一种利用微生物发酵将剑麻皂苷转化成皂苷元的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用微生物发酵将剑麻皂苷转化成皂苷元的方法。该微生物菌株现保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2013年7月9日，保藏编号：CCTCCM2013322，分类命名：GLHZB22。首先，将该菌株第一次发酵制备发酵用菌，在30℃时发酵扩大培养72小时；其次，取一定量的剑麻残渣热水浸提液，按照一定比例向提取液中接种菌种，并发酵培养，此液体不含皂苷元，培养3-5天后，在液体中能够检测出剑麻皂苷元，说明皂苷上的糖基被该菌株生物降解，同时在发酵液中有皂苷元。本发明方法使用的微生物具有安全环保、成本低、降解速度快、降解率高等特点，能够推广应用于皂苷元工业生产。
【专利说明】一种利用微生物发酵将剑麻皂苷转化成皂苷元的方法
【技术领域】
[0001]本发明属生物发酵工程、生物化工和生物制药【技术领域】，特别涉及一种利用微生物发酵将剑麻皂苷转化成皂苷元的方法。
【背景技术】
[0002]剑麻皂苷元(Tigogenin)是螺甾烷醇的衍生物(5 a，25D-螺甾烷_3_羟基)，是合成甾体激素类药物的医药中间体和重要原料，广泛应用于肾上腺皮质激素、性激素及蛋白同化激素，三大类激素可以制造200多种药物。药理研究表明，这些皂苷元成分具有较明显的抗炎、抗菌、止血、抗衰老和降血糖的生物活性。
[0003]剑麻皂苷元是由剑麻皂苷糖基降解后得到的产物，而剑麻皂苷则主要来自于剑麻纤维传统产品之后废弃的麻汁和麻渣。目前工业上生产皂苷元的主要方法为硫酸加热回流提取法，通过多次醇提酸解以及大孔树脂吸附或活性炭吸附得到产品。此类方法存在很大的局限性。醇提酸解产生的工业废水难以处理，处理不当将会对环境造成很大的影响，同时大量的使用化学试剂增加了生产成本，造成资源浪费；大孔树脂法吸附色素成本高，树脂不能多次重复利用，废弃的树脂对环境存在着污染，活性炭吸附法存在着吸附量少且使用局限性(对食品和药品不适用)，废弃活性炭难于处理等问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种利用微生物发酵将剑麻皂苷转化成皂苷元的方法。
[0005]具体步骤为:
(I)制备培养基:
a.称取去皮土豆20(T250g，并将土豆切成1.8~2.2cm的方块，加0.5~1.5L水后加热煮沸25~35min,之后冷却至室温,用三层纱布过滤,定容滤液至0.5"?.5L,备用。
[0006]b.取0.1L步骤(1)第a制得的备用滤液置于250ml的三角瓶中，标记为I号备用，用于目的菌株的固体平面培养；取0.2L步骤(1)第a制得的备用滤液置于IL的三角瓶中，标记为2号备用，用于目的菌株的液体扩增培养。
[0007](2)目的菌株的固体平面培养:
向步骤(1)第b步中标记为I号备用的三角瓶中加入1.5g琼脂粉，用牛皮纸包扎瓶口，在1.103MPa、121°C下灭菌20min，取出后迅速地倒入直径为9cm的培养皿内，加盖，待琼脂凝固后备用，即为固体培养基；在无菌条件下，将斜面保存的目的菌株涂布在固体培养基上，30°C下培养72小时，即完成目的菌株的固体平面培养。
[0008](3)目的菌株的液体扩增培养:
将步骤(1)第b步中标记为2号备用的三角瓶在1.103MPa、121°C下灭菌20min，冷却后降至室温，然后向其中加入步骤(2)中完成目的菌株固体平面培养的菌落小饼10个，在300C以200转/分钟的速度摇床振荡培养72小时，即完成目的菌株的液体扩增培养；所述菌落小饼的直径为1cm。[0009](4)目的菌株对底物发酵制得皂苷元:
称取剑麻抽丝后的干残渣200g，加入IL自来水，煮沸提取60min后三层纱布过滤，滤液定容至1L，在1.103MPa，121°C下灭菌20min，转入2L玻璃瓶中，在无菌条件下，接入0.1L步骤(3)中完成目的菌株液体扩增培养的的菌液，30°C下以200转/分钟的速度摇床振荡发酵72小时，即制得产物。
[0010]所述目的菌株为有选择性地从土壤样品中筛选的目的菌株，该目的菌株在以剑麻残渣提取液为发酵液的发酵过程中能够降解剑麻皂苷糖基，同时制备出皂苷元，该目的菌株现保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，该典型培养物保藏中心地址为:中国武汉武汉大学，邮编:430072，保藏日期:2013年7月9日，保藏编号:CCTCCM2013322，分类命名:GLHZB22。
[0011]通过色谱法能够检测到皂苷元，通过比色法能够检测出产物中皂苷和皂苷元的含量，检测结果表明剑麻皂苷被有效地降解为皂苷元。
[0012]本发明方法利用目的菌株的发酵能够降解剑麻皂苷糖基而转化成皂苷元，它对剑麻皂苷糖基具有降解效率高、成本低、无残留、无污染、安全环保等特点，符合绿色环保工业化生产的趋势，同时也是和谐生态发展的需要。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为在1000倍下观察到的本发明中微生物菌群的形态照片。
[0014]图2为在20000倍下观察到的本发明中微生物单一菌体的形态照片。
[0015]图3为本发明实施例中剑麻皂苷元标准品的高压液相色谱图。
[0016]图4为本发明实施例中剑麻皂苷元样品的高压液相色谱图。
[0017]图5为本发明实施例制得的剑麻皂苷元的分子结构图。
【具体实施方式】
[0018]实施例:
(I)制备培养基:
a.称取去皮土豆220g,并将土豆切成2cm的方块,加1.1L水后加热煮沸30min,之后冷却至室温，用三层纱布过滤，定容滤液至1.1L,备用。
[0019]b.取0.1L步骤(1)第a制得的备用滤液置于250ml的三角瓶中，标记为I号备用，用于目的菌株的固体平面培养；取0.2L步骤(1)第a制得的备用滤液置于IL的三角瓶中，标记为2号备用，用于目的菌株的液体扩增培养。
[0020](2)目的菌株的固体平面培养:
向步骤(1)第b步中标记为I号备用的三角瓶中加入1.5g琼脂粉，用牛皮纸包扎瓶口，在1.103MPa、121°C下灭菌20min，取出后迅速地倒入直径为9cm的培养皿内，加盖，待琼脂凝固后备用，即为固体培养基；在无菌条件下，将斜面保存的目的菌株涂布在固体培养基上，30°C下培养72小时，即完成目的菌株的固体平面培养。 [0021](3)目的菌株的液体扩增培养:
将步骤(1)第b步中标记为2号备用的三角瓶在1.103MPa、121°C下灭菌20min，冷却后降至室温，然后向其中加入步骤(2)中完成目的菌株固体平面培养的菌落小饼10个，在300C以200转/分钟的速度摇床振荡培养72小时，即完成目的菌株的液体扩增培养；所述菌落小饼的直径为1cm，菌株形态见图1和图2。
[0022](4)目的菌株对底物发酵制得皂苷元:
称取剑麻抽丝后的干残渣200g，加入IL自来水，煮沸提取60min后三层纱布过滤，滤液定容至1L，在1.103MPa，121°C下灭菌20min，转入2L玻璃瓶中，在无菌条件下，接入0.1L步骤(3)中完成目的菌株液体扩增培养的的菌液，30°C下以200转/分钟的速度摇床振荡发酵72小时，即制得产物。
[0023]所述目的菌株现保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，该典型培养物保藏中心地址为:中国武汉武汉大学，邮编:430072，保藏日期:2013年7月9日，保藏编号:CCTCCM2013322，分类命名:GLHZB22。
[0024]检测如下:
一、比色法制备皂苷标准曲线:
称量皂苷标准品5.0mg,用甲醇溶解并定容至5mL，然后分别吸取0.1,0.2,0.3,0.4、0.5、0.6和0.7mL置25mL具塞试管中，以空白管作对照，在70°C下烘干后冷却至室温；各管中依次加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸0.8mL,摇匀后置于70°C烘箱中加热15min，取出后迅速流水冷却至室温，再分别加入5mL冰醋酸，摇匀，于450nm处测定吸光度；以含量为横坐标，吸光度为纵坐标制备标准曲线，得到标准曲线y=l.4598X+0.0307，R2为
0.9922, x=0-0.7mg，相关性好。比色法检测发酵前后发酵液中皂苷和皂苷元的含量，结果表明发酵液中剑麻皂苷被有效地降解为皂苷元，见表1。
[0025]表1发酵前后皂苷和皂苷元含量的变化(mg/mL)
【权利要求】
1.一种利用微生物发酵将剑麻皂苷转化成皂苷元的方法，其特征在于具体步骤为: (1)制备培养基: a.称取去皮土豆20(T250g，并将土豆切成1.8~2.2cm的方块，加0.5~1.5L水后加热煮沸25~35min,之后冷却至室温,用三层纱布过滤,定容滤液至0.5"?.5L,备用； b.取0.1L步骤(1)第a制得的备用滤液置于250ml的三角瓶中，标记为I号备用，用于目的菌株的固体平面培养；取0.2L步骤(1)第a制得的备用滤液置于IL的三角瓶中，标记为2号备用，用于目的菌株的液体扩增培养； (2)目的菌株的固体平面培养: 向步骤(1)第b步中标记为I号备用的三角瓶中加入1.5g琼脂粉，用牛皮纸包扎瓶口，在1.103MPa、121°C下灭菌20min，取出后迅速地倒入直径为9cm的培养皿内，加盖，待琼脂凝固后备用，即为固体培养基；在无菌条件下，将斜面保存的目的菌株涂布在固体培养基上，30°C下培养72小时，即完成目的菌株的固体平面培养； (3)目的菌株的液体 扩增培养: 将步骤(1)第b步中标记为2号备用的三角瓶在1.103MPa、121°C下灭菌20min，冷却后降至室温，然后向其中加入步骤(2)中完成目的菌株固体平面培养的菌落小饼10个，在300C以200转/分钟的速度摇床振荡培养72小时，即完成目的菌株的液体扩增培养；所述菌落小饼的直径为Icm ； (4)目的菌株对底物发酵制得皂苷元: 称取剑麻抽丝后的干残渣200g，加入IL自来水，煮沸提取60min后三层纱布过滤，滤液定容至1L，在1.103MPa，121°C下灭菌20min，转入2L玻璃瓶中，在无菌条件下，接入0.1L步骤(3)中完成目的菌株液体扩增培养的的菌液，30°C下以200转/分钟的速度摇床振荡发酵72小时，即制得含有皂苷元的产物； 所述目的菌株为有选择性地从土壤样品中筛选的目的菌株，该目的菌株在以剑麻残渣提取液为发酵液的发酵过程中能够降解剑麻皂苷糖基，同时制备出皂苷元，该目的菌株现保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期:2013年7月9日，保藏编号:CCTCCM2013322，分类命名:GLHZB22。
【文档编号】C12P33/20GK103966300SQ201410221277
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月25日 优先权日:2014年5月25日
【发明者】郝再彬, 孙昊, 王彦超, 周菲菲, 李霞, 王秀丽 申请人:桂林理工大学