人源丁酰胆碱酯酶及其编码基因以及它们的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种丁酰胆碱酯酶的编码基因，其中，该基因具有如SEQ?ID?No：1所示的核苷酸序列，或者对SEQ?ID?No：1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加后仍能够编码且具有所述丁酰胆碱酯酶功能的核苷酸序列。本发明还提供了含有如上所述编码基因的重组载体和转基因细胞以及它们的应用。通过上述技术方案，将本发明的编码丁酰胆碱酯酶的基因优选在毕赤酵母细胞中进行表达，能够快速的进行丁酰胆碱酯酶的生产。另外，由于本发明只需要将以上含有所述丁酰胆碱酯酶基因的细胞进行培养，即可大量且高效的生产丁酰胆碱酯酶。并且通过实施例可以看出，通过本发明的方法制备的丁酰胆碱酯酶的活性最高可达0.6789pmol/mg·min。
【专利说明】人源丁酰胆碱酯酶及其编码基因以及它们的应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及一种人源丁酰胆碱酯酶的编码基因，含有所述编码基因的重组载体和 转基因细胞，以及由所述人源丁酰胆碱酯酶的编码基因编码的人源丁酰胆碱酯酶，另外，本 发明还涉及所述编码基因、所述重组载体、所述转基因细胞、所述人源丁酰胆碱酯酶在检测 有机磷和氨基甲酸酯类农药中的应用。 【背景技术】
[0002] 食品和农产品安全是关系到国计民生的全球性重大问题，其中农产品农药残留超 标的问题是社会关注的热点问题。有机磷和氨基甲酸酯类农药的高毒、高危性已被国家及 相关部门重点关注。我国已先后禁止了六六六、滴滴涕、毒杀芬、二溴氯丙烷、杀虫脒、二溴 乙烷、除草醚、艾氏齐?、狄氏齐?、汞制齐?、砷，铅类，敌枯双、氟乙酰胺、甘氟、毒鼠强、氟乙酸 钠、毒鼠硅、甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷、久效磷和磷胺共23种农药的使用。国家相关规定 指出蔬菜、果树、茶叶、中草药材上不得使用的高毒农药有：甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷、久 效磷、磷胺、甲拌磷、甲基异柳磷、特丁硫磷、甲基硫环磷、治螟磷、内吸磷、克百威、涕灭威、 灭线磷、硫环磷、蝇毒磷、地虫硫磷、氯唑磷、苯线磷，共19种。不难看出国家明令禁止使用 的农药中含磷农药占到5种，而在蔬菜、果树、茶叶、中草药材上被禁止使用的农药全部为 有机磷类和氨基甲酸酯类。但是在一些地区，高毒禁用农药仍在使用，不可避免地引起了农 药残留安全隐患。
[0003] 丁酰胆碱酯酶能够专一性的被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制，目前丁酰胆碱酯 酶抑制法被公认为是一种检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留最具操作性的方法。该检测 方法的核心成份是丁酰胆碱酯酶，方法的准确性与该酶的活性相关。
[0004] 目前这一检测方法主要存在以下两方面的问题，限制了这一技术的应用和推广。 一是从动物源血液和组织中提取酶的周期长、成本高，这样造成胆碱酯酶价格高，限制了其 使用。二是不同来源的丁酰胆碱酯酶敏感性不稳定，容易造成假阴性结果。
[0005] 因此，获得高活性、高产量、低成本的丁酰胆碱酯酶的方法成为运用丁酰胆碱酯酶 法检测蔬菜有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的快速检测和定量分析的关键。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了克服现有制备丁酰胆碱酯酶周期长、得率和活性低、且成本 高的缺陷，提供一种快速获得高活性、高产量、低成本的人源丁酰胆碱酯酶的方法。
[0007] 本发明的发明人发现，通过对原始人源丁酰胆碱酯酶的成熟肽部分的第185、357 和380位氨基酸进行取代，即在185位由半胱氨酸取代丝氨酸，在357位由缬氨酸取代苯丙 氨酸、在380位由天冬氨酸取代谷氨酰胺，然后通过对其编码基因的密码子进行优化及对 相应核苷酸密码子进行点突变来完成核苷酸序列的改造，从而得到本发明的如SEQ ID No: 1所示的核苷酸，能够有效地实现本发明的发明目的。
[0008] 基于此，本发明提供了一种人源丁酰胆碱酯酶的编码基因，其中，该基因具有如 SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者对SEQ ID No :1所示的核苷酸序列进行一个或多个 核苷酸的添加后仍能够编码且具有所述人源丁酰胆碱酯酶功能的核苷酸序列。
[0009] 优选地，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No : 1所示。
[〇〇1〇] 第二方面，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有如上所述的编码 基因。
[〇〇11] 第三方面，本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有如上所述的 编码基因或如上所述的重组载体。
[0012] 优选地，该重组载体包括诱导型启动子A0X1，以及位于启动子下游的编码α -因 子分泌信号肽的核苷酸序列。
[0013] 优选地，用于构建所述重组载体的载体为PPIC9K。
[0014] 第四方面，本发明还提供了如上所述的编码基因编码的人源丁酰胆碱酯酶。
[0015] 第五方面，本发明还提供了如上所述的编码基因、如上所述的重组载体、如上所述 的转基因细胞、如上所述的人源丁酰胆碱酯酶在检测有机磷和氨基甲酸酯农药中的应用。
[0016] 通过上述技术方案，将本发明编码的人源丁酰胆碱酯酶的基因优选在毕赤酵母细 胞中进行表达，能够快速的进行丁酰胆碱酯酶的生产。另外，由于本发明只需要将以上含有 所述丁酰胆碱酯酶的细胞进行培养，即可大量且高效的生产丁酰胆碱酯酶。此外，通过实 施例可以看出，通过本发明的方法制备的人源丁酰胆碱酯酶的活性最高可达〇.6789pmol/ mg · min〇
