念珠菌分型检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种念珠菌分型检测试剂盒，包括：（1）一个基因芯片，其上带有：(i)念珠菌的13个不同型别的核苷酸序列探针，其中探针为SEQIDNos：1-13或与SEQIDNos:1-13互补的序列；(ii)标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQIDNo.14；(iii)带有编码β-球蛋白部分的DNA序列,序列为SEQIDNo.15；（2）各种引物，序列为SEQIDNos.16-21。本发明所述念珠菌分型检测试剂盒提供了检测念珠菌分型联合检测平台，可实现同步联合检测、提高检测特异性、降低成本、缩短检测时间，对开展念珠菌临床早期诊断和人群筛查具有重大的意义。
【专利说明】念珠菌分型检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种用于诊断多种常见致病念珠菌的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]念珠菌(Candida Albicans,拉丁文:Nostoc丄是真菌中最常见的条件致病菌,又称假丝酵母。它常寄生于人的皮肤、口腔、阴道和肠粘膜等处，当机体免疫机能低下或正常寄居部位的微生态环境失调，容易引起念珠菌病。念珠菌可引起皮肤粘膜浅层或全身系统性感染，感染不同部位可引起不同的疾患，除皮肤念珠菌病外，还有念珠菌性口腔炎、阴道炎、膀胱炎、肾盂肾炎、脑膜炎、菌血症和胆道感染等。近年来，由于免疫受损人群不断增多(包括恶性肿瘤、血液病、艾滋病、糖尿病、自身免疫病、严重烧伤和创伤、吸毒和人口老龄化等)和广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛使用甚至是滥用，器官移植、放疗化疗和导管技术的发展普及等因素的影响，深部念珠菌感染的发病率急剧上升。临床上常见的致病念珠菌包括白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌和都柏林念珠菌等，不同的念珠菌具有不同的药物敏感性和耐药性。
[0003]深部真菌感染的病原菌以念珠菌和曲霉最为常见。据美国的一项大规模院内流行病学调查显示，念珠菌属引起的真菌感染已经成为美国院内血行感染(bloodstreaminfections,BSIs)的第四大病因，并占院内真菌性感染的四分之三，死亡率占据所有院内机会感染的第一位。念珠菌血症在普通住院病人中的发病率为0.1-3.7%。，而在I⑶患者中的发生率为1.12-94%0。
[0004]随着抗真菌药物的临床应用，特别是三唑类抗真菌药物的广泛应用，系统性和侵袭性念珠菌病的致病菌菌谱发生了较大的变化。由非白念珠菌引起的感染比率逐年上升，如克柔念珠菌(约占2-4%)、光滑念珠菌(约占8-18%)、热带念珠菌(约占11-25%)、近平滑念珠菌(约占7-15%)、以及近年来出现的葡萄牙念珠菌、挪威念珠菌和都柏林念珠菌等。但白念珠菌仍是发生侵袭性念珠菌感染最常见的致病菌(约占50-59%)，也是在胃肠道和生殖道中以及皮肤表面最常分离出的念珠菌。值得警惕和重视的是，光滑念珠菌和克柔念珠菌引起的感染近年来显著上升，且这两种念珠菌对哗类药物不敏感甚至天然耐药性，因此有必要将念珠菌进行有效区分。
[0005]深部念珠菌病常继发于严重的基础病，很容易造成侵袭性感染，死亡率居高不下。有资料显示，早期、正确的诊断可以显著提高深部真菌感染者的生存率。而妨碍临床医生作出早期准确诊断的因素主要有:一是深部真菌感染的临床表现缺乏特异性；二是真菌培养和鉴定的周期长，念珠菌需要2.3天，丝状真菌需要I一2周，甚至更长的时间，而且阳性率不高；三是在大多数的医院缺乏专业的真菌检验技术人员，无力开展真菌培养和鉴定工作。
[0006]真菌感染的实验室诊断仍沿用传统的镜检加培养方法，有时辅以组织病理学检查。而这几种方法的敏感性和特异性都有限，如念珠菌血症的血培养阳性率只有50%左右。目前，念珠菌的鉴定主要依靠芽管试验、CHR0MAgar、AP1.20、糖源和氮源利用实验，比较烦琐，因必须在初代培养获得菌落的基础上，故所需时间较长，一般要2.3天，甚至更长的时间，而且易受主观因素的影响。
