血清中的microRNA作为肝癌诊断标志物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了microRNA——miR-3126-5p作为肝癌诊断标志物的应用。本发明利用高通量芯片检测不同进展期肝癌细胞和临床肝癌血清标本中microRNA的表达，从中筛选出候选microRNA，随后通过检测大样本血清中候选microRNA的表达，发现miR-3126-5p对于诊断肝癌具有较好的灵敏度和特异性，尤其在诊断早期肝癌、AFP低表达的肝癌中具有较好的诊断价值。在此基础上，本发明开发了检测miR-3126-5p的引物、试剂盒及检测方法，具有较好的开发前景和临床应用价值。引物序列如SEQ?ID?NO.2所示，试剂盒由microRNA抽提试剂、反转录试剂、特异性扩增引物以及PCR扩增所需试剂组成。
【专利说明】血清中的microRNA作为肝癌诊断标志物的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种血清中的microRNA-miR-3126_5p作为肝癌诊断标志物的应
用，属于生物技术和医学领域。
【背景技术】
[0002]原发性肝细胞肝癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一。据有关统计，男性肝癌患者年新增病例以及死亡率都高居前五位，女性肝癌患者死亡率在第七位。肝细胞性肝癌是肝癌最主要的病理类型，占原发性肝癌的80%左右，在我国占到了 90%。其死亡率高预后差的主要原因之一是其具有高转移性。
[0003]肝癌的诊断主要依靠影像学检查、血清甲胎蛋白(alpha fetal protein, AFP)进行筛查。肝癌发生早期，影像学检查不到；而AFP敏感性又较低。早期诊断治疗延误，使得超过三分之二的肝癌患者在晚期才得到治疗。基于对肝癌以及其他肿瘤的研究发现，miRNA在肿瘤发生发展过程中有重要意义。有研究发现microRNA在肝癌组织中异常表达，可能参与了肝细胞癌变与肝癌转移的病理过程。MicroRNA是一类高度保守的非编码小RNA，通过调控基因表达参与多种生物学信号通路的调节。外周血液循环中的microRNA稳定存在，且与多种癌症密切相关。如果能够开发血清microRNA作为肿瘤诊断标志物将大大提高诊断效率。目前血清miRNA已在乳腺癌、肺癌等多种肿瘤中作为诊断标志物被研究。
[0004]成熟的microRNA由microRNA前体,一段具有发夹样环状结构的单链，经dicer等酶切割成为长度在2 1-24nt的小核苷酸片段。在哺乳动物中，成熟miRNA通过与相关蛋白质一起组成RNA-诱导沉默复合体(RISC)，与靶mRNA分子的3'端非编码区互补结合，抑制翻译或者引起mRNA降解。根据生物信息学预测分析，单独一个microRNA就可以调节上百个基因的表达，在细胞增殖分化凋亡等等多个过程发挥重要作用。而异常的microRNA表达可能与包括肿瘤在内人类许多疾病密切相关。
[0005]现已有众多报道证明肿瘤组织中microRNA的表达谱与其发病预后密切相关，但是，直接检测组织中microRNA对患者来说创伤较大,技术也相对复杂，难以真正用于诊断。而外周血血清microRNA则较易获得，对患者损伤较小,常规的临床抽血检查即可获得血清标本。并且由于microRNA的结构特点，microRNA耐RNA酶水解，对热、低温、酸、碱都具有抗性，耐反复冻融，在血清中能够长期稳定地存在。长期低温下保存的血清中，mictoRNA的理化性质不会改变。因此，血清microRNA是一种理想的用于肝癌检测的指标。
[0006]关于血清中microRNA的来源,现在还没有明确的理论依据,普遍被认同的是来源于组织细胞的主动分泌过程。在细胞内，成熟的microRNA被脂质或脂蛋白包裹，成为外分泌体(exosome)，分泌至胞外并进入血液；细胞通过内吞作用接受外分泌体并将其去包被化，释放出的microRNA即在受体细胞内行使其生物学功能。这种由外分泌体介导的细胞间的microRNA的交换常常作为细胞间通讯的新渠道，对于维持内环境的稳态具有重要意义。
[0007]检测血清microRNA对于肿瘤的诊断和预后判断往往能够提高检测的灵敏度和特异性；而单独的一种microRNA的表达异常往往不具有代表性或作为肿瘤标志物特异性不高，选择多个microRNA，或者与其他肝癌标志物结合使用可以提高诊断的准确性。近年来，有三个研究报道了 HCC患者中的血清microRNA。Qu等(Qu，KZ.etal (2011) J ClinGastroentero 145:355-60)研究了血清 hsa-miR-16、hsa-miR-195 以及 hsa_miR-196a 在283个样本中的诊断价值，发现hsa-miR-16具有最好的诊断效能，灵敏度和特异性分别为72.1 %和 88.8%。Xu 等(Xu, J.et al (2011)Molecular Carcinogenesis50:136-42)发现了血清中hsa-miR-21、hsa-miR-122和hsaniR-223是区分HCC和健康个体的潜在标志物。Li 等(Li, LM.et al (2010) Cancer Res70,9798-807)报道了血清 microRNA 显著的诊断价值，hsa-miR-375的灵敏度和特异性分别为96%和100%，hsaiiR-375、hsa-miR-25以及hsa-let-7f联合应用后，灵敏度和特异性分别为97.9%和99.1%。以上结果提示，血清microRNA诊断HCC是可行的,但是这些研究存在诸多缺陷,如用于筛选microRNA的方式和候选基因的数目有限，没有对不同时期肝癌的诊断进行检测、样本量小、缺乏早期肝癌的诊断标志物或缺少独立的验证。因此，仍然有必要在HCC患者的血浆或血清中发现有诊断价值的microRNA生物标志物,尤其是对于早期肝癌的诊断标志物。通过比较多个microRNA的诊断效率，以及多个microRNA生物标志物联合应用，可以确定能够快速、准确、低成本地对早期肝癌患者进行诊断的miCToRNA标志物。
