一种检测猪华支睾吸虫的试剂盒及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种检测猪华支睾吸虫的试剂盒，由无菌去离子水、荧光定量PCR反应液、标准品、对照品组成，荧光定量PCR反应液含有SYBRGreenReal-timePCRMasterMix、ddH2O、检测用引物。本发明试剂盒特异性强、灵敏度高、无污染、高通量，并且无需电泳，可以节省检测时间。能快速、准确地检测出被检样本中的猪华支睾吸虫DNA，可用于猪华支睾吸虫虫感染的分子流行病学调查及疗效监测。本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，操作简单，不仅省时省力而且节省了大量的试剂和耗材，提高了工作效率。在检测猪华支睾吸虫这种食源性寄生虫中的应用。
【专利说明】一种检测猪华支睾吸虫的试剂盒及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术，涉及一种检测猪华支睾吸虫食源性寄生虫的试剂盒，可以对感染猪华支睾吸虫的样本进行鉴别检测。
【背景技术】
[0002]目前我国人群流动性越来越大，生食海鲜、喜好野味的人也越来越多，各种动物源性疾病开始在非流行区播散，食源性寄生虫病已对公共卫生构成巨大的威胁。华支睾吸虫病是由华支睾吸虫sinensis)寄生于人和动物肝脏胆管和胆囊内引起的一种人畜共患寄生虫病。华支睾吸虫终末宿主是人和多种哺乳动物，中间宿主有两个，第一中间宿主是淡水螺 ，第二中间宿主为多种淡水鱼类和淡水虾。华支睾吸虫病在我国流行极为广泛，患者或患畜因虫体对胆管的机械性损伤和阻塞及虫体分泌排泄物刺激作用而引起胆管及其周围炎症，导致肝实质萎缩、硬化、功能障碍及全身性症状。而且因胆管阻塞及炎症引起的上皮增生等会导致胆管变窄，胆汁流出不畅，引起阻塞性黄疸，容易合并细菌感染引发化脓性胆管炎，肝脓肿。虫卵还可以引起结石，胆管上皮细胞增生可致癌变。调查表明，我国约为3200多万感染者，感染率居前三位的依次是广东(16.42%)、广西(9.75%)、黑龙江(4.72%)，其次是台湾、香港、吉林和辽宁。华支睾吸虫的感染不仅给人类健康造成威胁，而且也给养殖业造成巨大经济损失，严重危害养殖业的健康发展。对华南地区淡水螺和淡水鱼虾调查显示，淡水螺感染率为0.25%、淡水鱼16.94%、淡水虾5.83%。面对严峻的形势，急需简便快捷的快速诊断方法，可以对患者尽早确诊，对检出的阳性患畜或者水产品也可以尽早采取切实有效的治疗措施，降低损失。目前较常使用改良加藤厚涂片法(一粪三检)镜检虫卵，SPA协同凝集实验与ELISA等免疫学方法。镜检法费时费力，效益较低，敏感性低。SPA方法操作过程繁琐，ELISA非常敏感，但假阴性率较高。上述三种方法都不能实现现场检测，不易于推广应用。因此，对华支睾吸虫病建立一种操作简单、快速、敏感、特异的检测方法迫在眉睫。荧光定量PCR方法是一种操作简单、敏感性高、特异性强的分子生物学检测方法，可以为临床上华支睾吸虫的防治提供科学依据，而且对提高动物疫病的检测、监控水平，保障动物源性食品安全具有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种检测猪华支睾吸虫的试剂盒，该试剂盒包含:无菌去离子水、荧光定量PCR反应液、标准品、对照品。
[0004]其中，荧光定量PCR 反应液含有 SYBR Green Real-time PCR Master Mix、ddH20、检测用引物；其中检测用引物为检测华支睾吸虫的上游引物和下游引物共2条:
华支睾上游引物(SEQ ID No:1):5’ - GTATGGTGGTTATGTTGCTG-3’ ；
华支睾下游引物(SEQ ID No:2):5’ - GGATAAAGACCCTGGAAAC-3’。
[0005]标准品为猪华支睾吸虫(C sinensis)的重组质粒，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。[0006]对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有猪华支睾吸虫DNA片段的DNA样品，阴性对照为无华支睾吸虫DNA的DNA样品。