[0007]因此采用新的技术和方法提高真菌鉴定的敏感性、特异性和稳定性成为深部念珠菌病诊断的迫切要求。以PCR方法为基础的分子生物学技术具有操作简单、可重复性、较高的敏感性和特异性，越来越受到重视。这对于深部真菌感染的早期和准确诊断是一个很好的帮助，特别是对于患有严重基础疾病患者，无疑更是雪中送炭，至关重要。目前以PCR方法为基础的分子生物学技术检测念珠菌只是检测其中一种或是几种，涵盖的亚型少，往往容易造成检测的疏漏。因此研制和开发一种特异性强、敏感性高同时又快速、经济，能同时检验多种常见致病念珠菌检测方法显得尤为重要，对念珠菌的诊断和治疗起着重要的作用。
【发明内容】
[0008]本发明目的主要是为了弥补现有念珠菌检测在分型方面的不足，提供一种可以同时检测多种常见致病念珠菌检测试剂盒。
[0009]本发明的一种念珠菌分型检测试剂盒，包括:
(I) 一个基因芯片，其上带有:
(i)念珠菌的13个不同型别的核苷酸序列探针(共13条探针)，其中探针为SEQID Nos:1-13或与SEQ IDNos: 1_13互补的序列，具体序列如下:
名称序列号序列
CA PN SEQ ID N0.1 ATTGCTTGCGGCGGTAACGTCC CG PN SEQ ID N0.2 TAGGTTTTACCAACTCGGTGTT CT PN SEQ ID N0.3 AACGCTTATTTTGCTAGTGGCC CK PN SEQ ID N0.4 GGCCGAGCGAACTAGACTTTT CD PN SEQ ID N0.5 AAGGCGGTCTCTGGCGTCGCCC Cg PN SEQ ID N0.6 AACAATACCAGAAATATCC CL PN SEQ ID N0.7 TATTTCGGAGCAACGCCT CF PN SEQ ID N0.8 CCTAGAATACCGAGAAATATA CN PN SEQ ID N0.9 GTACTTCGCTCAGTCCCG CP PN SEQ ID N0.10 ACAAACTCCAAAACTTCTTCCA CP I PN SEQ ID N0.11 TGGCAGGCCCCATATAGAA CP ΠΡΝ SEQ ID N0.12 ATTAGTTAATCAAGTTGACAATTAA CP IIIPN SEQ ID N0.13 TGACTATTAGTTAATCAGTTGACTT
(ii)标记有生物素点的DNA序列(Bio)，用于监控杂交是否成功，序列为SEQIDN0.14: Bio CGTCCAAGGGGAAACTGATCT SEQ ID N0.14 ； (iii)带有编码β_球蛋白部分的DNA序列(1C)，作为内控点，用于监控PCR体系是否成功，序列为SEQ IDN0.15:1C CACAAGTATCACTAAGCTCG SEQ ID N0.15;
(2 )各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，其特异性扩增引物的DNA序列为SEQID Nos.16-21，具体序列如下:名称序列号序列
ZJ-1TS-F SEQ ID N0.16 TTCTCGCATCGATGAAGARCGCA
ZJ-1TS-R SEQ ID N0.17 TCCTCCGCTTATTGATATGC
CP-F SEQ ID N0.18 GTAACAAGGTTTCCGTAGGT
CP-R SEQ ID N0.19 GTTGAAAGTTTTGACTATTA
IC-F SEQ ID N0.20 GCAGGCTGCCTATCAGAAAGTG
IC-R SEQ ID N0.21 CACAAGTATCACTAAGCTCG
本发明针对各种探针的长度一般在14-25个碱基左右，探针5'或3'端进行胺基化处理。本发明设计的探针有着合理的碱基成分、Tm值相近，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。
[0010]本发明上述的试剂盒，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。
[0011]本发明上述的试剂盒，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。
[0012]本发明上述的试剂盒，所述引物的5'端标记有生物素。
[0013]本发明所述基因芯片的制备方法，包括如下步骤:
(1)DNA探针的制备:合成与念珠菌DNA互补的5'或3'末端经过胺基化的DNA片段 从念珠菌DNA中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计并合成5'或3'末端
