一段重组基因及提高黑曲霉表达糖化酶的方法

一段重组基因及提高黑曲霉表达糖化酶的方法【专利摘要】本发明属于基因工程领域，公开了一段重组基因及提高黑曲霉表达糖化酶的方法。一种提高黑曲霉表达糖化酶的方法，通过同源重组的方法，将糖化酶表达盒和选择标记基因定点整合到黑曲霉An12g08830基因座，再通过常规的抗性筛选和发酵培养重组黑曲霉获得糖化酶。本发明将糖化酶表达盒通过改进的同源重组方法定点整合到黑曲霉基因座An12g08830处后，不仅其转化效率和表达糖化酶活力显著升高，且省去了大量筛选转化子的过程。【专利说明】一段重组基因及提高黑曲霉表达糖化酶的方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于基因工程领域，涉及一段重组基因及提高黑曲霉表达糖化酶的方法。【
背景技术：
】[0002]糖化酶(1，4-a-D-萄聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)是催化淀粉或寡糖等多糖分子的非还原端释放出D-葡萄糖的酶。在商业上，糖化酶是由包括黑曲霉和米曲霉在内的几种丝状真菌和酵母生产的。丝状真菌作为细胞工厂生产有价值的产品(如酶)为人们熟知，其中尤以黑曲霉和米曲霉由于被国际普遍认定为安全菌(GenerallyRecognizedAsSafe,GRAS)的特征而被广泛用于表达宿主，从而用于生产食品添加剂。[0003]最初，科学家及商业公司通过传统的菌种选育方法进行育种，从而提高某种目的产物(如糖化酶)的表达量或产量。例如，利用紫外照射或者化学诱变剂处理曲霉后，针对特定产物对其进行筛选，从而获得高产菌株。随着分子生物学技术的发展，人们开始利用基因工程方法进行微生物育种。要获得高产量(或高表达量)菌株，例如提高酶的表达量，首先需要选择特定的启动子(诱导型或组成型)，随后对要表达的基因进行优化。除此之外，还需要适合的终止子序列。这样由启动子，编码序列及终止子序列进行串联即可得到表达盒。将目的表达盒与特定的选择标记连接后，可转入到微生物体内。这些表达盒可以定点插入到基因座中，也可以随机插入到基因座中。曲霉转化技术原理遵循非同源断裂修复机理，造成利用同源重组进行定点插入到基因座中比较困难，因此现有曲霉育种方法大都使用随机插入到基因座中，随后再根据需要对转化子进行大规模筛选，以获得目的菌株。这样的方法费时费力，且结果不可预见。理论上讲，筛选越多转化子，获得优势菌株的可能性越大。[0004]曲霉如黑曲霉的DNA转化技术主要有聚乙二醇介导的化学转化法、电击转化法及根癌农杆菌介导转化法。无论上述何种方法，他们的共同特点都是转化效率极其低下，每微克DNA的转化效率只有几个到几百个转化子，要比细菌(如大肠杆菌)及酵母(如酿酒酵母)转化效率低几个数量级。再加上曲霉的筛选费时费力，因此与传统诱变-筛选育种一样，随机整合DNA育种过程也需要耗费大量时间和劳动成本，且结果不可预见。【
发明内容】[0005]本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一个定点整合糖化酶基因到黑曲霉菌种染色体中，实现对糖化酶高表达的技术方案。[0006]本发明的另一目的是提供一段重组基因。[0007]一种提高黑曲霉表达糖化酶的方法，通过同源重组的方法，将糖化酶表达盒和选择标记基因定点整合到黑曲霉Anl2g08830基因座，再通过常规的抗性筛选和发酵培养重组黑曲霉获得糖化酶。[0008]具体地，定点整合基因座被确定为An12g08830(参照黑曲霉CBS513.88基因组)，首先选取基因座侧翼5’及3’序列作为同源侧翼序列，同源侧翼序列片段大小优选100-5000bp，优选1000-3000bp，更优选2000bp。选取侧翼序列是为了实现定点糖化酶表达盒的敲入。本领域技术人员应当知晓，同源序列越长，越容易发生同源重组，但是长序列的体外操作可能存在一定困难。同源序列越短，体外操作越容易，但是定点整合的几率也会降低。通常是在整合几率与操作难易之间选择一个均衡的长度。[0009]为了构建糖化酶表达盒，首先需要选择必须的启动子。启动子可以是黑曲霉内源启动子，如黑曲霉糖化酶启动子，中性淀粉酶启动子，酸性淀粉酶启动子，α-葡萄糖苷酶启动子等。也可以是外源启动子。如米曲霉中性淀粉酶启动子，米根酶糖化酶启动子。也可以是启动子变体，如黑曲霉中性淀粉酶变体。与启动子3’末端连接的可以是调控序列，如合适的前导序列，即对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。如米曲霉中性淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶前导序列。[0010]糖化酶基因可以选择黑曲霉内源基因，也可以来自其他种如米曲霉，米根酶，踝节菌属，青霉属。本发明优选黑曲霉糖化酶(AnGA)和埃莫森踝节菌糖化酶(TeGA)。