一种用于血液中全基因组dna提取试剂盒及其方法
【专利摘要】本发明涉及一种从血液中提取全基因组DNA的试剂盒及其使用方法。其特征在于试剂盒包括红细胞裂解液、白细胞洗涤液、消化液、蛋白酶K、纯化液、gDNA盐析液、gDNA洗涤液及gDNA洗脱液等。本发明血液中全基因组DNA提取试剂盒使用方法的特征在于采用裂解红细胞后洗涤得到白细胞，将含有蛋白酶K的消化液裂解白细胞，通过改进的氯化锂纯化液进一步纯化后盐析液层析获得高纯度全基因组DNA。本发明试剂盒提取血液中全基因组DNA时，不用事先对血液中进行血浆和血清分离，只需取新鲜或冰冻的抗凝全血，最低需要的血量可达到20μl或者血斑即可。本发明试剂盒获得纯度更高的全基因组DNA可完全解链和高效地进行PCR扩增，用于PCR扩增、基因表达、基因测序、全基因组测序、外显子组测序、基因突变和单核苷酸多态性等科研或临床诊断分析。
【专利说明】—种用于血液中全基因组DNA提取试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从血液中提取全基因组DNA的试剂盒及利用其从血液中提取全基因组DNA的方法。本发明所述试剂盒提取血液中全基因组DNA时，不用事先对血液中进行血浆和血清分离，只需取新鲜或冰冻的抗凝全血，最低需要的血量可达到20 μ I或者血斑即可。其高效提取获得的高纯度的全基因组DNA，可用于PCR扩增、基因表达、基因测序、全基因组测序、外显子组测序、基因突变和单核苷酸多态性等科研或临床诊断分析。。
【背景技术】
[0002]全基因组DNA (genomic DNA, gDNA)为单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部基因信息。所有的生命信息均可以从全基因组DNA中发现，包括与疾病密切相关的基因表达、基因突变和单核苷酸多态性等问题。从基因水平分析可以早发现、早诊断所用疾病的发生，在分子遗传学和临床检测中DNA检查已有逐步取代血清学检查(ELISA检测)。因而，获取全基因组DNA是所有相关的科研和临床检测的第一步，闻效率提取获得闻纯度的全基因组DNA是至关重要的。
[0003]目前经典基因组DNA提取方法主要分为4个步骤:1.使用淋巴细胞分离液梯度离心分离得到血液中白细胞，或者直接低渗透裂解红细胞后离心收集白细胞；2.使用细胞裂解液裂解白细胞释放出基因组DNA，如高氯酸钠法、SDS法、NaI法和尿素提取法等；3.有机溶剂抽提去除蛋白质和血红素等杂质，即酚/氯仿抽提；4.用乙醇沉淀或透析等沉淀分离DNA。该方法具有提取的DNA纯度高、蛋白质和血红素等杂质少的优点，但该方法需要的血液样本大，残留DNA溶液中含有酚类等有机物质对DNA聚合酶有抑制作用，特别是在PCR扩增过程中会对扩增过程产生抑制作用。另外，酚、氯仿和异丙醇等有机溶剂易造成环境污染，有损操作者健康，使得该方法的应用受到一定的限制。
[0004]基因组DNA非有机溶剂提取法采用细胞裂解液使白细胞释放DNA，使用蛋白酶K、蛋白酶E、蛋白酶K和核糖核酸酶和强碱(NaOH或Κ0Η)等对蛋白质和RNA进行允分消化分解。在高盐的条件下用乙醇直接沉淀分离纯化DNA。该方法避免了使用有毒作用的有机溶剂，提取的DNA纯度较高和提取效率高，但其需要的血量大，单独使用蛋白酶消化时间很长，可能对白细胞裂解不充分，另外使用强碱对操作者健康不利，也可能影响后续PCR扩增效率。
[0005]硅胶膜离心吸附柱方法利用硅胶膜特异性吸附DNA能力，通过漂洗取出蛋白质和其他杂质，后用低盐溶液洗脱得到基因组DNA，操作中未用到酚、氯仿等有机溶剂以及强碱，但用离心柱提取的gDNA容易产生拖尾，表明其提取的gDNA纯度不高，或有降解的产生。
[0006]血液中全基因组DNA提取方法必须减少有机溶剂或强碱对操作者健康和后续实验的影响，在微量的血液样本时也能高效提取全基因组DNA，因此，使用高效裂解白细胞和纯化gDNA以及不进行血清和血浆分离的试剂盒，对高效提取高纯度全基因DNA具有广泛应用价值。
【发明内容】
[0007]本发明提供一种从血液中高效地提取全基因组DNA的试剂盒及其从血液中提取全基因组DNA的方法，用以解决减少有机溶剂或强碱对操作者健康和后续实验的影响等问题，即使在微量的血液样本时也能高效提取得到高纯度的全基因组DNA。
[0008]通过发明人多年来对上万例临床血液样本的提取全基因组DNA工作经验和技术改进，发现在含有 lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0)，0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)，0.2mol/LNaCl，10% SDS的消化液中添加20mg/ml蛋白酶K，处理后能高效地裂解白细胞，可以分解与DNA结合在一起的核蛋白，使DNA被游离释放在消化液中。也发现采用LiCl可沉淀糖类、脂类、大量蛋白质和高分子RNA，在向水浴过夜后白细胞的裂解混合液中加入含7.5mol/L LiCl的纯化液可大量去除糖类、脂类、蛋白质和高分子RNA等杂质，该过程无需再使用RNA酶消化处理，即可去除大量RNA。
