一种体外快速增殖疟原虫成熟裂殖体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种体外快速增殖疟原虫成熟裂殖体的方法，具体步骤为：将液氮冻存的疟原虫解冻复苏，离心，沉淀用疟原虫培养基重悬后再用疟原虫培养基洗涤，离心收集沉淀，然后加入疟原虫培养基重悬，重悬后通入N2、CO2和O2的混合气体，再在37℃、100r/min的条件下过夜培养，培养液用体积分数为72％Percoll分离液进行梯度离心，离心完毕，取中间层液体，然后用疟原虫培养基清洗，离心收集沉淀，得疟原虫成熟裂殖体；该方法操作简单，不需要在小鼠体内增殖，并且获得的疟原虫成熟裂殖体的数量多，可达到107～108，能够满足转基因需求，为疟原虫功能基因组学研究奠定了基础。
【专利说明】一种体外快速增殖疟原虫成熟裂殖体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种体外快速增殖疟原虫成熟裂殖体的方法。
【背景技术】
[0002]疟原虫(Plasmodium)是一类单细胞、寄生性的原生动物，是人体疟疾的病原体。疟疾是一种严重危害人体健康的寄生虫病，全世界约二分之一人口受威胁。随着各疟原虫基因组测序的相继完成，疟原虫研究已经进入后基因组时代。目前，许多与疟原虫入侵、发育增殖、致病以及免疫逃避有关的重要基因的功能都尚未得以阐明，致使疟疾防治和疫苗研制工作进展缓慢，而对疟原虫各种基因及其产物的功能研究是制备有效疫苗和抗疟药物的前提。基因敲除技术是功能基因组学研究中最直接和最有效的方法，建立一种快速获得基因敲除疟原虫的方法可以加快疟原虫基因功能的研究。但是，基因敲除技术需要使用成熟裂殖体，而成熟裂殖体需要在小鼠体内增殖，步骤繁琐费时费力。因此，急需一种体外培养快速增殖疟原虫成熟裂殖体的方法。
【发明内容】
[0003]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供体外培养快速增殖疟原虫成熟裂殖体的方法，其操作简单，不需要在小鼠体内繁殖，并且繁殖后的成熟裂殖体能够用于转染。
[0004]为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案:
[0005]体外快速增殖疟原虫成熟裂殖体的方法，包括如下步骤:
[0006](I)选择原虫率为25~30%的液氮冻存疟原虫，将其置于37°C恒温水浴锅内迅速解冻，离心，沉淀用疟原虫培养基重悬后再加入疟原虫培养基洗涤，离心收集沉淀，所述疟原虫培养基为含有胎牛血清、红细胞、肝素、青霉素和链霉素的RPMI1640培养基；
[0007](2)将步骤(1)所得沉淀用所述疟原虫培养基重悬，再加入所述疟原虫培养基混匀，在培养液中灌输N2XO2和O2的混合气体，灌输完毕立即封闭瓶口，然后置于37°C、IOOr/min的条件下培养12~14小时；
[0008](3)取新鲜配制的体积分数为72% Percoll分离液，然后向分离液中加入步骤(2)的培养液，并用水平式离心机在350g条件下离心25min，离心完毕，取中间层液体，然后用所述疟原虫培养基清洗，离心弃上清，得疟原虫成熟裂殖体。
[0009]优选的，所述疟原虫培养基中胎牛血清的体积分数为20%，红细胞的体积分数为10%,肝素的浓度为75000单位/L,青霉素的浓度为IO5单位/L,链霉素的浓度为100mg/L。
[0010]优选的，所述步骤(2)中，所述混合气体中N2、CO2和O2的体积分数分别为90%、5%和 5%。
[0011]优选的，所述步骤(2)中，所述混合气体的灌输时间为90s。
[0012]更优选的，所述体积分数为72% Percoll分离液的制备方法为取Percoll原液与浓度为1.5M的NaCl按体积比为1:9混合，然后浓度为0.15M的NaCl稀释至Percoll体积分数为72%。