[0011]优选的终止子从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。[0012]本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophytoauxotrophs)等。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hyg(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷_5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺昔酸转移酶)和trpC(邻氛基苯甲酸合酶(anthraniIatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉(Aspergillusnidulans)或米曲霉的amdS和hyg。[0013]为了实现糖化酶表达盒基因敲入到Anl2g08830基因座中，优选的方法是使用同源重组方法，即糖化酶表达盒与选择标记的5’及3’端具有Anl2g08830基因座同源侧翼序列。通过转化及标记物筛选获得敲入转化子。曲霉转化技术原理遵循非同源断裂修复机理，造成利用同源重组进行定点插入到基因座中比例很低，成功率低下。更优选的方案是改进后的同源重组方法，即Kim(Kimetal.,Biochem.Biophys.Res.Commun390(3):983-988,2009)等人描述的方法(Double-JointPCRwithSplitDominantSelectableMarkers)。具体地，为完成同源重组，需两段序列共同转化。第一段序列由Anl2g08830基因座5’侧翼序列与第一段选择标记基因链接，第二段序列由Anl2g08830基因座3’侧翼序列与糖化酶表达盒及第二段选择标记基因顺序链接。第一段与第二段在选择标记部分具有至少IOObp的同源序列，优选IOO-1OOObp。将两段序列共同转化，只有侧翼序列及选择标记三段同源序列同时发生重组，才会出现阳性转化子。大大提高了同源重组的转化率。[0014]一段重组基因，该基因为通过同源重组的方法，将糖化酶表达盒和选择标记基因定点整合到黑曲霉Anl2g08830基因座所得。[0015]其中，选取黑曲霉Anl2g08830基因座侧翼5’及3’100_5000bp序列作为同源侧翼序列，优选选取黑曲霉Anl2g08830基因座侧翼5’及3’1000-3000bp序列作为同源侧翼序列，进一步优选选取黑曲霉Anl2g08830基因座侧翼5’及3’2000bp序列作为同源侧翼序列。[0016]所述的同源重组，需两段序列共同转化黑曲霉，第一段序列由Anl2g08830基因座5’侧翼序列与第一段选择标记基因链接，第二段序列由Anl2g08830基因座3’侧翼序列与糖化酶表达盒及第二段选择标记基因顺序链接，第一段序列与第二段序列在选择标记基因部分具有同源序列。[0017]所述的第一段序列与第二段序列在选择标记部分优选具有至少IOObp的同源序列，进一步优选具有100~1000bp的同源序列。[0018]所述的糖化酶表达盒主要由启动子、糖化酶基因及终止子组成；优选由启动子、调控序列、糖化酶基因及终止子组成。启动子、调控序列、糖化酶基因及终止子的选择范围同上所述。[0019]所述的同源重组方法包括两段同源侧翼序列的克隆，以及原生质体的转化。本发明中原生质体转化为本领域常规方法。[0020]包含上述重组基因的重组菌株；优选含有上述重组基因的黑曲霉。[0021]所述的重组黑曲霉优选含有SEQIDN0.7及SEQIDN0.8所示片段。[0022]一种鉴定本发明所述的重组菌株的方法，通过PCR扩增或其他基因鉴定方法，如果能够获得或鉴定含有SEQIDN0.7及SEQIDN0.8所示片段，则表明为本发明所述的重组菌株。[0023]所述的方法优选以08830test_Fl与08830test_Rl、08830test_F2与08830test_R2为引物，PCR扩增待检基因、含有待检基因的质粒或重组细胞，如果能够获得SEQIDN0.7及SEQIDN0.8所示片段，则表明为重组菌株；其中所述的08830test_Fl序列如SEQIDN0.9所示，08830test_Rl序列如SEQIDN0.10所示，所述的08830test_F2序列如SEQIDN0.11所示，08830test_R2序列如SEQIDN0.12所示。[0024]本发明所述的重组基因、所述的重组菌株在提高黑曲霉发酵表达糖化酶中的应用。[0025]有益效果:[0026]本发明将糖化酶表达盒通过改进的同源重组方法定点整合到黑曲霉基因座Anl2g08830处后，不仅其转化效率和表达糖化酶活力显著升高，而且省去了大量筛选转化子的过程。