[0009]本发明采用价格廉价的预冷无水乙醇即可析出大量全基因组DNA，不需要通过有机溶剂进行抽提。并且应用80%乙醇的洗涤液进行洗涤和含lmol/LTris-HCl (pH值8.0)，
0.5mol/LEDTA(pH值8.0)的洗脱液进行洗脱，将获得高纯度的全基因组DNA。因而，在此基础上研发可高效从血液中提取高纯度的全基因组DNA的试剂盒及其方法。
[0010]本发明所提供的一种血液中全基因组DNA提取试剂盒，其特征在于各组成分别为:
[0011]I)红细胞裂解液:灭菌的去离子超纯水(电阻率大于18MQ*cm)，400ml/瓶；
[0012]2)白细胞洗涤液:为0.1% (体积比)聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-XlOO)，300ml/ 瓶:
[0013]3)消化液:含lmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH值8.0),0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA) (pH值 8.0)，0.2mol/L NaCl, 10% (质量体积比)十二烷基硫酸(SDS)，40ml/支；
[0014]4)蛋白酶K:为20mg/ml蛋白酶K, Iml/支；
[0015]5)纯化液:为5-7.5mol/L氯化锂(LiCl)、氯化钠或氯化钾，40ml/瓶；
[0016]6) gDNA盐析液:无水乙醇，500ml/瓶；
[0017]7) gDNA洗涤液:为80% (体积比)乙醇，40ml/瓶；
[0018]8) gDNA 洗脱液:含 lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0)，0.5mol/L EDTA (pH值 8.0)，IOml/支。
[0019]上述gDNA提取试剂盒组份可用于Iml血量的50次血液中全基因组DNA提取，并可组成100次、200次和500次等gDNA提取试剂盒，含使用说明书一份，试剂盒保存在4°C冰箱。
[0020]所述血液中全基因组DNA提取试剂盒中纯化液，优选地为7.5mol/L氯化锂(LiCl)。
[0021]本发明所提供的血液中提取全基因组DNA的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0022]I)血液红细胞裂解:先向每个15ml离心管中加入等于血液样本8倍体积的红细胞裂解液，将血液样本加入该离心管中，手动振荡混匀，4°C放置20~30min后2000rpm(转每分钟)低速离心15min ;离心结束后，将上清液弃之(冻存血液需先放入37°C水浴锅中水浴，至血液样本融化后加入到红细胞裂解液中)；[0023]2)白细胞洗涤:向含白细胞沉淀的15ml离心管中加入2~3ml的白细胞洗涤液，混匀后放入低速水平离心机，2000rpm低速离心15min，将上清液小心弃之，可重复洗涤一次；
[0024]3)白细胞消化裂解:取0.2ml蛋白酶K加入到消化液中混匀，向每一份白细胞沉淀中加入700 μ I “消化液+蛋白酶K”的混合溶液，吹打混匀后，转移至2.0ml离心管中，56°C水浴2-3h，沉淀消失后37°C水浴过夜；
[0025]4)细胞杂质沉淀:向水浴过夜后的混合液中分别加入800μ I纯化液，振荡混匀，放入-20°C冰箱30min-lh ;然后13000rpm高速离心10min，将离心后的上清液倒入新的
2.0ml离心管中；
[0026]5) gDNA析出:上述离心后上清液快速充分震荡混匀，并迅速倒入装有13ml预冷无水乙醇的15ml离心管中；待gDNA逐渐析出，用移液器将肉眼可见的絮状漂浮物小心地挑起，转移至加有800 μ I gDNA洗涤液的1.5ml离心管中；
[0027]6) gDNA洗漆:收集完析出的gDNA后15000rpm高速离心10min,弃上清,可重复洗涤一次；洗涤完毕的gDHA敞口在超净台中开风机放置，至gDNA洗涤液完全挥发；
[0028]7) gDNA洗脱:向挥发干的gDNA中加入100-200 μ I的gDNA洗脱液，震荡混匀，在4°C冰箱中至gDNA完全溶解，即得到高纯度全基因组DNA，于_20°C保存备用。
