可培养的微生物细胞的数目的测定方法
【专利摘要】本发明涉及可培养的微生物细胞的数目的测定方法。该方法包含：(i)使所述样品与至少一种以一速率缔合微生物细胞膜的信号发射剂接触；(ii)从所述样品中去除未缔合的信号发射剂；(iii)在所述第一时间段(T1)后，于第二时间段(T2)期间，且在此期间来自所述微生物细胞的所述信号基本上保持在所述平台期，检测可培养微生物细胞的数目；和(iv)根据所检测的可培养微生物细胞的数目，测定所述样品中可培养细胞的数目。本发明的方法用常规信号发射剂对样品染色之后在数分钟内即可定量测量样品中可培养微生物细胞的量。
【专利说明】可培养的微生物细胞的数目的测定方法
[0001] 本发明是申请日为2009年7月9日、申请号为200980126982. 6、发明名称为"用 于进行可培养细胞计数的方法、试剂盒和系统"的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002] 本发明涉及用于定量测量样品中的细胞量的方法、试剂盒和系统。 现有技术
[0003] 以下是被认为与描述本发明所属领域中的技术状态有关的技术的清单。
[0004] (1)国际专利申请公开案第W006/065350号（金佰利国际公司（Kimberly Clark Worldwide Inc.))
[0005] (2)欧洲专利申请案第0612850号（日本密理博株式会社（Nihon Millipore Kogyo KK))
[0006] (3)美国专利第5, 258, 285号（福斯电器控股公司（Foss Electric Holding AS))
[0007] (4)美国专利申请公开案第2008014607号
[0008] (5)国际专利申请公开案第W092/02632号（新锐尔公司（Sierra Cytometry))
[0009] (6)琼斯 D. L. (Jones，D. L.)，Μ· Α·布莱斯福德（M. A. Brailsford)和 J. -L.多克 特（J.-L. Drocourt).1999.固相激光扫描细胞术：用于计数制药用水中的微生物的新两 小时方法（Solid-phase，laser-scanning cytometry ：a new two-hour method for the enumeration of microorganisms in pharmaceutical water).药典论坛（Pharmacop. Forum)25 : 7626-7645
[0010] 背景抟术
[0011] 样品、尤其是液体样品中生物实体的定量测量对于测定污染和感染的程度、疾病 状态等极为重要。例如，在微生物学中是利用菌落形成单位（CFU/ml)来度量细菌或真菌数 量。
[0012] 尽管微生物包括孢子、无活性（不可培养）微生物和可繁殖微生物等形式，但仅定 量可繁殖微生物的方式具有重要意义。例如，在食品和饮料工业的质量控制过程、与消费者 接触的物品（例如医药品和个人护理品）的制造、水生系统（例如河流湖泊和海洋）的环 境保护、公共安全性（例如，城市供水系统；水井；例如水池温泉和海滩等娱乐用水的细菌 监测）各种工业生产过程、保健相关性感染和医疗护理规定中，可繁殖微生物的定量是一 个重要问题。
[0013] 分裂的（可培养）微生物的定量通常是基于细菌培养物生长的专业的实验室程 序。需要在较长的培育时间内维持使微生物在固体和液体培养基上生长的特定条件，并在 培育结束时，测定CFU (CFU/ml)。在实验室中，CFU通常是根据稀释次数和样品体积使计数 的菌落的总数量标准化来计算。这种方法需要实验室设备、有资质的工作人员以及可能持 续一天到一个月的较长的时间。尽管此方法涉及耗人力且耗时的工作，但CFU仍是目前管 理机构认可的进行微生物计数的标准。
[0014] 此项技术中提供了多种方法来检测测试样品中的微生物，作为细胞计数的替代方 法，这些方法中利用了颜色或荧光标记。