【发明内容】
[0008]针对上述现有技术，本发明通过研究，发现了一个新的可以作为肝癌诊断标志物的mici^RNA。本发明利用体外肝癌细胞模型结合临床病例对肝癌中异常表达的microRNA进行了表达分析，并分析了其对肝癌诊断的临床意义。
[0009]本发明是通过以下技术方案实现的: [0010]本发明通过分析临床肝癌血清样本和体外肝癌细胞模型，从中筛选出了六个在肝癌血清中异常表达的 microRNA (miR-16-2_3p、miR-17_5p、miR-92a_3p、miR-107、miR-1246和miR-3126_5p),并通过realtime PCR验证、单因素和多因素Logistic模型检测以及ROC分析，最终明确miR-92a-3p、miR-107和miR-3126_5p对肝癌的诊断有意义，而miR-3126-5p具有最高的诊断效能。
[0011]本发明重点分析了血清microRNA-miR-3126_5p的成熟体(其序列为
UGAGGGACAGAUGCCAGAAGCA，如 SEQ ID N0.1 所示)的表达情况，首次发现血清 miR-3126_5p对于诊断肝癌，尤其是诊断早期肝癌和甲胎蛋白阴性的肝癌具有较高的灵敏度和特异性，因此，microRNA——miR-3126_5p可以作为肝癌诊断标志物进行应用，用于诊断诊断早期原发性肝癌、低甲胎蛋白分泌的原发性肝癌(低甲胎蛋白分泌为血清甲胎蛋白含量小于200ng/mL的原发性肝癌)。具体应用时，检测待诊断患者外周血血清中miR-3126_5p的表达水平，对肝癌进行诊断:若Realtime PCR检测miR-3126_5p的相对表达量低于2.497，则该检测者诊断为肝癌；若Realtime PCR检测miR-3126_5p的相对表达量高于2.497，则该检测者不诊断为肝癌。判断的依据是基于ROC曲线对肝癌/非肝癌这一二分类变量的判断，AUC(曲线下的面积)反映了诊断效率。经分析显示，miR-3126-5p对肝癌的总体诊断效率为0.881，略高于AFP (0.848) ；miR-3126-5p对BCLCO期的早期肝癌的诊断效率为0.97，远高于AFP (0.698);而对于低AFP患者(AFP〈200ng/mL)的诊断效率为0.927，远高于AFP(0.726)。[0012]所述早期原发性肝癌是BCLC (0+A)级的原发性肝癌，是按照巴塞罗那临床肝癌标准(barcolona clinic liver cancer, BCLC)0+A 级的肝癌。
[0013]所述低甲胎蛋白分泌的原发性肝癌(低AFP分泌肝癌)是指一种适应症，其是一种肝癌，但其AFP表达较低(AFP〈200ng/mL)。AFP是当前应用最广泛的肝癌标志物，根据现有技术，当AFP界值为200ng/mL时，AFP诊断肝癌的灵敏度仅为55~60%，产生约40%的假阴性率。这部分AFP阴性肝癌病人在临床上难以诊断，难以评估其治疗效果和疾病进程。并且，AFP不是肝癌的特异性指标，一部分肝炎、肝硬化、结肠炎和结肠癌患者也会出现AFP的异常增高，造成了临床应用AFP进行诊断的干扰。由此，AFP并不是诊断肝癌的理想标记物，目前临床迫切需要新的指标用于提高肝癌的诊断率。
[0014]进一步地，本发明还提供了一种用于检测血清miR-3126_5p成熟体的特异性扩增的方法，概述如下:首先进行血清microRNA的抽提，然后在poly (A)聚合酶在其3’末端加polyA尾，在反转录酶的作用下反转录为cDNA,并进行RealtimePCR扩增。其中特异性的前向引物序列为:TGAGGGACAGATGCCAGAAGCA,如SEQ ID N0.2所示；逆向引物序列为通用的适配子引物。
[0015]本发明还提供了一种用于检测miR-3126_5p的试剂盒(用于诊断肝癌的试剂盒)，试剂盒由上述特异性扩增引物以及PCR扩增所需试剂(核酸抽提试剂、聚合酶链式反应试剂等，为常规试剂)组成。进一步地，试剂盒的组成如下(表1):
[0016]表1试剂盒 组成
[0017]
【权利要求】
1.microRNA——miR-3126_5p作为肝癌诊断标志物的应用，所述miR-3126_5p的序列如 SEQ ID N0.1 所示。
2.一种用于检测血清miR-3126-5p的特异性扩增引物，其特征在于:序列为:TGAGGGACAGATGCCAGAAGCA,如 SEQ ID N0.2 所示。
3.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒由特异性扩增引物以及PCR扩增所需试剂组成，其中，特异性扩增引物序列为:TGAGGGACAGATGCCAGAAGCA,如SEQ IDN0.2所示，其特异性扩增的目标序列为miR-3126-5p。
4.根据权利要求3所述的种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒的组成下表所示:.序U组成量
5.权利要求3或4所述的用于诊断肝癌的试剂盒在诊断早期肝癌、AFP低表达的肝癌中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103924002SQ201410184082
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年5月4日 优先权日:2014年5月4日
【发明者】韩丽辉, 李涛, 张颖, 贾晓青, 赵伟, 邱驭旻, 康佳, 姜艳艳, 怀婉婉, 郭蓬勃 申请人:山东大学