[0029]本发明提供的用于血液中全基因组DNA提取试剂盒及其方法不限于人类的抗凝血，还可以用于哺乳 动物、禽类、两栖类动物等；需要的血液样品量最低可以达到20μ 1，甚至血斑和血迹，均可提取得到高纯度的全基因组DNA。优选地，本发明提供的用于血液中全基因组DNA提取试剂盒及其方法还可以用于冷冻储存的血液，包括在_20°C冰箱、-80°C冰箱或液氮储存的血液样本。
[0030]通过本发明所述的试剂盒及其方法得到的高纯度gDNA，其特征在于经过琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带，无拖尾和杂带；超微量分光光度计检测A260 /A280比值大于1.8，表明无蛋白和酚类物质污染；A260/A230的比值大于2.0，表明无碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染；超微量分光光度计检测Iml血量提取的gDNA效率可达到20 μ g/ml以上；满足所有基因研究和检测的样品要求。
[0031]与其它方法相比，本发明的技术优势主要表现在:
[0032]1.不用对血液中进行预处理，直接使用血液进行全基因组DNA提取，特别是使用冷冻储存的血液，因此减少二次污染机会，在科研工作和临床检测中提高了检测的准确度，使结果更加真实可信。
[0033]2.如果血液样本量很低或是血斑时，传统方法很难获取到数量高的gDNA，本发明利用了血液中基因组DNA充分从白细胞中释放出来并减少蛋白质和RNA的干扰，大大提高了检测的灵敏度，适用于微量的gDNA提取和检测。
[0034]3.本发明使用的试剂中不含苯、氯仿等有毒物质，对人体无危害。
[0035]4.本发明所用的LiCl纯化液可沉淀糖类、脂类、大量蛋白质和高分子RNA，无需用RNA酶，提取出来的gDNA纯度高和数量多，可以直接进行PCR扩增检测和后续工作。
[0036]本发明提供的血液中全基因组DNA提取试剂盒及其方法用于科研或临床诊断用的PCR扩增、基因表达、基因测序、全基因组测序、外显子组测序、基因突变和单核苷酸多态性等分析。【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1表示本发明所述的试剂盒及其方法提取血液中的全基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图。
[0038]图2表示本发明所述的试剂盒及其方法提取血迹中的全基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图。
【具体实施方式】
[0039]本发明通过自主设计的含有lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0)，0.5mol/L EDTA (pH 值
8.0),0.2mol/L NaCl, 10% SDS的消化液中联合20mg/ml蛋白酶K，经过56°C水浴2_3h，沉淀消失后37°C水浴过夜处理能高效地裂解白细胞，可以分解与DNA结合在一起的核蛋白，使DNA被游离释放在消化液中。在向水浴过夜后白细胞的裂解混合液中加入含7.5mol/LLiCl的纯化液可大量去除蛋白质和高分子RNA等杂质。
[0040]本发明采用价格廉价的预冷无水乙醇即可析出大量全基因组DNA，不需要通过有机溶剂进行抽提。并且应用80%乙醇的洗涤液进行洗涤和含lmol/LTris-HCl (pH值8.0)，
0.5mol/LEDTA(pH值8.0)的洗脱液进行洗脱，将获得高纯度的全基因组DNA。因而，在此基础上研发可高效从血液中提取高纯度的全基因组DNA的试剂盒及其方法。
[0041]本发明所提供的一种血液中全基因组DNA提取试剂盒，其特征在于各组成分别为:
[0042]I)红细胞裂解液:灭菌的去离子超纯水(电阻率大于18MQ*cm)，400ml/瓶；
[0043]2)白细胞洗涤液:为0.1% (体积比)聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-XlOO)，300ml/ 瓶:
[0044]3)消化液:含lmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH值8.0),0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA) (pH值 8.0)，0.2mol/L NaCl, 10% (质量体积比)十二烷基硫酸(SDS)，40ml/支；
[0045]4)蛋白酶K:为20mg/ml蛋白酶K, Iml/支；
[0046]5)纯化液:为 5-7.5mol/L 氯化锂(LiCl)，40ml/ 瓶；
[0047]6) gDNA盐析液:无水乙醇，500ml/瓶；
[0048]7) gDNA洗涤液:为8O % (体积比)乙醇，40ml/瓶；