[0013]本发明的有益效果在于:本发明公开了一种体外快速增殖疟原虫成熟裂殖体的方法，无需在小鼠体内增殖的步骤，利用此方法可以体外培养快速增殖获得大量的疟原虫成熟裂殖体，时间短，效率高，裂殖体数量多，数量可达到IO7~108，多于传统在小鼠体内增殖方法获得疟原虫成熟裂殖体的数量，此外获得的成熟裂殖体可用于转基因，如基因敲除等，具有经济高效、省时省力且成功率高等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0015]图1为两种方法分离后的裂殖体染色结果图(A:实施例1方法分离的疟原虫成熟裂殖体；B:传统方法分离的疟原虫成熟裂殖体)。
[0016]图2为两种方法获得的裂殖体数量统计结果图(1:实施例1方法分离的疟原虫成熟裂殖体数量；2:传统方法分离的疟原虫成熟裂殖体数量)。
[0017]图3为基因敲除质粒结构示意图。
[0018]图4为基因敲除质粒对痕原虫基因的敲除原理图。
[0019]图5为基因敲除疟原虫凝胶电泳鉴定图(A:野生型疟原虫和转染疟原虫的nS3基因检测结果；B:5’端插入序列和3’端插入序列检测结果)。
【具体实施方式】
[0020]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0021]实施例1
[0022]体外快速增殖疟原虫成熟裂殖体的方法，包括如下步骤:
[0023](I)选择原虫率在25~30%的液氮冻存疟原虫，将其置于37°C恒温水浴锅内迅速解冻，然后在2000rpm条件下离心3min,去除上清,用ImL痕原虫培养基重悬后转移至50mL离心管中，加入40mL疟原虫培养基洗涤，再在2000rpm条件下离心3min ;其中疟原虫培养基为RPMI1640培养基，并含有体积分数为20%的胎牛血清，体积分数为10%的红细胞，75000单位/L的肝素，IO5单位/L的青霉素和100mg/L的链霉素；
[0024](2)将步骤(1)离心后的沉淀用ImL疟原虫培养基重悬后转移至500mL的广口培养瓶中，然后加入IOOmL疟原虫培养基并混匀，再向广口瓶中灌输N2、CO2和O2体积分数分别为和5%的混合气体，灌输时间为90s，灌输完毕立即封闭瓶口，然后置于37°C、100r/min的恒温摇床中培养12~14小时；
[0025](3)取新鲜配制的体积分数为72% Percoll分离液加至50mL离心管中，然后加入步骤(2)的培养液中，并用水平式离心机在350g条件下离心25min，离心完毕后液相分为三层，中间层棕色，成熟裂殖体位于该层，小心吸取成熟裂殖体并用50mL疟原虫培养基清洗一次，然后在450g条件下离心8min，弃上清，沉淀即为疟原虫成熟裂殖体。
[0026]本实施例中体积分数为72% Percoll分离液的制备方法为:取3.24mL Percoll原液与0.36mL浓度为1.5M的NaCl混匀，然后加入1.4mL浓度为0.15M的NaCl稀释至工作浓度。
[0027]同时按照传统方法培养分离痕原虫成熟裂殖体:将原虫率在25~30%的液氮冻存疟原虫于37°C恒温水浴锅内迅速解冻，然后腹腔注射至小鼠体内增殖，3~4天后麻醉感染小鼠并心脏穿刺取血约400~800 μ L,加入至ImL PBS中清洗,2000rpm离心3min,重复洗涤2次，然后将沉淀用ImL PBS重悬并混匀，加入至5mL72% Percoll分离液表面进行分离，将其作为对照。将传统方法分离的疟原虫成熟裂殖体与本实施例分离的疟原虫成熟裂殖体进行染色，然后进行观察，结果如图1所示。由图1可知，光镜下观察可见利用本发明的方法培养分离的成熟裂殖体布满整个视野，而传统方法仅几个局部可见较多裂殖体，表明利用本发明的方法分离的疟原虫成熟裂殖体的数量更多。为了更清楚两种方法获得疟原虫数量的不同，统计两种方法分离的疟原虫成熟裂殖体数量，结果如图2所示。由图2可知，利用本发明的方法分离的疟原虫成熟裂殖体数量远远多于传统方法分离的疟原虫成熟裂殖体数量。
[0028]实施例2
[0029]构建用于基因敲除的质粒，包括如下步骤:
[0030](I)根据疟原虫基因组序列，设计扩增疟原虫基因nS3的引物，上游引物为:5’_atgggtaccaacaccctcaatgtct-3，(SEQ ID N0.1),黑体表示 KpnI 酶切位点，下游引物为:5，_taaggcgcctataaaattataatat-3’ (SEQ ID N0.2),黑体表示NarI酶切位点，然后以痕原虫基因组为模板，SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示核苷酸为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为95°C预变性2min ;95°C变性10s、54°C退火20s、68°C延伸lmin，共35个循环；最后68°C后延伸5min，得UIS3基因；
[0031](2)根据pEGFP-Nl (GenBank:U55762.1)载体上的GFP的核苷酸序列设计扩增GFP的引物，上游引物为 5' -cgggatccggacgagctgtacaagtaa-31 , (SEQ ID N0.3),黑体表示BamHI 酶切位点，下游引物为 5' -gctctagaatggtgagcaagggcgagg-31 (SEQ ID N0.4),黑体表示XbaI酶切位点，然后以pEGFP-Nl载体为模板，以SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，PCR扩增条件为95°C预变性2min ;95°C变性10s、55°C退火20s、68°C延伸lmin，共30个循环；最后68°C后延伸5min，得GFP基因；
[0032](3)将步骤(1)扩增的nS3基因用KpnI和NarI进行双酶切，然后将酶切产物与经相同酶酶切的 pL0003 载体(pL0003 载体来源于 The Malaria Research and ReferenceReagent Resource Center:MRA-772pL0003Plasmodium berghei)连接，再将步骤(2)所得GFP基因用BamHI和XbaI进行双酶切，然后与经相同酶切的含WS3基因的pL1003载体连接，得基因敲除质粒，基因敲除质粒的图谱如图3所示。
[0033]从_70°C取出感受态菌DH5a于冰上放置5min，按100 μ L感受态菌加IOOpg基因敲出质粒，混匀，冰上放置30~40min，42°C热激45s后立即放置冰上2min进行热休克，然后加入0.35mL TB培养液，并于37°C、225r/min条件下培养I小时，4000rpm条件离心5min，弃去大部分上清，留约60 μ L铺含氨苄青霉素(100 μ g/mL)的TB培养基平板，37°C过夜培养。取单克隆至含50mL TB培养基的锥形瓶中，在37°C、300r/min条件下震荡培养过夜，菌液用Qiagen质粒大抽试剂盒进行抽提，测定质粒DNA浓度及纯度；然后用限制性内切酶SacII将质粒线性化，通过凝胶电泳进行胶回收，将终浓度稀释至2 μ g/μ L，_20°C保存备用。[0034]实施例3
[0035]疟原虫成熟裂殖体的转染，包括如下步骤:
[0036](I)将实施例分离获得的疟原虫成熟裂殖体沉淀用ImL疟原虫培养基重悬，再加入9mL疟原虫培养基充分混匀，然后将IOmL的疟原虫成熟裂殖体悬液加入至10个1.5mL的EP管中，每管ImL,可同时满足10次敲除；
[0037](2)将步骤(1)分装的含有裂殖体的EP管在16000g条件下离心5s，去除上清，沉淀用100 μ L含有实施例2制得的线性化基因敲除质粒的寄生虫电转液重悬，然后将转移悬液转移至电转 杯中，选择程序U33进行电转，完毕后将产物通过尾静脉注射至小鼠体内，24h后开始饲喂乙胺嘧啶药水进行筛选5~6天；乙胺嘧啶药物水的配制方法为:首先用二甲基亚砜将乙胺嘧啶配制成7mg/mL的原液，然后用pH3.5~5的自来水稀释100倍；
[0038](3)取感染小鼠尾静脉血涂片观察原虫率，当原虫率达到2%~5%时，摘除眼球取血,收集红内期疟原虫,然后提取疟原虫基因组DNA ；