[0017] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。 【专利附图】
【附图说明】
[0018] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0019] 图1是实施例1. 2所得PCR产物（SEQ ID No :1所示的核苷酸）的琼脂糖电泳图， 其中，Μ为分子量标记（Marker)，泳道1、2同为SEQ ID No :1所示的核苷酸PCR扩增产物。
[0020] 图2是pPIC9K/H-Bche质粒载体经双酶切验证后的琼脂糖凝胶电泳图，其中，Μ为 Marker，泳道1、2同为是pPIC9K/H-Bche质粒载体经双酶切验证后的琼脂糖凝胶电泳图，其 中10000bp附近条带为酶切后的pPIC9K条带，2500bp以下位于约为1800bp处为双酶切后 的经密码子优化的H-Bche条带。 【具体实施方式】
[0021] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0022] 第一方面，本发明提供了一种人源丁酰胆碱酯酶（以下成为H-Bche)的编码基因， 其中，该基因具有如SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者对SEQ ID No :1所示的核苷酸序 列进行一个或多个核苷酸的添加后仍能够编码且具有H-Bche功能的核苷酸序列。
[0023] 本发明对如上所述的H-Bche的编码基因的获得方式并没有特别的限制，只要其 具备如SEQ ID No :1所述的序列即可，例如，可以通过人工合成的方法获得所述H-Bche的 编码基因。
[0024] 此处需要说明的是，在生物领域，虽然甚至是一个核苷酸的变化有时均会从本质 上影响其所述负载的基因的功能，但根据本发明的如上描述，本领域技术人员能够清楚，本 发明只保护经过一个或几个核苷酸的添加后仍能够编码且具有所述H-Bche功能的核苷酸 序列，对于不能够编码或编码后不具有所述H-Bche功能的核苷酸序列并不在本发明的保 护范围之内。并且，根据本领域技术人员所掌握的常规技术手段，其能够合理地预期添加何 种核苷酸序列能够使所述人源丁酰胆碱酯酶的编码基因仍然能够编码且具有所述H-Bche 功能。
[0025] 根据本发明，优选的情况下，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示。
[0026] 第二方面，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有如上所述的编码 基因。
[0027] 根据本发明，所述重组载体具体可以为重组表达载体。可以用现有的表达载体构 建含有所述编码基因的重组表达载体。为了增强目的基因的转录，在使用所述编码基因构 建重组表达载体时，可以在其转录起始密码子前添加任何一种本领域常规的增强型启动子 或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用。此外，为了进一步增强目的 基因的转录和/或翻译，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用转录增强子和/ 或翻译增强子。如上所述的增强型启动子、诱导型启动子、转录增强子、翻译增强子等均为 本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
[0028] 根据本发明，所述用于构建所述重组载体的"载体"可选用本领域已知的各种载 体，如市售的各种质粒。优选地，所述质粒能够使得构建的重组载体包括诱导型启动子 A0X1，以及位于启动子下游的编码α -因子分泌信号肽的核苷酸序列，优选地，所述载体为 PPIC9K 载体。
[0029] 根据本发明，为了便于目的蛋白的分离与纯化，在构建所述载体时，还可以加入表 达如表1所不的标签的核昔酸序列，在目的蛋白中，表1所不的标签连接在目的蛋白的氣基 末端或羧基末端。本发明优选加入组氨酸标签。
[0030] 表1标签的序列
[0031]
【权利要求】
1. 一种人源丁酰胆碱酯酶的编码基因，其特征在于，该基因具有如SEQ ID No :1所示 的核苷酸序列，或者对SEQ ID No :1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的添加后仍 能够编码且具有所述人源丁酰胆碱酯酶功能的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述的编码基因，其中，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示。
3. -种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求1或2所述的编码基因。
4. 根据权利要求3所述的重组载体，其中，该重组载体还包括诱导型启动子A0X1，以及 位于启动子下游的编码α-因子分泌信号肽的核苷酸序列，优选地，用于构建所述重组载 体的载体为PPIC9K。
5. -种转基因细胞，其特征在于，该转基因细胞含有权利要求1或2所述的编码基因或 权利要求4所述的重组载体，所述转基因细胞为真核细胞。
6. 根据权利要求5所述的转基因细胞，其中，该细胞为酵母细胞，优选为毕赤酵母细 胞，更优选为巴斯德毕赤酵母GS-115。
7. 权利要求1或2所述的编码基因编码的人源丁酰胆碱酯酶。
8. 权利要求1或2所述的编码基因、权利要求3或4所述的重组载体、权利要求5或6 所述的转基因细胞、权利要求7所述的人源丁酰胆碱酯酶在检测有机磷和氨基甲酸酯农药 中的应用。
【文档编号】C12N15/55GK104109680SQ201410350479
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】陈湘宁, 谢远红, 岳溪, 许丽, 田晶晶 申请人:北京农学院