[0015] 例如，国际专利申请公开案第W006/065350号（金佰利国际公司（Kimberly Clark Worldwide Inc.))描述了一种半定量或定量检测所提供的样品中微生物的存在的方法。 此方法利用了一种测试染料，其在一种或一种以上微生物存在下会出现可检测的颜色改 变。例如，所述测试染料是一种会对微生物组分（例如细胞膜、细胞质等）与细胞外部的环 境之间的极性差异起反应的溶剂化变色染料（solvatochromic dye)(例如雷查特氏染料 (Reichardt' s dye))。
[0016] 欧洲专利第EP0612850号描述了一种测定样品溶液中活的微生物细胞的数量的 方法，其包含使样品溶液滤过具有疏水性的滤膜，以将微生物截留在疏水障壁内；向其中施 加 ATP提取剂的细雾以提取出微生物中的发光成分；向其中再施加针对所提取的发光成 分的液体发光诱导剂的细雾，以使所述成分发光；和使用能够测量发光量的构件，测量发光 量。
[0017] 美国专利第5, 258, 285号描述了一种测定包含细菌和体细胞的细胞群中细菌的 数量的方法。
[0018] 美国专利申请公开案第US2008/014607号描述了一种用于检测和计数液体样品 中可能存在的指定种类的活细胞的基于生物发光的方法，其包含测量指定的非病毒种类的 活细胞中以ATP形式表达的总游离细胞内腺嘌呤核苷酸（adenyl nucle〇tide，AN)的含量。
[0019] 国际专利申请公开案第W092/20263号描述了一种用于检测、鉴别和/或计数牛奶 中活细胞的方法，其中用荧光染料（例如酯酶依赖性染料、核酸结合性染料，和检测细胞内 氧化活性的染料）选择性标记活细胞，随后进行鉴别和/或计数。
[0020] 美国专利第7, 312, 073号描述了一种用于定量活细胞的方法，其中将并入标记物 的溶胶-凝胶液体前体贯穿固定于载玻片上作为薄层涂层。在培育期间，使所述载玻片与 含有从测试样品中分离的微生物的过滤器接触。在培育过程中，微生物将摄取一个或一个 以上标记物。随后照射载玻片，并检测由微生物中所含的标记物发射的信号，由此产生影像 以供微生物的检测计数。
[0021] 另外，用于计数制药用水中微生物的两小时方法描述于琼斯（Jones)等人（药典 论坛（Pharmacop. Forum) 1999, 25, 7626-7645))中。
【发明内容】
[0022] 本发明是基于细胞膜动力学的利用，根据细胞膜动力学，可培养（分裂的）细胞将 持续进行膜运输。本
【发明者】现设想，在可培养的微生物细胞中，细胞膜内化，与内部的膜隔 室融合，随后以比非分裂细胞高得多的速率再并入膜中。
[0023] 具体点说，本发明是基于以下发现：利用能够缔合膜并内化于微生物细胞的细胞 内隔室中的荧光染料对微生物细胞染色，使得所述染料在细胞内积累。此内化过程具有一 个特有的特征，即，在第一时间段T1后，积累达到平稳的平台期，并且在特有的第二时间段 T2中，积累量稳定保持此平台期。
[0024] 另外，本发明是基于以下发现：对于指定的微生物细胞类型或一组微生物细胞，第 一时间段T1与第二时间段T2是某一（某些）细胞类型所特有的。换句话说，对于指定的 细胞类型（或一组细胞），当在相同的预定条件下测量时，T1与T2将基本上保持恒定。
[0025] 因此，根据本发明的第一方面，本发明提供一种测定指示测试样品中可培养的微 生物细胞的数目的数量值的方法，所述方法包含：
[0026] (i)使容易携带可培养的微生物细胞的测试样品与至少一种能够缔合所述微生 物细胞的膜的信号发射剂接触，所述接触将持续预定的第一时间段（T1)，所述第一时间段 (T1)足以使所述信号发射剂内化于所述微生物细胞中，达到使得由所述样品发射的信号基 本上达到平台期的水平；
[0027] (ii)从所述测试样品中去除未内化的信号发射剂；
[0028] (iii)在所述第一时间段（T1)后，于第二时间段（T2)期间，且在此期间所述信号 基本上保持在所述平台期，由所述样品内信号发射物体检测发射信号的可培养细胞，所述 检测是基于针对所述可培养细胞而预定的选择参数；和
[0029] (iv)根据所述所选的信号发射物体，测定所述测试样品中指示可培养细胞的数目 的数量值。
[0030] 本发明也提供一种用于测定测试样品中等于可培养的微生物细胞数目的数量值 的试剂盒，所述试剂盒包含：