经过胺基化的DNA片段；
(2)固定探针:将上述探针固定在活化处理好的尼龙膜上
先对尼龙膜进行活化处理，然后将探针点到膜上，通过探针末端的氨基与活化膜上的羧基形成共价结合，牢固地将探针固定在膜上；
(3)制备基因芯片:利用氢氧化钠停止反应，制得基因芯片。
[0014]利用本发明所述的试剂盒检测念珠菌基因分型的方法包括以下步骤:利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA ;对扩增后的DNA进行杂交；检测基因芯片表面上结合的DNA。
[0015]具体步骤如下:
第一步:扩增样品
将待检样品中提取得DNA通过本发明特异性引物进行PCR扩增，所用引物5'端标记生物素，扩增得到5'端带有生物素标记的DNA产物；
第二步:杂交
使用核酸导流杂交技术平台或者任何形式的核酸水平上的杂交技术，将上述扩增得到的DNA与基因芯片上面分布的核苷酸探针进行反应；
第三步:显色
在碱性磷酸酶AP酶的作用下，利于NBT/BCIP系统显色，肉眼直接观察结果或者利用相应的仪器读取信号并进行分析。
[0016]在基因检测中，由于操作步骤繁瑣，操作失误难以避免，本发明在试剂盒中使用了标记有生物素点的DNA序列和带有编码β-球蛋白部分的DNA序列，分别用于监控杂交和PCR体系是否成功，便于操作人员在检测过程出错时，快速区分是在PCR时出错还是在杂交时出错，以便迅速找出发生错误的原因，缩短检测时间。另外，在现有技术中，由于探针载体多采用玻璃等，通透性差，一般只能使用传统杂交方法进行杂交，操作起来较为麻烦，检测时间长，一般至少都在6个小时以上，而且显色结果的背景不干净；本发明使用尼龙膜做为探针载体，由于尼龙膜较其它固体支持物(如玻璃等)具有良好的通透性，不但利于导流杂交技术的应用，且具有很好的弹性，便于生产和操作，缩短了检测时间，只需要
3.5小时左右，显色结果的背景干净。
[0017]本发明所述念珠菌分型检测试剂盒提供了检测念珠菌分型联合检测平台，可实现同步联合检测、提高检测特异性、降低成本、缩短检测时间，对开展念珠菌临床早期诊断和人群筛查具有重大的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]以下是附图的说明，便于理解上述发明的目的和具体特征。
[0019]图1是表示基因芯片上探针和监控点的类型和具体的分布位置的图片，每个位置代表不同的念珠菌型别，"Bio"代表标记有生物素点的DNA序列，〃IC〃代表带有编码β -球蛋白部分的DNA序列。
[0020]图2.1表示CA DNA分析结果的图片。
[0021]图2.2表示CG DNA分析结果的图片。
[0022]图2.3表示CT DNA分析结果的图片。
[0023]图2.4表示CK DNA分析结果的图片。
[0024]图2.5表示⑶DNA分析结果的图片。
[0025]图2.6表示Cg DNA分析结果的图片。
[0026]图2.7表示CL DNA分析结果的图片。
[0027]图2.8表示CF DNA分析结果的图片。
[0028]图2.9表示CN DNA分析结果的图片。
[0029]图2.10表示CP DNA分析结果的图片。
[0030]图2.11表示CP I DNA分析结果的图片。
[0031]图2.12表示CP Π DNA分析结果的图片。
[0032]图2.13表示CP IIIDNA分析结果的图片。
【具体实施方式】
[0033]以下通过实施例对本发明进行详细的说明。
[0034]实施例中，20%的EDAC溶液、0.1% SDS、0.25%脱脂奶粉、0.05%硫柳汞、0.05%叠氮钠均是指质量比，0.1% Tween 20是指体积比。
[0035]步骤I用于检测念珠菌基因芯片的制备 步骤1-1探针的设计
根据念珠菌的感染和致病情况基因选择出13种不同型别的念珠菌(CA、CG、CT、CK、CD、Cg、CL、CF、CN、CP、CP 1、CP n、CPm)，共设计了 13 条 DNA 探针(SEQ IDNos:1_13)，探针的长度一般在14-25个碱基左右，探针5'或3'端进行胺基化处理，并制备IC(SEQ ID N0.15)和Bio (SEQ IDN0.14)，用于念珠菌的检测。
