一种微生物复合菌剂及由其制备的土壤联合修复剂及二者的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种微生物复合菌剂，并涉及所述微生物复合菌剂与生物表面活性剂组成的联合修复剂，以及所述微生物复合菌剂和所述联合修复剂在修复石油污染土壤中的应用，属于石油污染土壤或含油污泥修复【技术领域】；所要解决的技术问题是提供一种能够有效降解石油污染土壤或含油污泥中的TPH污染物，尤其是正构烷烃、藿烷和芳香烃的微生物复合菌剂，同时提供该微生物复合菌剂与生物表面活性剂联合修复石油污染土壤的方法；基础技术方案为，包括铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌的微生物复合菌剂。
【专利说明】一种微生物复合菌剂及由其制备的土壤联合修复剂及二者的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物复合菌剂，并涉及所述微生物复合菌剂与生物表面活性剂组成的联合修复剂，以及所述微生物复合菌剂和所述联合修复剂在修复石油污染土壤中的应用，属于石油污染土壤或含油污泥修复【技术领域】。
【背景技术】
[0002]针对石油污染土壤修复技术的研究经历了一个较为漫长的探索和发展的过程，概况而言，既可以从环境治理方法上分为物理法、化学法和生物法三种，也可以从修复位置上分为原位修复和异位修复两种。任何修复技术都是基于当时存在的环境问题提出的，具备不容忽视的应用及参考价值。土壤气相抽提技术主要针对不饱和区的高挥发性污染物，如石油产品中的轻质烃、汽油等，而对于挥发性较差的柴油、燃料油和煤油等的去除率不高，更适合采用生物通风技术，对于较难去除的组分，需要采用外加氧化剂来提高去除率，对于高浓度石油污染土壤可以采用有机溶剂萃取法(OSE)回收绝大部分原油。从目前来看，生物修复技术尤其是微生物修复技术由于处理费用低、无二次污染和可原位处理等特点，被认为是针对油污土壤治理具有广阔应用前景的修复技术。
[0003]我国目前对石油污染土壤或油泥生物修复技术研究主要集中于高效降解菌株(群)的筛选及特性研究和生物修复实施方法的改进两个方面。污染土壤的石油组分复杂，单一的细菌或真菌产生酶的种类较少、浓度较低，一般只能降解少数特定烃类或者只降解到某一阶段，复杂烃类的彻底降解往往需要多种微生物协同作用。研究表明:加入复合降解菌能有效地强化生物修复速度和程度。
[0004]生物表面活性剂(b1surfactant, BS)是微生物在代谢过程中分泌出的具有一定表面活性的代谢产物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性类脂衍生物等。因其可增加疏水性有机物的溶解性，改变微生物细胞表面的疏水性，具有良好表面活性、低毒和易生物降解等优点，而在油污土壤生物修复应用中具有特殊的地位和重要性。因此利用复合微生物菌剂和生物表面活性剂进行油污土壤或油泥的修复是一种新型联合生物修复法，相对于单一修复法可有效提高生物修复控制技术的效率和实用性。
【发明内容】
[0005]本发明克服现有技术的不足，所要解决的技术问题是:
一、提供一种能够有效降解石油污染土壤或含油污泥中的TPH污染物，尤其是正构烷烃、藿烷和芳香烃的微生物复合菌剂；
二、提供该微生物复合菌剂与生物表面活性剂组成的土壤联合修复剂；
三、提供该微生物复合菌剂单独修复石油污染土壤和利用所述土壤联合修复剂修复石油污染土壤的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为:一种微生物复合菌剂，包括铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、鲁菲不动杆菌(Acinetobacterlwoffii )、绿胺假单胞菌(Pesudomonaspyocyaneum)、无色杆菌(Achromobacter )、门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)、热带假丝酵母菌(Candidatropicalis)和白色类诺卡氏菌(Nocard1idesalbus)。
[0007]作为优选，铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌的混合体积比为
1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1。