[0031] ⑴至少一种能够缔合微生物细胞的膜的信号发射剂，
[0032] (ii)有关使所述至少一种信号发射剂与所述样品接触达第一时间段（T1)的说 明，所述第一时间段（T1)足以使所述信号发射剂内化于所述微生物细胞中，达到使得由所 述样品发射的信号基本上达到平台期的水平；
[0033] (iii)有关从所述样品中去除未缔合的信号发射剂的说明；
[0034] (iv)有关由所述样品内信号发射物体检测和选择发射信号的可培养细胞的说明， 所述检测是基于针对所述可培养细胞而预定的选择参数，所述检测和选择是在所述T1后 于第二时间段（T2)期间进行，并且在此期间，所述信号基本上保持在所述平台期；
[0035] (v)有关使用所述所选的信号发射物体来测定测试样品中指示可培养细胞的数目 的数量值的说明。
[0036] 本发明还提供一种用于测定测试样品中指示可培养的微生物细胞的数目的数量 值的系统，所述系统包含：
[0037] (i)载体，其用于保存样品，并允许样品与一种或一种以上信号发射剂接触；
[0038] (ii)检测器，其用于检测样品内信号发射物体，并输出其对应的数据；
[0039] (iii)存储单元，其包含具有预定的选择参数和多个预定的标准化因子的数据库， 每一选择参数和每一标准化因子对于某一微生物细胞或对于某一组微生物细胞具有特异 性；
[0040] (iv)处理单元，其用于接收来自所述检测器的输出数据、来自所述存储单元的一 个或一个以上所述参数和所述标准化因子，并用所述参数和所述标准化因子处理所述输出 数据，以测定所述样品中指示所述可培养的微生物细胞的数目的数量值。
[0041] 本发明还提供一种机器可读的程序存储装置，其明确地实施可由所述机器执行的 指令程序，以执行用于测定测试样品中指示可培养的微生物细胞的数目的数量值的方法， 所述方法包含：
[0042] (i)使容易携带可培养的微生物细胞的所述测试样品与至少一种能够缔合所述微 生物细胞的膜的信号发射剂接触，所述接触将持续预定的第一时间段（τι)，所述第一时间 段（Τ1)足以使所述信号发射剂内化于所述微生物细胞中，达到使得由所述样品发射的信 号基本上达到平台期的水平；
[0043] (ii)从所述测试样品中去除未内化的信号发射剂；
[0044] (iii)在所述第一时间段（T1)后，于第二时间段（T2)期间，且在此期间所述信 号基本上保持在所述平台期，由所述样品内信号发射物体检测和选择发射信号的可培养细 胞，所述检测是基于针对所述可培养细胞而预定的选择参数；和
[0045] (iv)根据所述所选的信号发射物体，测定所述测试样品中指示可培养细胞的数目 的数量值。
[0046] 此外，也提供一种计算机程序，其包含当所述程序在计算机上运行时执行本发明 所有步骤的计算机程序代码构件，所述计算机程序是在程序存储装置中实施。
【专利附图】
【附图说明】
[0047] 为了解本发明并且看其实际上如何进行，现将仅通过非限制性实例，参考附图来 描述实施例。
[0048] 图1是展示作为样品的时间函数的荧光强度的图，所述样品包含来源于城市用水 的细菌细胞
【权利要求】
1. 一种用于测定样品中可培养的微生物细胞的数目的方法，所述方法包含： (i) 使所述样品与至少一种以一速率缔合微生物细胞的膜的信号发射剂接触，所述速 率针对可培养微生物细胞比针对活的非可培养微生物细胞或非活微生物细胞快，其中所述 接触将持续预定的第一时间段（T1)，在所述第一时间段（T1)所述微生物细胞内的所述信 号发射剂的量基本上达到平台期； (ii) 从所述样品中去除未缔合的信号发射剂； (iii) 在所述第一时间段（T1)后，于第二时间段（T2)期间，且在此期间来自所述微生 物细胞的所述信号基本上保持在所述平台期，检测可培养微生物细胞的数目，其中所述检 测针对各可培养的微生物细胞，各可培养的微生物细胞基于与所述细胞的膜缔合的所述信 号发射剂的信号水平而与活的非可培养微生物细胞或非活微生物细胞区分开；和 (iv) 根据所检测的可培养微生物细胞的数目，测定所述样品中可培养细胞的数目。
2. 根据权利要求1所述的方法，进一步包含使所述样品与第二信号发射剂接触，所述 第二信号发射剂与怀疑存在于所述样品中的所选微生物细胞特异性缔合。