[0049]8) gDNA 洗脱液:含 lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0)，0.5mol/L EDTA (pH值 8.0)，IOml/支。
[0050]本发明所提供的血液中全基因组DNA提取试剂盒的各组成制备方法如下:
[0051]I)红细胞裂解液，去离子超纯水(ddH20)(电阻率大于18ΜΩ*αιι)，经121°C，100千帕压强下灭菌20分钟处理；
[0052]2)白细胞洗涤液，50ml Triton-XlOO加入400ml灭菌的去离子超纯水中，68°C助溶，定容至500ml，制备成10% Triton-XlOO的母液；然后将IOml 10% Triton-XlOO母液加入990ml灭菌的去离子超纯水中配制成0.1% Triton-XlOO的白细胞洗涤液；
[0053]3)消化液:60.55g Tris 碱溶于 400mlddH20 中，用 HCl 调 pH 值 8.0 (浓 HCl 约加2.0ml)，用ddH20定容至500ml,经121 °C, 100千帕压强下灭菌20分钟配制成lmol/LTris-HCl (pH 值 8.0)；
[0054]93.05g EDTA-Na 盐磁力搅拌溶于 400ml ddH20 中，用 NaOH 调 pH 值 8.0 (NaOH 颗粒约加入IOg)，用ddH20定容至500ml，经121 °C，100千帕压强下灭菌20分钟配制成0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)；
[0055]5.844g NaCl 溶于 400ml ddH20 中，定容至 500ml，经 121 °C，100 千帕压强下灭菌 20分钟配制成0.2mol/L NaCl ；
[0056]20.0g SDS溶于160ml灭菌的ddH20中，68°C助溶,用灭菌的ddH20定容至200ml,配制成10% SDS ；
[0057]分别取lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0) 5ml,0.5mol/L EDTA(pH 值 8.0) 10ml,0.2mol/LNaC125mlU0% SDS25ml，用灭菌的ddH20定容至500ml，配制成消化液。
[0058]4)蛋白酶K, IOOmg蛋白酶K干粉,加入5ml灭菌的ddH20,颠倒混匀，分装成20ng/ul 200ul，存放于-20°C冰箱中备用；
[0059]5)纯化液，158.96g无水LiCl磁力搅拌，溶于400ml灭菌的ddH20中，用灭菌的ddH20定容至500ml,配制成纯化液；
[0060]6) gDNA析出液，分析纯无水乙醇，-20°C冰箱预冷，即为gDNA析出液；
[0061]7) gDNA洗涤液，取400ml分析纯无水乙醇至500ml无菌玻璃瓶中，加100mL灭菌的ddH20,颠倒混匀，配制成gDNA洗漆液；
[0062]8) gDNA 洗脱液，60.55g Tris 碱溶于 400ml ddH20 中，用 HCl 调 pH 值 8.0 (浓 HCl约加2.0ml)，用ddH20定容至500ml，经121。。，100千帕压强下灭菌20分钟配制成lmol/LTris-HCl(pH值 8.0)；
[0063]93.05g EDTA-Na 盐磁力搅拌溶于 400ml ddH20 中，用 NaOH 调 pH 值 8.0 (NaOH 颗粒约加入IOg)，用ddH20定容至500ml，经121 °C，100千帕压强下灭菌20分钟配制成0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)；
[0064]分别取lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0) 5ml 和 0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0) Iml 用灭菌的ddH20定容至500ml,配制成gDNA洗脱液。
[0065]上述gDNA提取试剂盒组份可用于Iml血量的50次血液中全基因组DNA提取，并可组成100次、200次和500次等gDNA提取试剂盒，含使用说明书一份，试剂盒保存在4°C冰箱，有效期I年。
[0066]所述血液中全基因组DNA提取试剂盒中纯化液，优选地为7.5moI/L氯化锂(LiCl)。
[0067]本发明所提供的血液中提取全基因组DNA的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0068]I)血液红细胞裂解:先向每个15ml离心管中加入等于血液样本8倍体积的红细胞裂解液，将血液样本加入该离心管中，手动振荡混匀，4°C放置20~30min后2000rpm(转每分钟)低速离心15min ;离心结束后，将上清液弃之(冻存血液需先放入37°C水浴锅中水浴，至血液样本融化后加入到红细胞裂解液中)；