[0036]步骤1-2 DNA探针的点样和固定 I)探针的点样和排列在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用探针稀释液(pH8.4的0.5MNa2C03和0.5MNaHC03的溶液)混合，进行点样。完成DNA探针的合成之后，启动DNA点样装置，在芯片制作程序的控制下，进行DNA探针的打印。通过DNA打印针每次取一个DNA探针，通过三维定点传递装置将DNA探针传递到指定的点样位置。完成一次打印后，荷样打印针清洗、干燥，进行下一轮探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。
[0037]2 ) DNA探针的固定方法
对尼龙膜进行处理，首先放入0.1M HCl溶液中浸泡30秒钟，然后把已除去残余溶液的膜放入20%的EDAC溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200mL的纯化水冲洗10秒钟，此步骤重复3次，再放到吸水纸上除去多余的残液。转入温度为20°C、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时。将已烘干的尼龙膜用Kimwipes纸隔开，转入封口薄膜袋中，放进点膜间的冰箱中，贮藏在4°C的温度下，备用。
[0038]通过微量移液设备将上述制备好的探针分别点在上述的尼龙膜上，每滴0.4μ L。点膜结束后，将膜放置于室温15分钟，进行反应。然后将膜转入0.1M NaOH溶液中浸泡10分钟，停止反应。将洗好的膜转入温度为20°C、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时，即制得基因芯片。
[0039]步骤2用于扩增待检样品中DNA的特异性引物的设计及检测方法 步骤2-1用于待检样品中DNA的特异性PCR引物的设计及PCR扩增
根据念珠菌DNA的序列资料设计了 2对引物(SEQ ID Nos:16-19)用于检测。PCR反应体系为40 μ L反应体系包括了 37.5 μ I PCR MIX、0.5 μ I DNA酶聚合酶、2 μ I处理好的样品DNA。反应条件为:95° C9min，95° C 变性 20s、57° C 退火 30s、72° C 延伸 50s，共 40 个循环，最后一步72° C延伸5min。获得待检测DNA样品。
[0040]步骤2-2利用DNA芯片进行检测
将步骤2-1中获得的待检测DNA样品在步骤I中制备的基因芯片进行检测，DNA样品和基因芯片中尼龙膜上的探针反应，最后根据显色情况进行判断。
[0041]将获得的扩增产物在95° C下变性5分钟，迅速转移到冰水混合物中，放置2分钟。然后加入到预先温浴到45。C的0.8 mL杂交液(2XSSC/0.1%SDS)中，混合后加入杂交仪的反应孔中，应用于步骤I制得的基因芯片，45° C杂交10分钟，然后用溶液WBl(0.5 X SSC/0.1%SDS, 42。C温浴)清洗3遍。加入0.5mL封阻液(0.25%脱脂奶粉，0.05%硫柳汞)，25。C封闭5分钟。抽干后加入0.5mL的酶标液(TBS中溶解的带有链霉亲和素标记的AP酶)，酶标5分钟。用0.8mL溶液A (TBS, 0.1% Tween20及0.05%叠氮钠)清洗4遍，然后加入0.5mL的显色液(NBT/BCIP)，避光显色5分钟。最后用溶液B冲洗3遍，晾干，分析显色情况，判读结果。
【权利要求】
1.一种念珠菌分型检测试剂盒，包括: (1) 一个基因芯片，其上带有: (i)念珠菌的13个不同型别的核苷酸序列探针，其中探针为SEQIDNos:1_13或与SEQIDNos: 1-13互补的序列； (ii)标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQID N0.14 ； (iii)带有编码β-球蛋白部分的DNA序列，序列为SEQ ID N0.15 ； (2)各种引物，序列为SEQID Nos.16-21。
2.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。
3.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。
4.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述引物的5'端标记有生物素。
【文档编号】C12Q1/04GK104004851SQ201410266795
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】郭亮, 朱娟娟, 谢龙旭 申请人:广州凯普生物科技有限公司