3. 根据权利要求2所述的方法，其包含： 检测由如下所发射的信号： (i) 所述信号发射剂，其以一速率缔合微生物细胞膜，所述速率针对可培养微生物细胞 比针对活的非可培养微生物细胞或非活微生物细胞快，和 (ii) 所述第二信号发射剂，其与怀疑存在于所述样品中的所选微生物细胞特异性缔 合；以及 由此由所述信号测定所述样品中特定种类的可培养的微生物细胞的数目。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述可培养微生物细胞通过具有低于预定上限的 至少一信号强度和在预定物体尺寸范围内的尺寸而被检测。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述可培养微生物细胞通过具有在预定强度范围 内的信号强度和在预定物体尺寸范围内的尺寸而被检测。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中将所述样品中可培养微生物细胞的数目标准化以 与菌落形成单元（CFU)计数对应。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述标准化包含用可培养微生物细胞的数目乘以 预定的细胞特异性标准化因子。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述测试样本为液体、半液体以及干物质；以及所 述样品获自饮用水、食品、饮料、制药产品、个人护理产品、城市用水系统、井水、饮用水、废 水、天然水源、休闲水、土壤、血浆、唾液、尿液、喉咙样本、或胃肠液。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述可培养的微生物细胞选自细菌、霉菌、酵母、 原虫和藻类。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述细菌选自大肠菌类细菌（Coliforming bacteria)、肠细菌、沙门菌属（salmonella)、李斯特菌属（listeria)、志贺菌属 (shigella))、假单胞菌群（Pseudomonas group)、葡萄球菌群（Staphylococcus group)和 甲烷菌。
11. 根据权利要求9所述的方法，其中所述霉菌选自黑曲霉（Aspergillus niger)和青 霉菌群（peniciIlium group) 〇
12. 根据权利要求9所述的方法，其中所述酵母选自念珠菌群（Candida group)和 Sachramises group。
13. 根据权利要求9所述的方法，其中所述原虫选自隐孢子虫群（Cryptosporidium group)、贾地虫群（Giardia group)
14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述可培养的微生物细胞基于具有0. 8-2 μ m的 尺寸、60-254GL的强度、以及圆形、细长形或杆状的形态而被检测。
15. 根据权利要求1所述的方法，其中T1介于70和110秒之间。
16. 根据权利要求1所述的方法，其中T2为600秒。
17. 根据权利要求1所述的方法，其中所述样品中可培养微生物细胞发射的信号与有 活力但非可培养细胞发射的信号强了 1. 5至20倍。
18. 根据权利要求1所述的方法，其中所述荧光发射剂、磷光发射剂、化学发光发射剂 或包括结合于亲脂性连接子的荧光部分。
19. 根据权利要求2所述的方法，其中所述第二信号发射剂包括对细胞外的微生物细 胞组分、酶促实体、细胞特异性抗体、或噬菌体具有特异性的配体。
【文档编号】C12Q1/06GK104250661SQ201410283751
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2009年7月9日 优先权日:2008年7月10日
【发明者】弗拉迪米尔·格鲁克曼, 埃隆·卡普兰 申请人:塔康特精确有限公司