[0069]2)白细胞洗涤:向含白细胞沉淀的15ml离心管中加入2~3ml的白细胞洗涤液，混匀后放入低速水平离心机，2000rpm低速离心15min，将上清液小心弃之，可重复洗涤一次；
[0070]3)白细胞消化裂解:取0.2ml蛋白酶K加入到消化液中混匀，向每一份白细胞沉淀中加入700 μ I “消化液+蛋白酶K”的混合溶液，吹打混匀后，转移至2.0ml离心管中，56°C水浴2-3h，沉淀消失后37°C水浴过夜；
[0071]4)细胞杂质沉淀:向水浴过夜后的混合液中分别加入800μ I纯化液，振荡混匀，放入-20°C冰箱30min-lh ;然后13000rpm高速离心10min，将离心后的上清液倒入新的
2.0ml离心管中；
[0072]5) gDNA析出:上述离心后上清液快速充分震荡混匀，并迅速倒入装有13ml预冷无水乙醇的15ml离心管中；待gDNA逐渐析出，用移液器将肉眼可见的絮状漂浮物小心地挑起，转移至加有800 μ I gDNA洗涤液的1.5ml离心管中；
[0073]6) gDNA洗漆:收集完析出的gDNA后15000rpm高速离心10min,弃上清,可重复洗涤一次；洗涤完毕的gDNA敞口在超净台中开风机放置，至gDNA洗涤液完全挥发；
[0074]7) gDNA洗脱:向挥发干的gDNA中加入100-200 μ I的gDNA洗脱液，震荡混匀，在4°C冰箱中至gDNA完全溶解，即得到高纯度全基因组DNA，于_20°C保存备用。
[0075]本发明提供的用于血液中全基因组DNA提取试剂盒及其方法不限于人类的抗凝血，还可以用于哺乳动物的血液，如鼠、兔、猪、羊、狗和猫；禽类、两栖类动物等；需要的血液样品量最低可以达到20μ 1，甚至血斑和血迹，均可提取得到高纯度的全基因组DNA。优选地，本发明提供的用于血液中全基因组DNA提取试剂盒及其方法还可以用于冷冻储存的血液，包括在_20°C冰箱、-80°C冰箱或液氮储存的血液样本。
[0076]通过本发明所述的试剂盒及其方法得到的高纯度gDNA，其特征在于通过如下质量控制:
[0077]提取的全基因组DNA提取效果用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，染料为溴化乙锭(EthidiumBromide, EB)替代物,在制胶的时候加入凝胶中。分别取3μ1 gDNA提取样品，加入2 μ I上样缓中液混合点样，并点样5 μ I DNA分子标准品(marker)，电泳条件为120V电压，电泳20min，电泳结果用凝胶成像系统(蓝盾-621)观察拍照，经过琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带，无拖尾和杂带，表明提取的gDNA无其他DNA污染。。
[0078]取2 μ I gDNA提取样品，以无菌去离子水为空白，用超微量分光光度计(Spectrophotometer:NanoDrop2000)测定波长为 230nm、260nm 和 280nm 的吸光度值，即A230、A260 和 A280。
[0079]利用纯dsDNA的A260/A280和A260/A230比值，评估提取DNA的纯度。本发明的试剂盒及其方法提取得到的gDNA经超微量分光光度计检测，A260/A280比值均大于1.8，表明无蛋白和酚类物质污染；A260/A230的比值均大于2.0，表明无碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染；
[0080]按照dsDNA的换算公式:DNA含量(μ g/mL全血)=A260 X 50 μ g/ml X 10 (稀释倍数)Χ50(50μ I DNA溶液)/1000(用于DNA提取的全血量为1000 μ I)，计算提取的DNA含量，超微量分光光度计检测Iml血量提取的gDNA效率可达到20 μ g/ml以上；满足所有基因研究和检测的样品要求。
[0081]质检合格的DNA将浓度调整到50ng/ml，_20°C储存备用。
[0082]本发明提供的血液中全基因组DNA提取试剂盒及其方法用于科研或临床诊断，提取得到的高纯度和数量gDNA可完全解链和高效地进行PCR扩增，满足基因表达、基因测序、外显子组测序、基因突变和单核苷酸多态性等分析。[0083]以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。
[0084]实施例一血液中全基因组DNA提取试剂盒
[0085]试剂盒各组份如下:
[0086]I)红细胞裂解液:去离子超纯水(ddH20)，电阻率大于18MQ*cm)，经121 °C，100千帕压强下灭菌20分钟处理；灭菌后每400ml分装到500ml无菌塑料瓶中；