[0008]该菌剂为液态制剂，也可在冷冻干燥机中制成固态冻干白色粉剂。
[0009]同时提供了一种联合修复配方，具体为:一种土壤联合修复剂，由微生物复合菌剂以及生物表面活性剂组成，所述微生物复合菌剂含有铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌。其中铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌优选的混合体积比为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1，生物表面活性剂的纯度优选不低于85wt%。
[0010]所述微生物复合菌剂和生物表面活性剂的体积比为4-8:1。
[0011]本发明采用的生物表面活性剂优选鼠李糖脂(RL)。所述鼠李糖脂由铜绿假单胞菌发酵后用酸沉淀冷冻干燥法提取，其浓度优选85wt%以上，性状为棕黄色粘稠状膏体。
[0012]本发明所述的微生物复合菌剂和土壤联合修复剂均可以用于修复石油污染土壤或含油污泥，对土壤中的TPH污染物具有优良的降解作用，也适用于对正构烷烃、藿烷、芳香烃的降解。
[0013]本发明所述的微生物复合菌剂和土壤联合修复剂用于修复石油污染土壤时，土壤中的石油含量应不高于10wt%。
[0014]单独采用所述的微生物复合菌剂修复石油污染土壤的方法，包括如下步骤:
(1)将铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌八株菌分别复活、扩大培养后，混合备用；所述八株菌优选体积比按顺序为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1 ;
(2)将大块油泥破碎混匀后，按油泥中的原油质量的8-10wt%、l-3wt%分别添加尿素和磷酸二氢铵，混合均匀；
(3)次日在油泥中添加油泥体积4-6%的微生物复合菌剂，搅拌均匀，保持油泥中水量在30-35% ;每隔2天进行翻耕、使油泥通风，供应氧气，同时注意保持水分；
(4)每半个月，按照上述配比添加微生物复合菌剂；
每周快速检测TPH降解率、原油各组分及细菌、酵母菌数量，观察油泥颜色，直至油泥颜色接近正常土壤颜色，TPH含量达标；
采用所述的土壤联合修复剂修复石油污染土壤的方法，包括如下步骤:
(1)将铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌八株菌分别复活、扩大培养后，混合备用；所述八株菌优选体积比按顺序为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1 ;
(2)将铜绿假单胞菌发酵后用酸沉淀冷冻干燥法提取鼠李糖脂，其纯度在85wt%以上，备用;(3)将大块油泥破碎混匀后，按油泥中的原油质量的8-10wt%、l-3wt%分别添加尿素和磷酸二氢铵，按油泥体积的0.75-1%添加所述鼠李糖脂，混合均匀；所述鼠李糖脂添加方式优选稀释后添加；
(4)次日在油泥中添加油泥体积的4-6%的微生物复合菌剂，搅拌均匀，保持油泥中水量在30-35% ;每隔2天进行翻耕、使油泥通风，供应氧气，同时注意保持水分；
(5)每半个月，按照上述配比添加微生物复合菌剂；
每周快速检测TPH降解率、原油各组分及细菌、真菌数量，观察油泥颜色，及时调整营养元素含量，直至油泥颜色接近正常土壤颜色，TPH含量达标；
也可以分别按油泥体积的0.75-1%和4-6%分别量取鼠李糖脂和微生物复合菌剂，二者混合后，稀释，再按照步骤(4)的操作添加到油泥中。
[0015]本发明所述的微生物复合菌剂的菌株是以从陕西姬塬油田油污土壤附近被石油污染的土壤为样本，以石油为唯一碳源，通过富集培养和特殊培养基分离法，最终分离筛选出具有高效石油降解能力的菌株。通过生理生化初步鉴定以及分子鉴定归属于铜绿假单胞菌{Pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌iPseudomonasputida)、鲁菲不动杆菌iAcinetobacterlwoffii')、绿胺假单胞菌{Pesudomonaspyocyaneim)、无色杆菌(Achromobacter )、门多萨假单胞菌iPseudomonasmendocina )、热带假丝酵母菌iCandidatropicalis'^白色类诺卡氏菌{Nocard1idesalbus')。为方便表述，上述八种菌株按顺序依次简记为Xl、X2、Ql、Q2、S1、S2、Jl、J2，并根据生理生化初步鉴定将其分为4种属:其中Xl和X2为假单胞菌属，Ql和Q2为不动杆菌属，SI和S2为无色杆菌属，Jl和J2为真菌属。