[0007]本试剂盒保存于-20 V，尽量减少反复冻融。
[0008]本发明的另一个目的是提供所述试剂盒在检测猪华支睾吸虫这种食源性寄生虫中的应用。
[0009]本发明试剂盒使用方法:
每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水依次稀释为。1.5ng/μ I, 1.5X 10 1Iig/ μ 1，1.5X 10 2ng/ μ 1，1.5X 10 3ng/ μ 1，1.5X 10 4ng/ μ I。
[0010]1.荧光定量PCR反应管制备:总体积为25μ 1，荧光定量PCR反应液于冰上融化及制备荧光定量PCR反应管。依次取PCR反应液24 μ 1，以及样本DNA (待检测样本、标准品、阳性对照品、阴性对照品)1μ I于荧光定量PCR反应管中混合。加样时注意避光操作。每个样本均需设置3个重复。将制备好的荧光定量PCR反应管瞬时高速离心5 S，尽量避免出现气泡。 [0011]2.扩增检测:把荧光定量PCR反应管置于荧光定量PCR仪上，设置反应条件为:循环阶段95 °C预变性lmin，95 °C变性10s、58°C退火15s、72 °C延伸35 s共40个循环；熔解曲线阶段:95 0C 15s，60。。lmin，95 °C 30s,60 °C 15s。
[0012]3.检测结果判定:在40个循环前，出现扩增曲线则判定为阳性，若没有出现扩增曲线则判定为阴性。
[0013]本发明的优点:本发明提供了一种猪华支睾吸虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其优点是异性强、灵敏度高、无污染、高通量，并且无需电泳，可以节省检测时间。能快速、准确地检测出被检样本中的猪华支睾吸虫DNA，也可用于猪华支睾吸虫虫感染的分子流行病学调查及疗效监测。本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，操作简单，不仅省时省力而且节省了大量的试剂和耗材，提高了工作效率。本方法是建立在分子生物学基础上的一种敏感性高、特异性强的检测方法。
[0014]【专利附图】
【附图说明】
图1华支睾吸虫标准品的荧光定量PCR标准曲线图。
[0015]图2华支睾吸虫阳性样本的荧光定量PCR检测结果。
[0016]图3本发明对采集的部分样本检测结果。
【具体实施方式】
[0017]本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
[0018]实施例一
本发明的目的是提供一种检测猪华支睾吸虫的试剂盒，该试剂盒包含:无菌去离子水、突光定量PCR反应液、标准品、对照品。
[0019]其中，荧光定量PCR 反应液含有 SYBR Green Real-time PCR Master Mix、ddH20、检测用引物；其中检测用引物为检测华支睾吸虫的上游引物和下游引物共2条(表1):
【权利要求】
1.一种检测猪华支睾吸虫的试剂盒，该试剂盒由无菌去离子水、荧光定量PCR反应液、标准品、对照品组成，其特征在于，荧光定量PCR反应液由SYBR Green Real-time PCR MasterMiX、ddH20、检测用引物组成，其中检测用引物为: 华支睾上游引物:5’ - GTATGGTGGTTATGTTGCTG-3’， 华支睾下游引物:5’- GGATAAAGACCCTGGAAAC-3’， 标准品为猪华支睾吸虫(C的重组质粒，其核苷酸序列如SEQ IDNo:3所示，对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有猪华支睾吸虫DNA片段的DNA样品，阴性对照为无华支睾吸虫DNA的DNA样品。
2.根据权利要求1所述的一种检测猪华支睾吸虫的试剂盒，其特征在于，本试剂盒保存于-20 °C，尽量减少反复冻融。
3.根据权利要求1 所述的试剂盒在检测猪华支睾吸虫中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104032013SQ201410266750
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】杜爱芳, 潘辰, 杨怡, 张红丽 申请人:浙江大学