[0087]2)白细胞洗涤液:50ml Triton-XlOO加入400ml灭菌的去离子超纯水中，68°C助溶，定容至500ml，制备成10% Triton-XlOO的母液；然后将IOml 10% Triton-XlOO母液加入990ml灭菌的去离子超纯水中配制成0.1% Triton-XlOO的白细胞洗涤液；每300ml分装到300ml无菌塑料瓶中；
[0088]3)消化液:60.55g Tris 碱溶于 400ml ddH20 中，用 HCl 调 pH 值 8.0 (浓 HCl 约加2.0ml)，用ddH20定容至500ml,经121 °C, 100千帕压强下灭菌20分钟配制成lmol/LTris-HCl(pH 值8.0)；
[0089]93.05g EDTA-Na 盐磁力搅拌溶于 400ml ddH20 中，用 NaOH 调 pH 值 8.0 (NaOH 颗粒约加入IOg)，用ddH20定容至500ml，经121 °C，100千帕压强下灭菌20分钟配制成0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)；
[0090]5.844g NaCl 溶于 400ml ddH20 中，定容至 500ml，经 121 °C，100 千帕压强下灭菌 20分钟配制成0.2mol/LNaCl ；
[0091]20.0g SDS溶于160ml灭菌的ddH20中，68°C助溶,用灭菌的ddH20定容至200ml,配制成10% SDS ；
[0092]分别取lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0) 5ml,0.5mol/L EDTA(pH 值 8.0) 10ml,0.2mol/LNaC125mlU0% SDS25ml，用灭菌的 ddH20 定容至 500ml，配制成含 lmol/L Tris-HCl (pH 值8.0)，0.511101/1^01六(？!1值8.0)，0.211101/1恥(:1，10%十二烷基硫酸(SDS)的消化液，每40ml分装到50ml无菌塑料瓶中；
[0093]4)蛋白酶K:IOOmg蛋白酶K干粉,加入5ml灭菌的ddH20,颠倒混匀，配制成20ng/ul蛋白酶K，每1ml分装到Iml无菌塑料管中，存放于_20°C冰箱中备用；
[0094]5)纯化液:158.96g无水LiCl磁力搅拌，溶于400ml灭菌的ddH20中，用灭菌的ddH20定容至500ml，配制成纯化液含7.5mol/L LiCl，每40ml分装到50ml无菌塑料瓶中；
[0095]6) gDNA盐析液:分析纯无水乙醇，每500ml分装到500ml无菌塑料瓶中；
[0096]7) gDNA洗涤液:取400ml分析纯无水乙醇至500ml无菌玻璃瓶中，加100mL灭菌的ddH20，颠倒混匀，配制成gDNA洗涤液；每40ml分装到50ml无菌塑料瓶中；
[0097]8) gDNA 洗脱液:60.55g Tris 碱溶于 400ml ddH20 中，用 HCl 调 pH 值 8.0 (浓 HCl约加2.0ml)，用ddH20定容至500ml，经121C，100千帕压强下灭菌20分钟配制成lmol/LTris-HCl(pH值 8.0)；
[0098]93.05g EDTA-Na 盐磁力搅拌溶于 400ml ddH20 中，用 NaOH 调 pH 值 8.0 (NaOH 颗粒约加入IOg)，用ddH20定容至500ml，经121 °C，100千帕压强下灭菌20分钟配制成0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)；
[0099]分别取lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0) 5ml 和 0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0) Iml 用灭菌的ddH20定容至500ml,配制成gDNA洗脱液,每IOml分装到IOml无菌塑料管中。
[0100]由上述8种试剂做成的gDNA提取试剂盒可用于Iml血量的50次血液中全基因组DNA提取，并可组成100次、200次和500次等gDNA提取试剂盒，含使用说明书一份，试剂盒保存在4 °C冰箱，有效期为I年。
[0101]实施例二使用本发明试剂盒提取冻存血液中全基因组DNA
[0102]采集8位临床糖尿病视网膜病变患者和7位正常人5ml EDTA抗凝血(与合作单位科研合作项目，经医院伦理委员会同意，并与志愿者签署知情同意书)。