[0016]从土壤中筛选分离所述微生物复合菌剂的培养液配方和扩大菌剂培养液配方，及菌种保藏条件。
[0017](I)菌株分离培养液:
①营养肉汁琼脂培养基，PH7.0，每升培养基含有如下质量的营养物质:
【权利要求】
1.一种微生物复合菌剂，其特征在于:包括铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌。
2.根据权利要求1所述的一种微生物复合菌剂，其特征在于:所述铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌的混合体积比为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1。
3.—种土壤联合修复剂，其特征在于:由微生物复合菌剂以及生物表面活性剂组成，所述微生物复合菌剂含有铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌。
4.根据权利要求3所述的一种土壤联合修复剂，其特征在于:所述微生物复合菌剂中的铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌的混合体积比为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1,所述生物表面活性剂的纯度不低于85wt% ;所述微生物复合菌剂和生物表面活性剂的体积比为4-8:1。
5.根据权利要求4所述的一种土壤联合修复剂，其特征在于:所述生物表面活性剂为鼠李糖脂。
6.权利要求1或2所述的微生物复合菌剂或权利要求3-5任一所述的土壤联合修复剂在修复石油污染土壤中的应用。
7.权利要求1或2所述的微生物复合菌剂或权利要求3-5任一所述的土壤联合修复剂在降解土壤中TPH污染物 的应用。
8.权利要求1或2所述的微生物复合菌剂或权利要求3-5任一所述的土壤联合修复剂在降解正构烷烃、藿烷、芳香烃中的应用。
9.根据权利要求6所述的微生物复合菌剂在修复石油污染土壤中的应用方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌八株菌分别复活、扩大培养后，混合备用； (2)将大块油泥破碎混匀后，按油泥中的原油质量的8-10wt%、l-3wt%分别添加尿素和磷酸二氢铵，混合均匀； (3)次日在油泥中添加油泥体积4-6%的微生物复合菌剂，搅拌均匀，保持油泥中水量在30-35% ;每隔2天进行翻耕、使油泥通风，供应氧气，同时注意保持水分； (4)每半个月，按照上述配比添加微生物复合菌剂； 每周快速检测TPH降解率、原油各组分及细菌、酵母菌数量，观察油泥颜色，直至油泥颜色接近正常土壤颜色，TPH含量达标； 步骤(1)所述八株菌优选体积比按顺序为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1,所述油泥即为石油污染土壤。
10.根据权利要求6所述的土壤联合修复剂在修复石油污染土壤中的应用方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌八株菌分别复活、扩大培养后，混合备用； (2)将铜绿假单胞菌发酵后用酸沉淀冷冻干燥法提取鼠李糖脂，其纯度在85wt%以上，备用; (3)将大块油泥破碎混匀后，按油泥中的原油质量的8-10wt%、l-3wt%分别添加尿素和磷酸二氢铵，按油泥体积的0.75-1%添加所述鼠李糖脂，混合均匀；所述鼠李糖脂添加方式优选稀释后添加； (4)次日在油泥中添加油泥体积的4-6%的微生物复合菌剂，搅拌均匀，保持油泥中水量在30-35% ;每隔2天进行翻耕、使油泥通风，供应氧气，同时注意保持水分； (5)每半个月，按照上述配比添加微生物复合菌剂； 每周快速检测TPH降解率、原油各组分及细菌、酵母菌数量，观察油泥颜色，直至油泥颜色接近正常土壤颜色，TPH含量达标； 步骤(1)所述八株菌优选体积比按顺序为1.5:1.5:1.5:1.5:1:1:1:1,所述油泥即为石油污染 土壤。
【文档编号】C12R1/01GK104031870SQ201410285790
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】陈丽华, 雒晓芳, 王冬梅, 徐红伟, 周立辉, 杨琴, 李海玲, 肖朝虎 申请人:西北民族大学