糟、豆柏和秸杆按5~8:1:1 (W/W)混合。
6.根据权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于，在步骤iv中:固体扩大培养基为木薯酒糟或木薯酒糟与豆柏按5~8:1 (W/W)混合或木薯酒糟、豆柏和秸杆按5~8:1:1 (W/W)混合。
7.根据权利要求5或6所述的复合菌剂，其特征在于，所述豆柏的粗蛋白含量>43%。
8.权利要求1所述的复合菌剂制备有机肥的方法，其特征在于，包括以下步骤: a按添加比例1~5% (W/W)，将复合菌剂与植物类纤维原料混合均匀，得到发酵原料，其中，发酵原料的水分含量为50~60%、pH6.0~8.5，复合菌剂的活性成分包含枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、康宁木霉、米曲霉、绿色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳杆菌和圆褐固氮菌； b将发酵原料进行堆肥发酵，当发酵环境的温度在30°C以下时，堆肥的时间为20~25天，当发酵环境在温度在30°C以上时，堆肥的时间为15~20天。在发酵过程中，每隔3~4天翻料一次； c将堆肥后的发酵原料于50°C下干燥至 水分含量低于30%，即得到有机肥。
9.权利要求1~7任一项所述的复合菌剂在制备有机肥的应用。
【文档编号】C12R1/065GK103898032SQ201410173158
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】唐波, 李舒宇, 仝志勇, 陈玉和 申请人:江苏联海生物科技有限公司