[0103]I)血液红细胞裂解:先将冻存血液从_80°C冰箱中取出放入37°C水浴锅中水浴，至血液样本融化。向每个15ml离心管中加入8ml的红细胞裂解液，并加入1ml血液样本，手动振荡混匀，4°C放置20min后2000rpm低速离心15min ;离心结束后，将上清液弃之；
[0104]2)白细胞洗涤:向含白细胞沉淀的15ml离心管中加入2ml的白细胞洗涤液，混匀后放入低速水平离心机,2000rpm低速离心15min，将上清液小心弃之，可重复洗涤一次；
[0105]3)白细胞消化裂解:取0.2ml蛋白酶K加入到消化液中混匀，向每一份白细胞沉淀中加入700 μ I “消化液+蛋白酶K”的混合溶液，吹打混匀后，转移至2.0ml离心管中，56°C水浴2-3h，沉淀消失后37°C水浴过夜；
[0106]4)细胞杂质沉淀:向水浴过夜后的混合液中分别加入800μ I纯化液，振荡混匀，放入_20°C冰箱30min ;然后13000rpm高速离心10min，将离心后的上清液倒入新的2.0ml离心管中；
[0107]5) gDNA析出:上述离心后上清液快速充分震荡混匀，并迅速倒入装有13ml预冷无水乙醇的15ml离心管中；待gDNA逐渐析出，用移液器将肉眼可见的絮状漂浮物小心地挑起，转移至加有800 μ I gDNA洗涤液的1.5ml离心管中；
[0108]6) gDNA洗漆:收集完析出的gDNA后15000rpm高速离心10min,弃上清,可重复洗涤一次；洗涤完毕的gDNA敞口在超净台中开风机放置，至gDNA洗涤液完全挥发；
[0109]7) gDNA洗脱:向挥发干的gDNA中加入100-200 μ I的gDNA洗脱液，震荡混匀，在4°C冰箱中至gDNA完全溶解，即得到高纯度全基因组DNA，于_20°C保存备用。
[0110]提取的全基因组DNA提取效果用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，染料为溴化乙锭(EthidiumBromide, EB)替代物,在制胶的时候加入凝胶中。分别取3μ1 gDNA提取样品，加入2 μ I上样缓冲液混合点样，并点样5 μ I DNA分子标准品(marker)，电泳条件为120V电压，电泳20min，电泳结果用凝胶成像系统(蓝盾-621)观察拍照，图1显示琼脂糖凝胶电泳检测提取的全基因组DNA均为单一条带，无拖尾和杂带，表明提取的gDNA无其他DNA污染。
[0111]实施例三使用本发明试剂盒提取血迹中全基因组DNA
[0112]取8位临床患者Iml抗凝血分别加入到破旧衣服中，室温放置2-3天。将沾有血迹的布块剪下，分别放入加有30ml红细胞裂解液的50ml离心管中，漩涡振荡5min，4°C放置20min后用镊子取出布块,尽量让液体滴干,然后2000rpm低速离心15min ;离心后弃上
清液；
[0113]向含白细胞沉淀的50ml离心管中加入30ml的白细胞洗涤液，混匀后低速离心机，1000rpm低速离心10min,将上清液小心弃之,重复洗漆2次；其余步骤按照实施例二中步骤3-7完成，提取的全基因组DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，图2显示琼脂糖凝胶电泳检测提取的全基因组DNA均为单一条带，无拖尾和杂带，表明提取的gDNA无其他DNA污染。[0114]实施例四提取的gDNA纯度检测和定量
[0115]取实施例二和三中提取的gDNA2y I样品，以无菌去离子水为空白，用超微量分光光度计(Spectrophotometer:NanoDrop2000)测定波长为 230nm、260nm 和 280nm 的吸光度值，即A230、A260和A280，按照NanoDrop2000仪器使用说明书进行测定。利用纯dsDNA的A260/A280和A260/A230比值，评估提取DNA的纯度，以及按照dsDNA的换算公式:DNA含量(μ g/mL 全血)=A260 X 50 μ g/ml X 10 (稀释倍数)X 50 (50 μ I DNA 溶液)/1000 (用于DNA提取的全血量为ΙΟΟΟμ 1)，计算提取的DNA含量，本发明的试剂盒及其方法提取得到的gDNA纯度和含量测定见表一。
[0116]表一:
[0117]
【权利要求】
1.一种用于从血液中提取高纯度全基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括红细胞裂解液、白细胞洗涤液、消化液、蛋白酶K、纯化液、gDNA盐析液、gDNA洗涤液及gDNA洗脱液；采用所述试剂盒提取血液中全基因组DNA时，不用事先对血液中进行血浆和血清分离，只需取新鲜或冰冻的抗凝全血。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，各组成分别为: 1)红细胞裂解液:灭菌的去离子超纯水，400ml/瓶； 2)白细胞洗涤液:体积比为0.1 %的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-XlOO)，300ml/瓶； 3)消化液:含lmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.2mol/L NaCl，质量体积比为10g/ml的十二烷基硫酸(SDS)，40ml/支； 4)蛋白酶K:为20mg/ml的蛋白酶K, Iml/支； 5)纯化液:为5-7.5mol/L的氯化锂(LiCl)，40ml/瓶；