【专利附图】【附图说明】[0027]图1:pGAHyg质粒图谱。[0028]图2:糖化酶表达盒定点整合到基因座Anl2g08830的PCR验证结果。[0029]泳道M:DNAMarkerIII(厂家:TIANGEN)；[0030]泳道1:对照以08830test_Fl与08830test_Rl为引物得到的PCR产物；[0031]泳道2-7:依次为1-6号转化子以08830test_Fl与08830test_Rl为引物得到的PCR产物；[0032]泳道8:对照以08830test_F2与08830test_R2为引物得到的PCR产物；[0033]泳道9-14:依次为1-6号转化子以08830test_F2与08830test_R2为引物得到的PCR产物。[0034]图3:定点整合转化子整合到Anl2g08830基因座的图谱。【具体实施方式】[0035]下面结合实例对本发明的构建过程做进一步阐释，下述说明中相关实例是说明性质的，不能限定本发明的保护范围。[0036]按步骤详细写明实验方案，包括实验材料、方法、条件、结果等。[0037]实施例1随机整合GA表达盒构建[0038]为了与定点整合结果作对比，构建了随机整合质粒，该质粒包含以下几个部分:[0039](l)pUC57质粒经EcoR1-HindIII双酶切后得到的片段；[0040](2)糖化酶(TeGA)表达盒,其中糖化酶是踝节菌属变体，由GenScript公司合成，序列如SEQIDN0.1所示；[0041](3)选择标记Hyg表达盒，由GenScript公司合成,序列见SEQIDN0.2；[0042]首先分别用引物GA_F与GA_R、hyg_F0与hyg_R0通过PCR扩出带有重组臂的GA基因和hyg基因，然后利用PCR通过GA_F与hyg_R0引物两端的重叠序列将GA基因和hyg基因拼成一条直链长片段，再通过ClonEZ(购自GenScript公司)方法与具有末端互补序列的pUC57Ec0R1-HindIII酶切线性回收片段进行重组，得到pGAHyg质粒，构建好的质粒图谱见图1。该质粒在GA表达盒上游和Hyg表达盒下游分别加上了HindIII位点，以便线性化后用于原生质体转化。[0043]相关引物序列如下:[0044]【权利要求】1.一种提高黑曲霉表达糖化酶的方法，其特征在于通过同源重组的方法，将糖化酶表达盒和选择标记基因定点整合到黑曲霉Anl2g08830基因座，再通过常规的抗性筛选和发酵培养重组黑曲霉获得糖化酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于选取黑曲霉Anl2g08830基因座侧翼5‘及3’100-5000bp序列作为同源侧翼序列。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于选取黑曲霉Anl2g08830基因座侧翼5‘及3’500bp-5000bp序列作为同源侧翼序列，优选选取黑曲霉Anl2g08830基因座侧翼5‘及3’1000-3000bp序列作为同源侧翼序列，进一步优选选取黑曲霉Anl2g08830基因座侧翼5‘及3’2000bp序列作为同源侧翼序列。4.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于所述的同源重组，需两段序列共同转化黑曲霉，第一段序列由Anl2g08830基因座5‘侧翼序列与第一段选择标记基因链接，第二段序列由Anl2g08830基因座3‘侧翼序列与糖化酶表达盒及第二段选择标记基因顺序链接，第一段序列与第二段序列在选择标记基因部分具有同源序列。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的第一段序列与第二段序列在选择标记部分具有至少IOObp的同源序列。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的糖化酶表达盒主要由启动子、糖化酶基因及终止子组成。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的启动子选自黑曲霉内源启动子、外源启动子或启动子变体。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的黑曲霉内源启动子选自黑曲霉糖化酶启动子、中性淀粉酶启动子、酸性淀粉酶启动子或α-葡萄糖苷酶启动子；所述的外源启动子选自米曲霉中性淀粉酶启动子、米根酶糖化酶启动子；所述的启动子变体选自黑曲霉中性淀粉酶变体。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的糖化酶表达盒还可以包括调控序列，调控序列为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区，优选米曲霉中性淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶前导序列。