[0039](4)设计引物检测判断敲除是否成功，基因敲除质粒的敲除原理图如图4所示。根据敲除原理设计扩增nS3基因的引物，上游引物为5’ -aacaccctcaatgtcttt-3’ (SEQ IDN0.5)，5’ -atccctactttcatctaa-3’ (SEQ ID N0.6)，然后以转染后疟原虫基因组 DNA 为模板，进行PCR扩增，同时以野生型疟原虫基因组DNA为模板进行扩增，作为对照，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5A所示。由图5A可知，野生型疟原虫能够扩增出条带，而转染组不能扩增出目的条带，表明转染组疟原虫nS3基因被成功敲除。然后设计检测5’端插入序列(5，int)和3’端插入序列(3’ int)的引物，检测5’端插入序列的上游引物为5，-gtaagcctacaaataaaaatg-3，(SEQ ID N0.7)和 5，-cactaaatataagctaattatg-3J (SEQID N0.8),检测 3’端插入序列的上游引物为 5’-gaatttatgaccatattaaa-3’ (SEQ ID N0.9)和5’-ttttaatgtgttattttatt-3’ (SEQ ID N0.10)，然后分别以转染后疟原虫基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为95°C预变性2min ;95°C变性10s，54°C退火20s，68°C延伸lmin，共35个循环；68°C后延伸3min，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5B所示。由图5B可知，扩增出现了目的条带，表明基因敲除质粒在疟原虫中发生了同源重组，将载体序列整合入了疟原虫基因组中。
[0040]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.体外快速增殖疟原虫成熟裂殖体的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)选择原虫率为25~30%的液氮冻存疟原虫，将其置于37°C恒温水浴锅内迅速解冻，离心，沉淀用疟原虫培养基重悬后再加入疟原虫培养基洗涤，离心收集沉淀，所述疟原虫培养基为含有胎牛血清、红细胞、肝素、青霉素和链霉素的RPMI1640培养基； (2)将步骤(1)所得沉淀用所述疟原虫培养基重悬，再加入所述疟原虫培养基混匀，在培养液中灌输N2、CO2和O2的混合气体，灌输完毕立即封闭瓶口，然后置于37°C、100r/min的条件下培养12~14小时； (3)取新鲜配制的体积分数为72%Percoll分离液，然后向分离液中加入步骤(2)的培养液，并用水平式离心机在350g条件下离心25min，离心完毕，取中间层液体，然后用所述疟原虫培养基清洗,离心弃上清,得疟原虫成熟裂殖体。
2.根据权利要求1所述体外培养快速增殖疟原虫成熟裂殖体的方法，其特征在于:所述疟原虫培养基中胎牛血清的体积分数为20%，红细胞的体积分数为10%，肝素的浓度为75000单位/L，青霉素的浓度为IO5单位/L，链霉素的浓度为100mg/L。
3.根据权利要求1所述体外培养快速增殖疟原虫成熟裂殖体的方法，其特征在于:所述步骤(2)中， 所述混合气体中N2、C02和O2的体积分数分别为90%、5%和5%。
4.根据权利要求1所述体外培养快速增殖疟原虫成熟裂殖体的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，所述混合气体的灌输时间为90s。
5.根据权利要求1-4任一项所述体外培养快速增殖疟原虫成熟裂殖体的方法，其特征在于:所述体积分数为72% Percoll分离液的制备方法为取Percoll原液与浓度为1.5M的NaCl按体积比为1:9混合，然后浓度为0.15M的NaCl稀释至Percoll体积分数为72%。
【文档编号】C12N1/10GK103923837SQ201410186288
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年5月5日 优先权日:2014年5月5日
【发明者】付雍, 徐文岳, 丁艳 申请人:中国人民解放军第三军医大学