6)gDNA盐析液:无水乙醇，500ml/瓶； 7)gDNA洗涤液:体积比为80%的乙醇，40ml/瓶；
8)gDNA 洗脱液:含 lmol/L Tris-HCl, 0.5mol/L EDTA，10ml/支。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述gDNA提取试剂盒组份可用于Iml血量的50次血液中全基因组DNA提取，并可组成100次、200次和500次gDNA提取试剂盒，含使用说明书一份，试剂盒保存在4°C冰箱。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述纯化液优选地为7.5mol/L的氯化锂(LiCl)。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，将提取得到的所述gDNA采用琼脂糖凝胶电泳检测，该琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带，无拖尾和杂带。
6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，将提取得到的所述gDNA采用超微量分光光度计检测，检测结果为A260/A280比值大于1.8，无蛋白和酚类物质污染；A260/A230的比值大于2.0，无碳水化合物、盐类或有机溶剂污染。
7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，将提取得到的所述gDNA采用超微量分光光度计检测，超微量分光光度计检测Iml血量提取的gDNA效率达到20μ g/ml以上；满足所有基因研究和检测的样品要求。
8.根据权利要求2-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述灭菌的去离子超纯水的电阻率大于18ΜΩ*αιι;所述Tris-HCl、EDTA的pH值均为8.0。
9.一种采用权利要求1-8任一项所述的试剂盒从血液中提取高纯度全基因组DNA的方法，其特征在于，其包括以下步骤: 1)血液红细胞裂解:先向每个15ml离心管中加入等于血液样本8倍体积的红细胞裂解液，将血液样本加入该离心管中，手动振荡混匀，4°C放置20~30min后2000rpm低速离心15min ;离心结束后，将上清液弃之； 2)白细胞洗涤:向含白细胞沉淀的15ml离心管中加入2~3ml的白细胞洗涤液，混匀后放入低速水平离心机,2000rpm低速离心15min，将上清液小心弃之，重复洗涤一次； 3)白细胞消化裂解:取0.2ml蛋白酶K加入到消化液中混匀，向每一份白细胞沉淀中加入700 μ I消化液与蛋白酶K的混合溶液，吹打混匀后，转移至2.0ml离心管中，56°C水浴2_3h，沉淀消失后37°C水浴过夜；4)细胞杂质沉淀:向水浴过夜后的混合液中分别加入800μ I纯化液，振荡混匀，放入-20°C冰箱30min-lh ;然后13000rpm高速离心10min,将离心后的上清液倒入新的2.0ml离心管中； 5)gDNA析出:将上述离心后的上清液快速充分震荡混匀，并迅速倒入装有13ml预冷无水乙醇的15ml离心管中；待gDNA逐渐析出，用移液器将肉眼可见的絮状漂浮物挑起，转移至加有800 μ I gDNA洗涤液的1.5ml离心管中； 6)gDNA洗涤:收集完析出的gDNA后15000rpm高速离心10min，弃上清，可重复洗涤一次；洗涤完毕的gDNA敞口在超净台中开风机放置，至gDNA洗涤液完全挥发； 7)gDNA洗脱:向挥发干的gDNA中加入100-200 μ I的gDNA洗脱液，震荡混匀，在4°C冰箱中至gDNA完全溶解，即得到高纯度全基因组DNA，于_20°C保存备用。
10.权利要求1-9任一项所述试剂盒在基因表达、基因测序、全基因组测序、外显子组测序、基因突变或单核苷 酸多态性分析上的应用。
【文档编号】C12N15/10GK104017800SQ201410276330
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】曾沃坦, 黄启明, 梁辰, 陈建勋, 郑英海 申请人:益百尚(北京)生物技术有限责任公司