10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的糖化酶基因选自黑曲霉内源基因，或来自其他种属的糖化酶基因。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述的其他种属的糖化酶基因选自米曲霉，米根酶，踝节菌属或青霉属的糖化酶基因及突变体，优选黑曲霉糖化酶和埃莫森踝节菌糖化酶及突变体。12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的终止子从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶基因、黑曲霉α-葡糖苷酶基因或尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶基因。13.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的选择标记基因数量为一个或多个，其表达产物提供抗生素抗性、杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性。14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述的选择标记基因选自乙酰胺酶基因、鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因、草铵膦乙酰转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、硝酸还原酶基因、乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因、硫酸腺苷酰转移酶基因、邻氨基苯甲酸合酶基因或它们的等同物，优选构巢曲霉或米曲霉的乙酰胺酶基因或潮霉素磷酸转移酶基因。15.一段用于提高黑曲霉表达糖化酶的重组基因，其特征在于该基因为通过同源重组的方法，将糖化酶表达盒和选择标记基因定点整合到黑曲霉Anl2g08830基因座所得。16.根据权利要求15所述的重组基因，其特征在于选取黑曲霉Anl2g08830基因座侧翼5‘及3’100-5000bp序列作为同源侧翼序列，优选选取黑曲霉Anl2g08830基因座侧翼5‘及3’1000-3000bp序列作为同源侧翼序列，进一步优选选取黑曲霉Anl2g08830基因座侧翼5‘及3’2000bp序列作为同源侧翼序列。17.根据权利要求16所述的重组基因，其特征在于所述的同源重组，需两段序列共同转化黑曲霉，第一段序列由Anl2g08830基因座5‘侧翼序列与第一段选择标记基因链接，第二段序列由Anl2g08830基因座3‘侧翼序列与糖化酶表达盒及第二段选择标记基因顺序链接，第一段序列与第二段序列在选择标记基因部分具有同源序列。18.根据权利要求17所述的重组基因，其特征在于所述的第一段序列与第二段序列在选择标记部分具有至少IOObp的同源序列。19.根据权利要求17所述的重组基因，其特征在于所述的糖化酶表达盒主要由启动子、糖化酶基因及终止子组成；优选由启动子、调控序列、糖化酶基因及终止子组成。20.包含权利要求15~19中任一项所述的重组基因的重组菌株，所述的菌株优选黑曲霉O21.根据权利要求20所述的重组菌株，其特征在于所述的菌株含有SEQIDN0.7及SEQIDN0.8所示片段。22.—种鉴定权利要求20~21中任一项所述的重组菌株的方法，其特征在于通过PCR扩增方法，如果能够获得含有SEQIDN0.7及SEQIDN0.8所示序列的基因片段，则表明为重组菌株。23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于以08830test_Fl与08830test_RU08830test_F2与08830test_R2为引物，PCR扩增，如果能够获得含有SEQIDN0.7及SEQIDN0.8所示序列的基因片段，则表明为重组菌株；其中所述的08830test_Fl序列如SEQIDN0.9所示，08830test_Rl序列如SEQIDN0.10所示，所述的08830test_F2序列如SEQIDN0.11所示，08830test_R2序列如SEQIDN0.12所示。24.权利要求15~19中任一项所述的重组基因、权利要求20或21所述的菌株在提高黑曲霉发酵表达糖化酶中的应用。【文档编号】C12N1/15GK103937766SQ201410173213【公开日】2014年7月23日申请日期:2014年4月25日优先权日:2014年4月25日【发明者】白挨玺,孙健,卞芙蓉,张垠,李峰,徐凤,徐红,潘金龙,章方良申请人:南京百斯杰生物工程有限公司